重组巴氏毕赤酵母高密度发酵表达rHSA

42 卷 　1 期 2002 年 2 月 微 生 物 学 报 Acta Microbiologica Sinica Vol. 42 February 　 No. 1 2002 3 国家自然科学基金资助项目 (29976013)和教育部高等学校骨干教师资助计划资助项目33联系人 ,E2mail :SiliangZ @163. net 作者简介 :郭美锦 (1969 - ) ,男 ,博士研究生 ,江西省吉安市青源区人 ,研究方向为发酵过程参数 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 与控制。 收稿日期 :2001201202 ,修回日期 :2001205218 重组巴氏毕赤酵母高密度发酵 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达 r HSA 3 郭美锦1 　庄英萍1 　储 　炬1 　张嗣良133 　刘志敏2 (1 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室　上海　200237) (2 军事医学科学院生物工程研究所　北京　100071) 摘 　要 :对基因工程菌 Pichia pastoris 的摇瓶发酵条件进行了试验 ,并根据摇瓶发酵的优化结 果进行了补料分批高密度发酵。在摇瓶发酵时 ,甲醇诱导基因工程菌 P. pastoris 表达重组人 血清白蛋白的发酵周期为 96h ;甲醇的最佳诱导浓度为 10gΠL ;发酵 pH 范围为 5172～6159 ;在 摇瓶培养时 ,随着接种量的增加 ,虽然目的蛋白表达量缓慢增加 ,但单位细胞光密度的蛋白产 率却明显下降 ,符合 y = 121941x - 015059方程 (线性相关系数 r = 019789) ,其限制性因子很可能为 溶氧。在分批发酵 ,接种量为 10 %且种子细胞光密度 (OD600 ) 为 20 左右时 ,细胞生长的延迟 期为 2111h 左右 ,细胞生长光密度与培养时间的关系模型为 :y = 017841e0. 2319t (线性相关系数 r = 0. 9936) ;在补料发酵时细胞干重浓度可达到 115gΠL —160gΠL ,在 120h 重组人血清白蛋白表 达量最大达到 316gΠL。 关键词 : 重组巴斯德毕赤酵母 , 高密度发酵 , 重组人血清白蛋白 中图分类号 :Q93919 　　文献标识码 :A 　　文章编号 :000126209 (2002) 0120062207 　　人血清白蛋白 (Human Serum Albumin ,HSA)是血浆中含量最高的蛋白质 ,含 17 对二硫 键 ,由 585 个氨基酸组成分子量为 67kD 的蛋白质 ,主要起维持血液的正常渗透压和输送 亲水分子的作用 ,用于治疗大量失血、烧伤、休克、水肿及低蛋白血症等[1 ] 。临床上人血清 白蛋白主要是从血液中通过分级过滤得到 ,这样得到的人血清白蛋白十分昂贵 ;同时 ,血 液本身也有问题 ,例如 ,其中可能携带肝炎病毒、爱兹病毒等。为了解决这个问题 ,随着基 因重组技术的发展和完善 ,许多科学家已把人血清白蛋白 cDNA 克隆到各种宿主细胞 ,如 B . subtilis [2 ] 、S . cerevisiae [3 ] 、动物细胞[4 ]和植物细胞[5 ]等 ,但由于细菌的后加工 ,如糖基化、 外源蛋白分泌表达等不够理想等[6 ]和转基因动、植物细胞的表达水平和技术对工业化仍 存在很多问题[7 ] ,因此很多研究者较主张采用真核细胞如酵母来表达重组人血清白蛋白 (rHSA) 。在酵宿主菌中甲醇营养型毕赤酵母 (Methylotrophic Pichia pastoris)具有表达量高、 外源蛋白分泌性好、外源基因遗传性稳定等优点。RCTech 公司用 P. pastoris 发酵单罐最 高表达 rHSA 水平达 3139gΠL[8 ] ,最近杨晟等报道 rHSA 发酵水平为 110gΠL[9 ] 。我们根据人 血清白蛋白的基因组成和毕赤酵母的偏爱密码子合成了 HSA cDNA 并重组到毕赤酵母染 色体上 (另文报道) ,同时对基因工程菌毕赤酵母高密度发酵表达重组人血清白蛋白的工 艺优化进行了研究 ,在 15L 多参数全自动发酵上高密度发酵 ,连续四批细胞光密度 ( OD600 )达 500 以上 ,重组人血清白蛋白表达量达 316gΠL 左右 ,现报道试验结果。 