应用ATR_FTIR研究二种皮肤渗透促进剂的作用机理

应用ATR_FTIR研究二种皮肤渗透促进剂的作用机理 生物物理学报 第十六卷 第一期 二 ???年三月 ACTA BIO P HYS ICA S I NICA Vol . 16 No . 1 Ma r . 2000 应用 A T R - FTI R 研究二种皮肤渗透促进剂的作用机理 丁帄田 , 郝劲松 , 郑俊民 ( )沈阳药科大学药学系 , 沈阳 110015 摘 要 () 应用衰减全反射傅立叶红外光谱 A T R - F T I R为检测手段 , 通过测定人体在体皮肤表面不 同深度角质层的 C H2 - 收缩振动峰的波数位移和角质层中脂质的分布 , 来考察二种常用皮肤渗透 () () 促进剂油酸 OA 和月桂氮卓酮 Azo ne 对角质层固有脂质的影响 。以探索渗透促进剂在人体皮肤 νν角质层中的作用机理 。二种渗透促进剂均使得a s C H2 - 和s C H2 - 发生蓝移 , 但 Azo ne 的作用更 强 。OA 和 Azo ne 对皮肤角质层深部的脂质含量无明显影响 。由于角质层最外层吸附了一定量的 OA ,致使皮肤最外层的脂质含量的升高 。Azo ne 同样也只是吸附在角质层外层 ,并未大量进入角质 层深部 。就 C H2 - 收缩振动峰的波数位移而言 ,OA 和 Azo ne 均与人体整个角质层中细胞间的脂质 发生作用 ,使得脂质侧链的无序性变大 ,导致了流动性的增大 ,进而减少了药物透皮吸收的阻力 。 艹卓 关键词 : 油酸 ;月桂氮酮 ;衰减全反射傅立叶红外光谱 ;角质层 ( ) 文章编号 : 1000 - 6737 200001 - 0048 - 05 中图分类号 : Q 735 文献标识码 :A 人体角质层是药物透皮吸收的主要屏障 。为了提高药物的透皮吸收的量 ,往往要借助于各 1 - 4 () 种渗透促进剂 促渗剂。因此促渗剂的作用机理成为研究领域的一个热点。 红外技术的 ( ) 发展 , 特别是衰减全反射傅立叶红外光谱 A T R - F T IR 的出现使得在体研 究人体皮肤角质层的结构 、促渗剂与角质层细胞的相互作用 ,以揭示各种促渗剂的作用机理成 为可能 。在 A T R - F T IR 中 ,只需将被测样品与 A T R 附件相接触就可以测定 。由于这一技术 无需制样 ,不具破坏性 ,在研究样品表面性质方面显示出独特的应用价值。 A T R - F T IR 用于 人体在体皮肤角质层的研究 ,国内未见论文的发表 。 本文应用 A T R - F T IR 测定皮肤表面不同深度角质层的 C H- 伸缩振动峰的波数位移 2 艹 ( ) ( ) 以及脂质的相对含量 ,来考察油酸 OA和月桂氮酮 Azo ne 对角质层脂质的作用 。 卓 1 药品与试剂 () () () Azo ne 药用, 广州市化学助试剂厂 ; OA 分析纯, 沈阳市试剂三厂 ; 丙二醇 分析纯, 沈阳市试剂三厂 ;压敏胶带 ,自制 。 2 实验方法 2. 1 ATR - FTI R 实验条件 () ( ) 室温 : 18 - 20 ?; R H : 39 % ; 仪器型号 : F T S - 65A B IO - RAD ; 反射棱镜 IR E: Zn Se ; - 1 - 1 入射角 : 45;?扫描次数 : 64 次 ;分辨率 : 8c m ; 波数的精确度 : 0. 1c m 。 2. 2 人体实验 收稿日期 : 1999 - 06 - 08 。 作者简介 :丁帄田 ;讲师 ;博士 ;电话 : 024 - 23843711 - 3661 ; E - mail : Di nt 402 @a hoo . co mgp y 受试者 , 30 岁 ,健康男性 ,无皮肤病史。 