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蛋白质分离提纯.doc

蛋白质分离提纯

始终不可取代
2017-12-03 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《蛋白质分离提纯doc》,可适用于高等教育领域

蛋白质分离提纯印迹杂交技术从最开始的细菌原位杂交到Southern印迹杂交再到Northern印迹杂交最后发展产生了Western印迹杂交也就是我们常说的蛋白质印迹杂交技术。它们几种杂交技术所采用的具体的试剂不同但是原理上大致都是相同的都是利用标记的物质作为探针与待测物质进行特异性的结合来进行检测。Western印迹杂交技术主要是为了检测某种蛋白质是否表达以及表达量的上调或者下调变化。WesternBlot在设计和选用试剂时要考虑到很多因素包括分子量标准、内参、膜、转膜和封闭、抗体的选用以及显色物的选择。蛋白Marker是要是用来指示蛋白条带所对应的分子量大小只有标准量精确无误了实验结果才有说服力除此之外蛋白标准还有表示转移成功或者蛋白在凝胶上的电泳程度等等的作用所以选择正确的蛋白Marker也是Wb实验成功的必要条件之一。预混分子量标准:高分子量标准、低分子量标准、宽分子量标准预染分子量标准:单色预染、多色预染修饰分子量标准:糖基化、磷酸化、荧光标记蛋白质进行电泳分离后转移到固定膜上膜的选择也会对蛋白质的检测效果产生影响。膜选择标准膜与目的蛋白分子的结合能力(也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量)以及膜的孔径(也就是拦截蛋白的大小)不影响后续的显色检测(也就是适和用于所选的显色方法信噪比好)后继实验有其他要求比如要做蛋白测序或者质谱分析还要根据不同目的来挑选不同的转移膜常用的膜有硝酸纤维素膜(NC膜)、价格便宜简单快速封闭与非特异性抗体结二氟化树脂膜(PVDF膜)灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高尼龙膜:对核酸和蛋白质有很强的结合能力能代替NC膜用于分子印迹和杂交实验。抗体的选择Western技术里面可以只用一种抗体但是会造成免疫反应性降低无信号二级放大抗体标记费时昂贵,使用不方便。利用两种抗体的话一抗用来与蛋白质结合二抗结合一些免疫荧光物质或者酶来进行检测。这种方法优点就是免疫特异性不受标记影响信号放大灵敏度高(多个二抗结合位点)多种标记的二抗可供选择而且还可以可选择不同的Marker。猪囊尾蚴病俗称囊虫病是猪带绦虫的蚴虫即猪囊尾蚴(Cysticercuscellulosae)寄生人体各组织所致的疾病。因误食猪带绦虫卵而感染也可因体内有猪带绦虫寄生而自身感染。根据囊尾蚴寄生部位的不同临床上分为脑囊尾蚴病、眼囊尾蚴病、皮肌型囊尾蚴病等其中以寄生在脑组织者最严重等电聚焦在凝胶中加入一种两性电解质载体从而使凝胶在电场中形成连续的pH梯度。蛋白质是典型的两性电解质分子它在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向电场的正极移动在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。这种泳动只有在等于等电点的pH环境中才停止。如果在一种pH梯度的环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳那么在电场作用下不管这一群混杂的蛋白质分子原始分布如何各蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度相对应的位置进行聚集经过一定时间后不同的蛋白质组分便分割在不同的区域之中。这个过程称作等电聚焦蛋白质聚集的部位蛋白质所带电荷为零测定此部位的pH值即可知该蛋白质的等电点。制备原则:尽可能多地提取出总蛋白质尽可能简单的操作步骤注意防止样品提取过程中的各种化学修饰去除样品中核酸、盐离子等干扰物质增加样品溶解性变性剂:通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展将其疏水中心完全暴露降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性剂:经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂TritonX和NP、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB最好。还原剂:在变性剂和表面活性剂联用条件下加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或巯基乙醇以及不带电荷的三丁基膦(TBP)进行还原。等电聚焦通过V高压使得蛋白质按照其等电点特性进行聚焦步骤:胶条水化、低压除盐、高压聚焦、低压维持聚焦时间:聚焦时间太短会导致水平和垂直条纹过长会造成蛋白图谱变性在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据蛋白样品类型、蛋白载样量、PH范围和胶条长度来确定。蛋白质检测:硝酸银染色:优点:灵敏度高缺点:重复性差质谱兼容性低考马斯亮兰染色:优点:重复性好质谱兼容性高缺点:灵敏度低荧光染色:优点:重复性好质谱兼容性高、灵敏度高缺点:价格贵其它染色方法:胺基黑染色、印度墨水染色、金属盐负染等图形分析常用软件:ImageMaster(GEHealthcare)PDquest(BioRad)分析步骤:胶点检测和定量、凝胶匹配、比较分析

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