1 　材料和方法 111 　材料 11111　菌种 :巴氏毕赤酵母 ( Pichia pastoris ) GS115 HSA21 菌株 (Mut + his + , PAOX1 ,载体 pPIC9K,蛋白信号肽序列为来自酿酒酵母的α2杂交因子 AMF ,外源基因为人血清白蛋白 cDNA ,载体呈线型整合在染色体上) ,由上海贸基生物技术研究中心构建。 11112 　培养基 :平板培养基为 YPD 培养基[10 ] ;种子培养基改良 BMGY非诱导培养基[11 ] ; 分批发酵培养基是用 FM21 基础盐配成含甘油 6 % ( wΠv) 和 4mLΠL PTM1 微量元素溶 液[10 ] ;补料生长培养基为 50 %甘油 ( WΠV ,含 12mLΠL PTM1) 补料液 ;发酵诱导培养基为 100 %甲醇 (含 12mLΠL PTM1)诱导液。 112 　方法 11211 　摇瓶发酵方法 :从平板上挑单菌落 ,接入到摇瓶生长培养基 (20mLΠ250mL 三角瓶) 中 ,30 ℃,220rΠmin 培养 20～24h , OD600约 20 左右。离心摇瓶生长培养基 ,弃去上清液 ,按 摇瓶生长培养基体积与摇瓶诱导培养基体积之比为 1∶1 ,接入摇瓶诱导培养基 (20mLΠ 250mL 三角瓶) ,30 ℃,220rΠmin 培养 96～120h。每 24h 补加 100 %甲醇 (A. R) 至一定终浓 度。放瓶离心后 ,取上清液进行分析。 11212 　补料高密度发酵方法 :从新鲜 YPD 平板上挑一单菌落到种子培养基中 ,30 ℃,220rΠ min 培养 20～25h 后 ,按 10 %接种量接入到装 6L 分批发酵培养基的 15L 发酵罐中进行分 批培养 (用氨水调 pH至 515 左右) ,当碳源甘油耗尽后 ,溶氧 (Dissolved oxygen ,DO) 陡然上 升 ,开始流加补料生长培养基 (流加速率维持溶氧大于 20 %) 。当细胞光密度 ( OD600 ) 为 500～700 时停止补料 ,甘油耗尽后补入发酵诱导培养基进行诱导表达培养 (pH 用 25 % NH3·H2O 控制为 517～710) ,通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧大于 20 % ,并使发酵液中甲醇浓度小于 10gΠL ,诱导发酵 100h 左右。FMG215L 全自动发酵罐为 华东理工大学国家生化工程技术研究中心 (上海)提供。 11213 　pH :pH电极在线检测并采用 PID 闭环控制方式控制 ( GIO80pH 电极为华东理工大 学国家生化工程技术中心研制) 。 11214 　溶氧 (Dissolved Oxygen ,DO) :溶氧电极在线检测 (瑞士 Ingold 公司产品 CD951206) 。 11215 　尾气分析 :排气O2 为热磁氧分析仪 (Magnos 4G)在线检测 ;排气 CO2 采用不分光红 外仪 (Uras 3G)在线检测 (德国 H&B 公司和重庆川仪九厂合资生产 ,精度 0102 %) ;单位发 酵液体积细胞耗氧速率 (Oxygen Uptake Rate ,OUR ,mmol·L - 1·h - 1 ) 和单位发酵液体积细胞 二氧化碳释放速率 (CO2 Evolution Rate ,CER ,mmol·L - 1·h - 1 )按文献[12 ]计算。 11216 　甘油浓度分析 :采用高碘酸钠氧化滴定法[13 ] 。 11217 　细胞光密度 ( OD600 ) 分析 :菌液稀释后于波长 600nm 处以去离子水为对照进行比 色测定 OD600 = OD 读数 ×稀释倍数。 11218 　甲醇浓度分析 :气相色谱 ( GC)分析[14 ] 。 11219 　rHSA 分析 :按文献[15 ]SDS2PAGE凝胶电泳 ,然后电泳胶经计算机扫描根据电泳带 染色强度进行定量分析 ( GIS21000 数码凝胶图像分析系统 ,210 版本 ,按说明书操作 ,背景 36　1 期 郭美锦等 :重组巴氏毕赤酵母高密度发酵表达 rHSA 消除按自动进行 ,低分子 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 蛋白为上海丽珠东风生物技术有限公司产品) 。 