朱爱萍 王英霞 张晋华 � �� 新技术 应用技术研究
� 应用技术研究
�� � 新 杖 术
山西医学院第二附属医院
朱爱萍 王英霞 张晋华
摘 要
关键词
�� � 是多聚酶链 式反应 , 是 一种无 细胞分
子克隆法 , 是近 年发展起来的一种快 速的
特定 � � � 片段体外扩增法 。 本文书 讨论
�� � 试荆 、设备以及 �� � 最佳条件 。
�� � 分子克隆 条件 应 用
� 材料与方法
� � � 试剂与设备
� � �� � 模板� � � � 直接用作�� �
� � � � � � � � � 反转录酶 �� � � ,
�� �� � � � � 聚合酶 ,
�� �� � 引物 �� 、 �, 端各 � 个
�� �� � 缓冲液 �� �� �一�� ��凝胶
�� �� � �� � ��� �� � ���种脱氧核昔酸�
�� �� � 电泳仪 、基因扩增仪 、� � � 合成仪 。
�� � 方法
�� �� � 以一段 � � � 为模板 �在 �� 、 �� 末端人工合成两个
引物�� 、�� , � � � 序列为已知 , 备用。
�� �� � �� ℃条件下,使模板 � � � 的双链分解为两条单链 ,
这个过程称为高温变性 。
�� �� � 合成引物后 , 引物和模板� � � 根据碱基互补原则
配对 , 这个过程为退火 , 温度为 �� ℃一 �� ℃ 。
�� �� � 在 � �� 聚合酶作用下合成延伸, 延伸方向都是从
� , 端到 �� 端 , 此过程为中温延伸, 温度为 �� ℃� �� ℃ �
�� �� � 模板� � � 经高温变性 , 低温退火 ,中温延伸�个阶
段的循环后 , 每循环� 次, 模板�� � 的拷贝数加倍 , 经 � 次
循环后形成特定的� �� 片段 , � � � 扩增为 �� 倍 。
�� �� � 产物经琼脂糖凝胶电泳 , � � � 序列分析后就可确
定待检的 � � � 序列 。
� ��� 最佳条件
�� � 模板量
��� 可检测到单拷贝基因, 整个基因组中有 �个拷贝
就可作出。 为得到满意结果 , 一般选 �� , � �。, 扩增 � � � 模
板 , 人为 �� , 病毒为 �� 。
�� � 引物
所有引物都需经过高压液相色谱纯化。 引物
设计
领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计
原则
为�
�� �� � 引物长度����一 ��� � , � 一�含量�� �� � �� 。
�� �� � 解链温度� � 一 ��� � � �丰 ��� � � � 。
�� �� � �种碱基要随机分布 , 不要出现 �个以上连续同样
的碱基。
�� �� � 弓�物之间及引物内部不要出现互补序列, 尤其 �‘末
端 , 以防止引物二聚体的存在 。 � 对引物间不可以有同源的
连续的 � 个碱基。
�� �� � 引物 �‘末端是 � �� 延伸的开始 , 不许有任何修
饰 �
�� �� � 引物的 �‘端只决定�� � 产物的长度 ,可加修饰 。
�� �� 了 密码子的简并, �‘末端终止时 , 尽量不要终止在密
码子第 �位上。
�� �� � 引物的特异性 , 一般不要让引物和所有已知其它序
列有 �� �以上同源 , 否则会减少非特异性条带。
�� � � � � � 最佳浓度
� � � 斗的活性与�� � 酶活性成正 比, � � � �浓度随底
物、引物不同而不同 , � � � 十浓度不适会出现许多非特异性
条带, 一般� � 十十浓度约为 � � � �� �� �
� ��� 应用
�� � 用于基因诊断
由于各种疾病的基因结构不同 ,各种疾病的�� � 序列
不同 ,凝胶电泳产生的条带不同。 因此 ,所有已知序列的病
原体、微生物都是 �� � 诊断对象 , 如艾滋病 、肝炎、结核 、肿
瘤、遗传性疾病等。
�� � 遗传学分析
利用人的基因多肤性及所在位置 、出现次数的不同 , 得
到基因扩增片段不同进行比较可进行亲子鉴定, 家系分析 。
�� � 突变位点分析
�� 产物变性后 , 由于单链 � � � 构象不同 , 经过非变
性的聚丙烯酞胺凝胶电泳后 ,迁移率不同 , 可检测到从几百
到上千个 �� � 片段中的一个位点的突变 �
用变性剂梯度 ,温度梯度凝胶电泳优� � �� � � � 可检测到双链 � � � 中基因有无突变 。
�责任编辑 姚 真�
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