重组腺相关病毒使用操作手册

百恩维生物科技有限公司 地址： 中国广东省深圳市南山区朗山路 19 号源政创新大楼 A栋 403 室 邮政编码： 518057 电话： + 86-755-26980323 传真：+ 86-755-26717881 网址：www.biowit.com 腺相关病毒使用操作手册 一、 腺相关病毒（rAAV）的储存与稀释： 1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内需使用腺相关病毒进行实验，可以将病毒 暂时放置于 4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜 封口） ① 病毒可以存放于-80℃ 6 个月以上；但如果病毒储存时间超过 6 个月，建议在使用 前重新滴定病毒滴度。 ② 反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度 10%；因此在病毒使用过程中 应尽量避免反复冻融，为避免反复冻融，建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。 2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细 胞用 PBS 或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。混匀分装后 4℃保存(请 尽量在三天内用完) 分装后使用。 二、 腺相关病毒用于体外（In Vitro）实验： 感染培养原代细胞和建系细胞。腺相关病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在 使用腺相关病毒之前可以通过查阅相关文献，了解腺相关病毒对您的目的细胞的亲嗜 性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文 献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用 24孔板检测病毒 对目的细胞的亲嗜性）。 腺相关病毒感染目的细胞预实验： 1. 腺相关病毒感染目的细胞预实验注意事项： ① 测定腺相关病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对腺相关病毒亲嗜性较高的 细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。 ② 在进行腺相关病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论 上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响腺相关病毒的感染效率。 ③ 一般腺相关病毒单位为 TU/ml，或 Vg/mL. TU/ml 即每毫升中含有具有生物活性的 病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有 1X108个具有 生物活性的腺相关病毒颗粒。Vg/mL 即每毫升中含有的病毒颗粒数，无论是否具有生 物活性，一般用定量 PCR测定。 2. 以 24 孔培养板为例，进行目的细胞和 HEK293T 细胞的感染预实验前按照不同的 MOI设置不同的感染孔，并根据 MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以 使用 PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。 ⑴ 第一天，准备细胞：在 24 孔培养板接种若干孔，每个孔内接种 3~5X104个目的细 胞，铺板时细胞的融合率为 50%左右，每孔培养基体积为 100 μl；进行病毒感染时细 胞的融合度约为 70%左右。 ⑵ 第二天，准备病毒：取出 4℃保存的病毒，使用台式离心机离心 20 秒（使病毒完 全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可 以根据 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 的实际情况将按照 MOI 准确计算好的腺相关病毒稀释到培养基中，并尽 可能保证所获得的含有腺相关病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感 百恩维生物科技有限公司 地址： 中国广东省深圳市南山区朗山路 19 号源政创新大楼 A栋 403 室 邮政编码： 518057 电话： + 86-755-26980323 传真：+ 86-755-26717881 网址：www.biowit.com 染效率。 ⑶ 第二天，感染目的细胞：病毒准备好之后，从培养箱中拿出细胞，首先观察细胞生 长状态，如细胞状态较好则可以开始实验。 ① 使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基。 ② 吸去培养器皿中的培养基（如果细胞生长良好，密度适宜，则不用换液）。 ③ 在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液。 ④ 混匀后放于二氧化碳培养箱（37℃、5% CO2）孵育过夜。 注意：感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，所以务必保证加病毒 之前细胞处于良好的生长状态。亦可以将预先准备好的培养基和腺相关病毒的混合液 直接加入培养器皿中。腺相关病毒对目的细胞的感染效率较低，通过提高 MOI 值可以 提高病毒的感染效率，但是当 MOI高于 20时，我们建议在培养基中加入 polybrene（8 μg/ml左右）来提高病毒的感染效率。 ⑷ 第三天，更换培养液：一般在 24 小时候后将含有腺相关病毒的培养液更换成正常 培养液；在感染后观察细胞状态，如果腺相关病毒对细胞有明显毒性作用而影响细胞 生长状态，可以最短在加病毒 4小时候更换新鲜培养液后继续培养（建议在 8-12小时 更换为宜）。第一次换液后，如果腺相关病毒对细胞没有明显毒性作用，按照正常培养 条件培养换液。 ⑸ 第六天，感染效率检测：在倒置荧光显微镜观察荧光，估计腺相关病毒感染目的细 胞的效率；如果由于目的基因较大而造成选择的载体不能携带 Marker Gene的，可以 通过 Real-time PCR 检测目的基因的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达来评估感染效率。 注意： 1. 有些腺相关病毒载体上带有 GFP 绿色荧光蛋白，使用者可以在病毒感染 48小时后 用倒置荧光显微镜观察 GFP 绿色荧光，以观察病毒对目的细胞的感染情况。如果腺相 关病毒载体携带其他 Marker Gene 如 RFP\BFP 可以用荧光显微镜在对应的激发光波 长下观察荧光表达的情况。 2. 腺相关病毒表达时间较慢，荧光表达所需时间较长，建议感染后 48 小时后观测荧 光表达。感染后的细胞可以连续培养一周，通过观察荧光的表达时间和表达强度来确 定腺相关病毒对目的细胞的感染情况。感染期间请根据细胞生长的情况对细胞进行及 时换液，以保证细胞良好的生长状态。 三、 腺相关病毒安全使用规范： 腺相关病毒载体源于非致病的野生型腺相关病毒，但使用时仍请参照如下所示进 行实验： 1．病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通超净工作台操作病毒，请不要打开 排风机。 2．病毒操作时请穿实验服，带口罩和手套。 3．操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有病毒污染，请 立即用 70%乙醇加 1% SDS 溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培 养液请于 84 消毒液或 1% SDS 中浸泡过夜后弃去。 4．用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板。用 70% 乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前，用 70%乙醇清 理显微镜实验台。 5．如需要离心，应使用密封性好的离心管，或者用封口膜封口后离心，而且尽量使用 百恩维生物科技有限公司 地址： 中国广东省深圳市南山区朗山路 19 号源政创新大楼 A栋 403 室 邮政编码： 518057 电话： + 86-755-26980323 传真：+ 86-755-26717881 网址：www.biowit.com 组织培养室内的离心机。 6．脱掉手套后，用肥皂和水清洗双手。 四、相关专业术语： MOI：病毒感染复数传统的 MOI 概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义 是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌 体的数量单位为 pfu。一般认为MOI 是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是 pfu number/cell。后来 MOI 被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒 与细胞数量的比值，本手册中提到的 MOI都是沿用这个概念。然而，由于病毒的数 量单位有不同的表示方式，从而使 MOI 产生了不同的含义。能产生细胞裂解效应的 病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用 pfu表示病毒数量，因此其 MOI 的含义与传统 的概念相同。 五、 细胞培养器皿的相关参数： Flask/Dish Surface (mm2) Cell number Media Volume 96 well plate 50 1.5-5.0×104 100 μl 48 well plate 100 3.0×104-1.0×105 200 μl 24 well plate 200 8.0×104-2.0×105 500 μl 12 well plate 401 1.6-4.0×105 1.0 ml 6 well plate 962 3.0-8.0×105 2.0 ml 35mm 962 3.0-8.0×105 2.0 ml 60mm 2827 1.0-2.5×106 6.0 ml 100mm 7854 2.5-6.4×106 10.0 ml