2 　结果 211 　基因工程菌 P . pastoris 甲醇诱导培养表达 r HSA 按摇瓶培养方法对基因工程菌毕赤酵母 ( P. pastoris)用 5gΠL 甲醇浓度诱导培养 120h , 每 24h 取二个发酵瓶进行分析 ,结果见表 1 (表中数据为 2 个发酵瓶平均值) 。 表 1 　重组毕赤酵母诱导培养过程表达 rHSA 结果 Table 1 　rHSA expression in recombinant P. pastoris at shake flask cultivation TimeΠh Broth volumeΠmL pH Cell optical densityΠOD600 rHSA conentrationΠ(mgΠL) 0 20. 0 6. 07 21. 5 0 24 18. 0 6. 7 27. 0 35 48 17. 5 6. 84 27. 74 120 72 17. 5 6. 68 29. 84 175 96 17. 0 6. 68 34. 85 296 120 15. 5 6. 69 37. 98 283 在 120h 的甲醇诱导培养过程中 ,诱导培养前 48h 时 pH 逐渐上升至 6184 ,46h 后 pH 一直较平稳 ,保持在 617 左右。在整个培养过程中 ,甲醇诱导培养 24h 内 ,细胞生长较快 , 此后细胞光密度基本不变 (除摇瓶体积风干因素外) ;当诱导培养至 96h ,基因工程菌毕赤 酵母的 rHSA 逐渐上升 ,最大蛋白表达量为 296mgΠL ,继续培养至 120h 时 ,则蛋白表达量下 降 ,约为 283mgΠL ,并体积较少。因此 ,在甲醇诱导培养基因工程菌 ( P. pastoris 表达重组人 血清白蛋白时的最佳放瓶时间为 96h。 212 　甲醇浓度对基因工程菌 P . pastoris 表达 r HSA的影响 按摇瓶培养方法每 24h 分别补加甲醇使其在培养基中浓度为 5、10、20、30、40、50gΠL , 诱导培养 96h ,结果见表 2 (表中数据为 2 个发酵瓶平均值) 。 表 2 　甲醇浓度对重组 P. pastoris 表达 r HSA影响结果 Table 2 　Effects of methanol concentration on rHSA expression in recombinant P. pastoris Methanol concentrationΠ(gΠL) pH Cell optical densityΠOD600 rHSA concentrationΠ(mgΠL) Residual conc. of methanolΠ(gΠL) 5 6. 59 29 295. 84 0. 5 10 6. 45 40 365. 46 5. 8 20 6. 43 37. 5 237. 95 11. 5 30 6. 50 32. 5 137. 02 15. 0 40 6. 51 28. 75 123. 29 15. 8 50 6. 53 23. 5 106. 33 17. 7 在甲醇浓度为 10gΠL 时毕赤酵母表达目的蛋白量达到最高 ,这可能是当甲醇浓度小 于 10gΠL ,甲醇成为限制性底物 ,限制了蛋白的表达 ;当浓度高于 20gΠL 时 ,甲醇浓度过高 , 对目的蛋白的表达也有抑制作用。因此 ,在摇瓶条件下 ,甲醇的最佳诱导浓度为 10gΠL。 213 　pH对基因工程菌 P . pastoris 表达 r HSA的影响 按摇瓶培养方法把菌种接至用 012molΠL 的磷酸缓冲液配制好的摇瓶诱导培养基中 , 46 微 　　生 　　物 　　学 　　报 42 卷 　 pH分别为 5143、5172、5184、5198、6129、6159 和 7105 ,每 24h 加甲醇至终浓度 10gΠL 进行诱 导培养。 图 1 　pH对细胞生长和蛋白表达的影响 Fig. 1 　Effects of pH on cell optical density and rHSA concentration 　 由基因工程菌 P. pastoris 表达目的蛋白 和细胞光密度曲线 (图 1) 可以看出 ,pH 为 5184 时目的蛋白表达量最高。pH 为 5143 时 ,目的蛋白基本没有表达 ,但细胞光密度极 大 ,说明在低 pH 值条件下 ,适合细胞生长而 不适合目的的蛋白表达 ;当 pH 值在 5172 — 7100 时 ,细胞光密度基本相同 ,而目的蛋白表 达量基本是呈逐渐下降的趋势 ,pH 为 7105 时 ,目的蛋白表达量明显下降。