重组大肠杆菌高密度发酵研究进展

!生塑王垂垂壁!!!!!!∑生：垫!盟!：； 重组大肠杆菌高密度发酵研究进展 李 民 陈常庆 (中国科学院上海生物工程研究中心，上海200233) 摘要重组大肠杆茵的高密度发酵是提高基因工程产品产量的一个非常有效的手段，是现代发酵 工程研究的一个热点。本文就高密度发酵中影响重组大肠杆茼发酵产率的几个因素，包括宿主 茸、培养基、培养条件、补料方法以厦高密度发酵过程中存在的问题和对策加以讨论，着重探讨了 高密度下大肠杆茵产生的有害代谢副产物——乙酸的产生机制、抑制作用机理，以厦控制乙酸积 累的技术方法。 关键词 重组大肠杆菌 高密度发酵补料分批培养比生产率 乙酸 重组DNA技术和大规模培养技术的有机结合， 使得原来无法大量获得的天然蛋白特别是基因工程 药物能够大量生产，应用于临床的基因工程药物的市 场正以每年5—15％的速度增长_1J，预测到2003年世 界药品市场的总销售额约为2500亿美元，基因工程 重组蛋白类药品的总销售额至少可占10％ⅡJ。 大肠杆菌在重组蛋白质生产的过程中占主导地 位。采用高密度培养技术(H逅hcell一densityculture， HcDc)，也就是高密度发酵技术，提高菌体的发酵 密度，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间 内产物的产量)不仅可减少培养体积、强化下游分离 提取，还可以缩短生产周期、减少设备投资从而降低 生产成本，能极大地提高在市场上的竞争力。 这一目的的实现，除了重组菌本身的表达性质 外．还必须赋予重组菌生长和产物表达的最适环境 条件，包括适宜的培养基组成、合适的培养温度、 pH、稳定的比生长速率、适宜的溶解氧以及营养物 的合理流加等。我们实验室采用该技术，大大推动 了重组人肿瘤坏死因子(TNh)，白细胞介素一3(IL一 3)，骨形成蛋白一2A(BMP一2A)，降钙素的下游研究。 l影响高密度发酵的几个表观因素 1．1高密度发酵培养基 培养基的组成成分可分为合成培养基、半合成 培养基和复合培养基。其组成元素包括c、H、O、 N、s、P、Fe、Mg、K等，根据在基本培养基中的菌体 生长量可以推导出每种元素获得19／L的大肠杆菌 菌体所需的无机盐(L_1)：0．779NH4c1，O．1259 KH2P04，17．5mgMgS04’7H20，7．5mgK2S04， 0．64mgFeS04‘7H20，O．4mgCack¨。。 26 大肠杆菌高密度发酵使用的培养基一般为半合 成培养基，培养基各组分的浓度和比例要恰当，过量 的营养物质反而会抑制菌体的生长，特别是碳源和 氮源的比例，如果碳氮比偏小，会导致菌体生长旺 盛，造成菌体提前衰老自溶；碳氮比过大，菌体繁殖 数量少，细菌代谢不平衡不利于产物的积累；碳氮比 较合适，但碳源、氮源浓度高，虽然发酵起始导致菌 体的大量繁殖，但发酵后期菌体生长缓慢，代谢废物 过多，增大发酵黏度，影响溶解氧浓度，容易引起菌 体的代谢异常，影响产物合成；碳氮比较合适，但浓 度过低，会影响菌体的繁殖。这就能解释为什么单 纯靠增加营养物质并不能实现高密度。一般而言， 大肠杆菌培养时营养的抑制浓度为：葡萄糖(509／ L)、氨(39／L)、Fe2+(1．159／L)、Mgz+(8．79／I．)、 P04卜(109／L)、zn"(O．0389／L)"1。 如果培养基仅仅适合宿主菌的生长对工程菌高 密度发酵而言远远不够，利用合成培养基可以很容 易使菌体达到高密度，但往往会发生外源基因不表 达的现象。Allen和Luli_5o曾用合成培养基培养重 组大肠杆菌，菌体在很短时间(13h)达到了79z (Dcw)／L，但外源基因没有表达。Jun一“等改变生 长阶段的C／N比例，对INF—B表达影响不大，而改 变诱导后补料中c／N比，则会显著影响外源基因的 表达效率。Tsai等⋯还发现，在IL-2发酵时，在台 成培养基中加入亮氨酸会使甲硫氨酸被亮氨酸错误 取代的几率从19％降至2％。 