土壤DNA提取试剂盒柱式(精品资料)
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土壤DNA提取试剂盒-柱式
Column Soil DNAout
货号: M090066
产品及特点
本产品是整合本公司土壤DNAOUT(CAT:M090065)和柱式腐殖酸清除剂(CAT:M090147)两个产品而得的柱式升级产品。它结合了两者的优点,专门用于从各种土壤样品和河海沉积物中提取高质量的DNA的试剂。跟土壤DNAOUT相比它具有下列特点: 1. 去污染效果更好,得到的DNA可以直接作为PCR
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或酶切,不需要再进行去腐殖
酸处理。
2. 操作过程更加简单快速,整个操作只需要10多分钟,扩容性好。
3. 产量高,每克土壤一般可以提取到5-50 ug DNA,片段长度在20-50 Kb,OD260/280一
般都在1.8以上。
4. 适合于各种土壤(包括河海沉积物)。
规格及成分
成 份 50次包装
溶液A 25 mL
溶液B 25 mL
溶液C 40 mL
离心吸附柱 50套
通用洗柱液 50 mL
通用洗脱液 5 mL
使用手册 1份
运输及保存
常温运输,4?保存,保存期为一年。
注意:本制品仅供研究使用,请勿用于临床治疗等其他用途
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使用方法
1. 65?预热溶液A,待其沉淀溶化后充分混匀,取0.5 mL加入到1.5 mL塑料离心管中并
放置于65?待用。
2. 称取0.1-0.3 g的土壤,加入到含预热溶液A的离心管中,震荡器上剧烈震荡5-10分钟。
如果是扩量操作,可以使用更多土壤和较大离心管。也可以将同一种土壤在较大离心管
中震荡处理,然后再分到1.5 mL离心管中。注意:不论使用大的还是小的离心管,一定
要让管底的土壤震荡起来。
3. 将离心管置于65?水浴中保温至少5分钟。
4. 12000-15000 g室温离心3分钟,将上清转移到一新离心管中(上清液一般呈淡黄色或深
棕色,实际颜色取决于腐殖酸的含量,上清液的体积一般为300-400 µL)。 5. 在上清液中加入等体积的溶液B,上下颠倒30秒充分混匀,溶液将呈白色或淡黄色混
浊状。
6. 将离心管冰浴至少5分钟。
7. 12000-15000 g室温离心3分钟,转移上清到新的1.5 mL离心管中,上清液颜色将比第
4步得到的上清的颜色稍淡,体积在0.7 mL左右。
注意:下面第8-第9步的氯仿抽提操作可以省略,直接进入第10步,但DNA的产量会低50%左右,OD260/280在1.7-1.8。如果直接进入第10步,则转移的溶液体积不要超过0.6 mL,否则没有空间加溶液C。
8. 加入0.2 mL的氯仿(自备),震荡器上充分振荡30秒混匀。注意:一定要让管底的溶液震
荡起来。
9. 12000-15000 g室温离心3分钟,小心转移上清到新离心管中。说明:离心后两相交界
面将有白色膜状物,其中有机相部分颜色较深,一般呈淡棕色。上清的颜色取决于土壤
中腐殖酸的含量。将上清转移到新的1.5 mL离心管时,不要超过0.6 mL,否则没有空
间加溶液C。如果有多余的可以弃之不用。
10. 加入1.5倍体积的溶液C,上下颠倒30秒混匀。
11. 分两次上柱(即先转移一半的混合液到离心吸附柱中,12000-15000 g室温离心半分钟,
弃穿透液,然后再将剩下的混合液到离心吸附柱中,12000-15000 g室温离心半分钟,注意:本制品仅供研究使用,请勿用于临床治疗等其他用途
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弃穿透液)。
12. 加0.7 mL通用洗柱液到离心吸附柱中,12000-15000 g室温离心半分钟,弃穿透液。 13. 如果有必要,可以再加0.3 mL通用洗柱液到离心吸附柱中,12000-15000 g室温离心半
分钟,弃穿透液。增加一步洗涤能使最后得到的DNA的纯度稍有提高,但产量稍微有
所降低。
14. 12000-15000 g室温再离心半分钟。此步十分重要,否则残留的通用洗柱液会污染DNA。 15. 将离心吸附柱转移到一新的1.5 mL塑料离心管中,加入50-100 uL 通用洗脱液。 16. 室温放置离心吸附柱1-2分钟。
17. 12000-15000 g室温离心半分钟,离心管中溶液即为DNA样品,可以立即使用或存放于
冰箱待用。
疑难解答
Q: 如何判断提取的,,,没有腐植酸污染,
A:方法一是目测法,即看得到的溶液是否无色。如果呈淡棕黑色或淡黄色,说明可能是少
量残留的未除尽的腐植酸。方法二是检测最大光吸收。注意:有腐植酸污染并不表示DNA
不能使用,有的腐殖酸并不抑制PCR扩增。
Q: 腐殖酸的最大吸收波长是多少,
A:腐植酸(humic acid)是一大类呈棕黑色或黑色的物质,其结构千差万别,土壤中腐殖
酸的组成和特点随土壤不同而不同,所以其最大吸收波长也各不相同,有的土壤的腐殖
酸在260 nm有最大吸收(见Appl.Environ. Microbiol., 63:4993,1997),有的则在340 nm。
所以用特定的波长测定OD值时波长的选定要根据土壤而决定。Sigma, Fluke等公司出售
的腐植酸产品成分一般比较简单,其最大吸收波长不能推广到成分更为复杂的土壤腐殖
酸样品。
Q: 是否腐植酸都会抑制后续的DNA反应,
A:否,因为腐植酸是一大类物质的统称,他们的结构和特性各不相同,所以是否对后续反
应有影响最好通过实验来验证。如果用提取的DNA溶液原液进行反应而反应没发生,
而对照样品(已知的不含污染的DNA)能够发生,说明可能抑制作用。 Q:如果得到的DNA样品还是含有抑制后续反应的腐植酸,如何去除, 注意:本制品仅供研究使用,请勿用于临床治疗等其他用途
技术咨询电话:400-607-9999
A:如果提取的DNA原液不能扩增,可以将样品稀释10倍和100倍再进行PCR,抑制作用一般可以解除。如果仍然抑制,可以使用天净沙的PCR Inhibitor Erasol(CAT#:M020007)。如果仍然不能解除,则可以通过柱式腐殖酸清除剂(CAT#:M090147)或先电泳,再用超大片段胶回收试剂Magic Gel DNABACK(CAT#:M060022)纯化土壤DNA,去除残留抑制剂。其中后两方法最有效,得到的原液一般可以直接扩增。
Q:在用土壤DNA进行细菌专一性PCR时,为何没加DNA模版的阴性对照有扩增产物出
现,
A:这是由于使用的Taq DNA聚合酶一般从E.coli表达菌株中提取,提取过程中污染了E.coli的基因组DNA,而使用的广谱细菌专一性引物可以识别所有细菌DNA基因组DNA模版,所以会产生扩增。建议使用高质量的Taq DNA聚合酶。
注意:本制品仅供研究使用,请勿用于临床治疗等其他用途