因此 ,既利于 P. pastoris 细胞生长又利于目的蛋白高表达 的 pH范围为 5172～6159。 214 　接种量对基因工程菌 P . pastoris 表达 r HSAs 的影响 按摇瓶培养方法培养细胞 ,根据摇瓶生长培养基体积与摇瓶诱导培养基体积之比分 别为 0125∶1 ,015∶1 ,1∶1 ,115∶1 ,2∶1 ,215∶1 离心摇瓶生长培养基中菌体 ,弃去上清液 ,分别 接入摇瓶诱导培养基中 ,培养 96h (每 24h 补加甲醇终浓度为 10gΠL) 。 接种量的增加 ,细胞光密度 ( OD600end ) 呈上升的趋势 ,但细胞光密增率 ( OD600endΠ OD600ini)却呈下降趋势 (表 3) ,通过对放瓶细胞光密度与接种初始细胞密度的比值 ( OD600endΠOD600ini )与接种量进行最小二乘法线性回归 ,得到它们的关系为幂函数 ,方程为 : y = 12. 941x - 0. 5059 　　　(线性相关系数 R = 0. 9789) (1)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 其中 :x —接种量 ( OD600ini ) 　　y —细胞光密度增长倍数 ( OD600endΠOD600ini ) 随着接种量的增加 ,目的蛋白表达量缓慢增加 ,但是单位细胞光密度的蛋白产率却明 显下降 ,尤其当接种细胞光密度 ( OD600ini )为 5～30 时 ,单位菌体细胞光密度的蛋白表达产 率几乎呈直线下降。从甲醇残浓度 (表 3)和 NH2 —N 浓度 (数据未列)可知 :虽然接种量增 加 ,但碳、氮源并没有明显受限制 ,由此推测摇瓶培养时限制性因子很可能为溶氧 ,这是 P. pastoris 高密度发酵的主要限制因素之一。 表 3 　接种量对基因工程菌 P. pastoris 表达 rHSA 影响结果 Table 3 　Effects of seed volume on rHSA expression in recombinant P. pastoris Initial cell optical densityΠOD600ini pH Cell optical densityafter cultureΠOD600end rHSA conc.Π(mgΠL) ProductivityΠ(mgΠOD600) OD600endΠOD600ini Residual conc.of methanolΠ(gΠL) 5 6. 60 31. 2 278. 1 8. 913 6. 24 6. 33 10 6. 61 38. 8 299. 4 7. 716 3. 88 6. 06 20 6. 65 49. 7 285. 6 5. 746 2. 48 5. 49 30 6. 7 65. 7 292. 6 4. 453 2. 19 4. 09 40 6. 63 89. 1 338. 9 3. 804 2. 23 3. 43 50 6. 67 93. 2 364. 2 3. 907 1. 86 2. 95 　　Note : Experimental treatment was 2. 56　1 期 郭美锦等 :重组巴氏毕赤酵母高密度发酵表达 rHSA 215 　基因工程菌 P . pastoris 高密度发酵 以摇瓶表达 rHSA 的优化结果 ,进行补料分批高密度发酵。 21511 　分批发酵基因工程菌 P. pastoris 细胞生长模型 :在 15L 发酵罐上进行分批培养 ,通 过对细胞光密度的对数 (lnOD600 )与分批发酵时间 (t)进行线性回归 ,得 : ln ( OD600 ) = 012489t - 015252 (2)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 当 ln ( OD600 ) = 0 时 ,t = 2111 ,即接种量为 10 %种子且细胞光密度 ( OD600 ) 为 20 左右 时 ,细胞生长的延迟期为 2111h 左右。这可能是由于摇瓶种子培养基比发酵罐培养基营 养物质更为丰富 ,引起细胞初接入发酵罐时出现了一段时间的适应期。分批培养 22h 后 , 细胞光密度 ( OD600达到 133 ,由于 1 OD600 = 01229gDCWΠL [16 ] ,经计算分批发酵阶段底物甘油 细胞得率系数 ( YxΠs )为 0150gΠg ,与恒化培养结果相吻合[16 ] 。 