1．2表达基因的调控 重组菌的表达调控方式对发酵过程有重要的影 响，高密度发酵也必须据此而采取相应的控制，遵循 外源基因的表达规律和诱导后细菌的生长规律才有 万方数据 可能达到高密度、高表达发酵。适合作为Ec02i外 源基因表达的启动子有^噬菌体启动子PI、PR、tac、 trp、lpp、1ac启动子，还有一种表达方式，就是组成型 表达，无任何诱导剂。从简化发酵过程操作的观点 看，组成型表达系统最为简便和经济，但过早的表达 产物往往会对细胞有毒害作用，使宿主菌特有的比 生长速率下降，甚至会使细胞死亡，因而工程菌发酵 大多还是采用可诱导的启动子，对于这种工程菌一 般采用两阶段培养法，即菌体积累阶段和产物表达 阶段。BMP一2A_⋯、IL2⋯采用温度诱导型表达体 系，重组蛋白在3—4h内达到最大表达量(BMP， 2．789／L；IL2，1．029几)，菌体也基本停止生长，而 利用tac启动子在IPTG诱导8—10h菌体还在生 长[1⋯，故化学诱导的重组菌高密度发酵比温度诱导 型的要容易一些。 1．3宿主菌 大肠杆菌的不同种和亚种对外源基因的表达产 物会产生一定的影响。表达产物在大肠杆菌体内有 三条路径可走，第一，形成稳定的天然构象，可溶且 有活性，不易被降解；第二，蛋白也是可溶性的，但构 象为非天然状态，易被胞内的各种蛋白酶识别降解； 第三，多肽链间彼此聚集形成不可溶的包涵体，并且 有蛋白酶抗性。因此不同的菌种所含有的宿主蛋白 酶种类和数量不i司，对表达的产物会有降解作用。 相同培养条件下选用E∞晶DHl比利用YK537和 KS476表达pr。apoA—I的水平高出2—3倍，发酵密 度也高20％一100％110j。Luli等111o研究了不同宿 主菌在补料分批培养中生物量的积累，E．删i JMl05和E．∞ziB具有产酸少(29／L)，发酵密度高 (309几)的特点，而MCl060发酵密度仅有109 (DCw)／L。walle等128。对两种常用商业宿主菌E． ∞ziBL21(DE3)和jMl09进行了乙酸代谢研究，发 现前者的乙酸积累仅是后者的1／4，发酵密度也提 高25％。因此在高密度发酵优化时要考虑宿主菌 的因素，选取最合适的表达宿主菌。 1．4质粒的拷贝数及稳定性 质粒的拷贝数首先取决于自身的遗传特性Ⅲ。， 同时还受到宿主菌生理状况及生长环境的影响。一 般外源基因的表达量随拷贝数的增加而提高，但拷 贝数足够大时这种关系就不明显了”⋯。细胞的生 理条件会影响质粒的拷贝数，EngberR和Nord— st。m¨41发现生长速率增大．质粒的拷贝数下降，认 为高比生长速率下，质粒的复制速率跟不上细胞的 分裂的速率；JonesLl“研究了营养限制连续培养中 营养对拷贝数的影响，连续培养8天，质粒(pBR322 和pMB9)没有丢失，但拷贝数下降了4—5倍，说明 营养的限制和缺乏会引起质粒的拷贝数下降。工程 菌的质粒分配不稳定和结构不稳定都将导致高密度 发酵的失败。 2重组大肠杆菌高密度培养 在排除所有发酵条件限制的情况下，Riesen— berg【41从理论上计算大肠杆菌发酵所能达到的最高 菌体密度为4009(Dcw)／L，而Markl等l“o则认为 最高的发酵密度为2009(DCw)几，此时发酵液的 25％充满了长3pm，宽1“m的大肠杆菌；发酵液黏 度很高，几乎丧失流动性。迄今为止，非重组E． ∞矗w3110l川和生产聚．3一羟基丁酸【”]的重组菌为 最高密度的两例，密度分别为：1749(Dcw)儿和 175．4R(Dcw)／L。表1收集了部分重组菌的高密 度发酵。 表l重组大肠杆菌的高密度发酵[1 万方数据 万方数据 万方数据 菌而得到较高的密度。 (6)限制性流加葡萄糖 利用葡萄糖为碳源培养重组大肠杆菌时要控制 其浓度在较低的范围内，减少乙酸的生成。目前大 多数高密度发酵均采取了限制性流加葡萄糖的方 法。利用发酵反馈的参数，如pH，I的，p，ouR， cER作为控制对象，和葡萄糖流加相关联，控制流 加量，使培养基中葡萄糖浓度限定在较低的水平。 