假设接种后细胞生长密度与时间的关系符合指数生长模型 : y = aebx (3)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 通过对式 3 变形得 :lny = lna + bx (4)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 再把 lny 对 x 进行线性回归 ,得到式 3 的参数 ,即细胞生长光密度与培养时间的关系 模型为 :y = 017841e0. 2319t (5)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 其中 :y 为细胞光密度 ,t 为培养时间 ,线性相关系数 r = 019936。 重组 P. pastoris 分批发酵时细胞生长及其指数模拟曲线如图 2 所示。 图 2 　重组 P. pastoris 分批发酵时细胞生长 及其指数模拟曲线 Fig. 2 　Curves for cell optical density and its simulative line during recombinant P. pastoris batch fermentation 因此 ,当碳、氮、氧源供应充足时 ,可以按 指数方程 (5) 来进行指数流加模式补料 ,达到 高密度发酵的目的 ,这也是细菌、酵母高密度 发酵的三大策略之一[17 ,18 ] 。但在实际实验中 , 往往供氧是一个限制性因子 ,尤其是高密度发 酵。在细胞生长的高密度发酵后期 ,补料需根 据发酵罐的供氧能力 (如氧传递速率 (OTR) ) 和细胞的耗氧能力 (如氧耗速率 (OUR) ) 等来 进行操作。 21512 　补料高密度发酵表达 rHSA 结果 : 22h 分批发酵结束后 ,开始流加补料发酵培养基 , 通过控制流加速率 ,以控制溶氧浓度 (DO) 在 20 %以上 ,在较短时间内获得最大细胞光密 度。在 46h 左右细胞光密度 ( OD600 )达到 600 ,基本达到高密度发酵的目的 ,停止流加补料 发酵培养基 ,当溶氧陡然上升达到 70 %以上时 (1min 左右) ,开始流加诱导表达培养基以 启动 PAOX1表达目的蛋白。在表达外源蛋白阶段 ,控制诱导表达培养基的补料速率 ,以维 持溶氧浓度在 20 %以上。在补加甲醇之前 (46h 之前) ,重组人血清白蛋白含量几乎为零 , 开始补加后 ,重组人血清白蛋白浓度迅速升高 ,在发酵 120h rHSA 表达量最大达到 316gΠ L ,以后目的蛋白量基本保持不变 (图 3 ,4) 。 66 微 　　生 　　物 　　学 　　报 42 卷 　 图 3 　重组 P. pastoris 补料分批发酵时细胞 生长及蛋白表达曲线图 Fig. 3 　Curves for cell optical density and rHSA expression in recombinant P. pastoris cultivation 图 4 　r HSA电泳分析 Fig. 4 　rHSA SDS2PAGE analysis 　　1. Marker ; 2. 120h sampler ; 3. 104h sampler ; 　　4. 88h sampler ; 5. 72h sampler ; 6. 56h sampler ; 　　7. 46h sampler (20μL per well) . 3 　讨论 高密度发酵是基因工程菌提高外源蛋白表达量的重要策略之一。山根恒夫[18 ] 认为 酵母细胞在发酵液中理论最大的密度为 280gDCWΠL (Dry Cell Weight ,DCW) ,在工业发酵时 细胞浓度达到 30gΠL 则认为是高密度发酵 ,目前发酵过程中一般认为酵母细胞密度为 100 ～200gDCWΠL 则为高密度发酵。在 15L 多参数全自动发酵罐上进行了连续四批发酵毕赤 酵母的细胞光密度均可达到 500 —700 ,即细胞干重浓度可达到 115～160gΠL ,达到了高密 度发酵的目的 ,并且重组人血清白蛋白的表达量达到 316gΠL ,而 PCTech 公司用 P. pastoris 发酵单罐最高表达 rHSA 水平达 3139gΠL[8 ] , Kaoru 等报道 rHSA 的稳定表达水平为 114gΠ L [20 ] ,其诱导表达周期很长 ,一般均达到 8～10d ,蛋白产率并不高。