除直接检测控制葡萄糖浓度外，还有以下几种方法。 A，恒pH值法06，”o 大肠杆菌代谢葡萄糖产生的有机酸将导致pH 的降低，因此pH的下降在一定程度上反映了菌体 消耗葡萄糖的快慢，故可以通过pH变化控制、调节 补糖速率。该方法的缺点是pH变化不完全是葡萄 糖代谢的结果，容易造成补料体系的错误。 B，恒溶解氧法【27-圳 在菌体利用营养物生长代谢时，会消耗氧气，反 应出溶液中溶解氧的下降，并且溶解氧下降的快慢 间接反映了细菌生长的旺盛程度。当葡萄糖浓度降 低到一定程度使菌体代谢强度下降，消耗氧气的能 力降低，反映出溶解氧的上升，因此根据溶解氧曲线 补加葡萄糖，保持溶解氧恒定，可以使葡萄糖浓度控 制在较低的水平。 C，平衡Do—stat法【8’341 发酵过程溶解氧水平和糖流加速率对重组菌的 糖酵解过程和代谢物氧化过程之间的平衡有很大的 影响。缺氧将迫使糖代谢进入酵解途径，补糖速率 过快也会使糖酵解速度和代谢氧化速率之间的平衡 破坏，当碳源的供给超过其氧化容量时，将迫使葡萄 糖酵解产生部分中间产物，在有氧情况下产生有机 酸。Doqat通过控制溶解氧防止氧气缺乏下产生 有机酸，但是DO-stat无法阻止有氧情况下的“葡萄 糖效应”。平衡Do《at是在恒定DO法的基础上， 通过溶解氧、搅拌转速、通气和补糖速率的综合控 制，使葡萄糖浓度和乙酸浓度维持在低水平，实现高 密度发酵。 5影响高密度发酵的其它因素 除了以上这些方面外，在重组大肠杆菌高密度 培养过程中，要达到重组产物的最大比生产率，还要 考虑合适的诱导时间和诱导强度。李民等”1在利 用温度诱导型的重组质粒生产BMP一2A时，细菌对 数中期诱导比后期诱导产率提高32％。Shimizu 等¨51同样认为在细菌生长对数中期加入诱导物 30 IPTG比在后期诱导重组蛋白的生产率要高，但诱 导物的浓度在0．02mM一2mM之间对产物表达没 有影响。 6发展与展望 随着发酵控制手段的进一步发展，监控的发酵 参数越来越详细，就越能对细菌代谢过程真实地了 解和掌握。目前所采用的发酵装置一般能够在线检 测或控制物理参数(转速、温度、压力、体积、流量 等)、物理化学参数(pH值，溶解氧、c02尾气分析、 氧化还原电位、气相分析)、化学测量(基质侑萄糖 浓度、产物／乙酸等)、生物学和生化测量(呼吸熵、生 物量、酶活、细胞形态等)，这些测量可提供反映环境 变化和细胞生长的许多重要信息，作为研究和控制 发酵过程的基础，但这些还远远不能反映细菌的动 态代谢过程，因此高密度发酵的发展趋势是重组菌 代谢理论更完善；检测和调控手段更完备；发酵设备 更加自动化；发酵放大工艺更完善。 总之，基因工程产品在化工、食品、环保、医药等 方面越来越表现出极大的潜在能力，重组大肠杆菌 高密度发酵技术是基因工程技术从实验室通向市场 的桥梁，对工程菌生理、代谢规律和高密度培养的了 解和掌握将在这方面有着重要的意义。 参考文献 [1]Lee，sY，T181、EcH，1996，14：98105 [2]吴梧桐．丁镑申，刘景晶，基因工程药物，人民卫生出版社， 1996 [3]Redir曙HE，LaundH，andFiech睫rA，JBlotech．1985，2 (3)：19l一206 [4]RiesenbergD，currOplⅡB10technd，1991，2：380—384 [5]AllenB。柚dL曲Gw，BIophannManⅡ，1987，l：38—41 [6]Jur嘻G，DenefleP，B啦qI埔n』．eta【'．AnnInmPameurMl_ crobio．1988．139：129—146 [7]TsalLB，MannM，Mo—sFeta1．JIndMmbio，1987，2： 181一187 [8]李民，陈常庆，朴勤等，生物工程学报，1998，14(3)：270— 275 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