杨晟等报道 rHSA 发酵 水平为 110gΠL [9 ] ,其主要是基因构建水平通过改变分泌信号肽 ,采用酿酒酵母 AMF 前导 肽比人血清白蛋白自身的天然前导肽按 Invitrogen fermentation guideline 进行发酵表达量要 提高 10 %。通过对在 15L 多参数全自动发酵罐的发酵过程参数相关分析 ,我们观察到在 分批发酵阶段 ,当细胞的比生长速率 (μ) 逐渐增大时 ,细胞代谢的呼吸商 ( RQ) 由 015 到 0175 逐渐增大 ,经过恒化培养试验证实这是细胞代谢甘油基质时随着细胞比生长速率的 增大代谢流发生了迁移变化所致 ,而当甘油基质耗尽后 ,氧消耗速率 (OUR) 和二氧化碳释 放速率 (CER)立刻下降 ,RQ 则迅速上升至 018 以上 ,氨水的消耗速率立即为零。在甲醇 诱导基因工程菌 P. pastoris 表达 rHSA 阶段 , OUR 和 CER 通常较平稳 ,约为 120～ 160mmoLΠ(L·h) ,RQ 维持在 016～017 ,当甲醇浓度不足时 ,RQ 明显大于 018 ,此阶段的蛋 白表达调控机理正在进一步研究 ,有关 Pichia pastoris 发酵时最大 OUR 和 CER 的变化范 围和呼吸商 (RQ)的变化规律未见报道。 致谢 　98 级生化工程专业硕士生吴康华同学 ,96 级生物工程专业本科生胡光星同学参与 部分试验工作 ,特此致谢 ! 76　1 期 郭美锦等 :重组巴氏毕赤酵母高密度发酵表达 rHSA 参 考 文 献 [ 1 ] 　Goodey A R ,Park M ,Sleep D , et al . 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It showed that the cultural period induced with 5gΠL methanol is 96h ,optimum methanol concentration is 10gΠL , and pH range is 5. 72～6. 59 in shake2flask culture. Although the seed inoculum amount increased , the target protein productivity per cell optical density was decreased. Their relationship fit the equeation Y= 12. 941x - 0. 5059 (r = 0. 9789 ,where x is inoculating OD600 ,Y is protein productivity per cell optical density) ,we postulated that the restricting factor may be dissolved oxygen (DO) at shake2flask culture. With the 10 % inoculum and 20 OD600 of seed ,the lag phase of cell growth is 2111h in batch cultivation ,and the relationship between cell optical density ( Y) and culture time (t) is Y= 0. 7841e0. 2319t (r = 0. 9936) ; The cell dry weight of broth reached 115～160gΠL and the maximum rHSA concentration was 3. 6gΠL at the 120th at the fed2batch fermentation phase. Key words : Genetically engineered Pichia pastoris , High2density fermentation , rHSA3 Granted by national natural science foundation (29970163) and by college backbone teacher plan of Education ministry33 Corresponding auther 86 微 　　生 　　物 　　学 　　报 42 卷