测试部位在实验前 48h 内不得应用任何化妆品及 外用药物 。在进行 A T R - F T IR 测定之前 ,受试部位用蒸馏水冲洗 ,药棉轻轻擦干 。两手的前 2 ( ) ( ) 臂划分为 4 个区 3 ×9c m, 分别为 : 空白对照区 、丙二醇 P G处理区 、5 %Azo ne P G 溶液处 理区 、5 %OA P G 溶液处理区 。处理时间为 2h 。在处理过程中 ,该区用药棉及聚乙烯膜覆盖 ,以 防污染衣物 , 但不密封 。处理后用药棉将被处理部位彻底擦拭干净 , 再用酒精药棉球轻擦 2 遍 。让皮肤在室温下自然恢复 2h ,然后进行 A T R - F T IR 测定 。第一次测定完成后 ,在受试部 2 ( ) () 位用压敏胶带 3 ×9c m进行角质层剥离 粘贴 1mi n,并分别在剥离的第 2 、4 、8 、15 次后再进 行 A T R - F T IR 测定 。同时准确称量压敏胶带在使用前后的重量 ,其重量之差为剥离角质层 的重量 。 2. 3 数据的处理 - 1 - 1 仪器在 800 c m ,4000 c m 范围内记录样品的红外图谱 。由于水峰和其它峰存在的影 - 1 - 1 响 , 使 C H- 伸缩振动吸收峰在 3200 c m 、2850c m 附近以肩峰的形式出现 ; 所以积分之前2 - 1 - 1 首先进行基线校正 。积分区间为 2835. 4 c m ,2946. 3 c m 。这一积分面积用来计算皮肤表 面脂质的相对含量 。 在 A T R - F T IR 中 , 样品吸收峰的强度除了与样品的性质和量有关外 , 还与样品同 IR E接触的紧密程度有关 。特别是在体实验 ,在两次采样中难于使接触的紧密程度达到完全一致。 - 1 ( ) 因此不能直接将吸收强度进行比较 。为了获取有意义的数据 , 本文以酰胺 ?峰 1640c m 面 积为基准 , 对 C H- 伸缩振动峰面积进行归一化处理 。酰胺 ?峰来源于皮肤角质层中的角蛋 2 - 1 白 ,其吸收强度与皮肤同 IR E 的接触紧密与否有关 。酰胺 ?峰的积分范围为 : 1580. 7 c m , - 1 1727. 3c m 。并将未作任何处理的皮肤角质层的脂质含量定为 100 % ,用渗透促进剂处理或用 压敏胶剥离后的角质层与之比较 。文献中应用相同或类似的方法对皮肤吸收的水分或药物进 4 ,5 行了定量。 3 结果与讨论 A T R - F T IR 光谱是一种很有效的红外实验方法 , 在研究样品表面性质方面显示出独特的应用价值 。在 A T R - F T IR 中 , 无需制样 , 不具破坏性 , 为在体研究人体皮肤的屏障功能和 渗透促进剂的作用机理及药物的经皮吸收奠定了基础 。 6 ,7 ( ) : 红外光束照射穿透进入皮肤的深度 d可由下式估计p 22 1/ 2 θ λπ( ( ) ) - n/ n]d=/ 2 n1 si n2 1 p - 1 - 1 入射角为 45,?在波数为 2820 c m ,2850c m 时 , d 约为 0. 7 m ,大概相当于一个角质μ p 层细胞的厚度 。A T R - F T IR 图谱代表了纵向深度为一个角质细胞厚度处脂质的信息 . 而普 通红外在体外测定时 ,由于是透射方式 ,图谱信息来自整个角质层 。所以 A T R - F T IR 对于测 定纵向不同深度角质层中脂质的变化及分布更为灵敏 。 胶带剥离技术和 A T R - F T IR 光谱技术的联用可以获取人体在体不同深度的光谱信 8 息 。早期的文献以剥离次数来衡量或代替角质层的深度 ;但实际上 ,即使在皮肤的同一部位 , 也很难保持每次剥离相同数量的角质层细胞 。 因此 ,采用单位面积剥离下角质层的累积重量 5 来作为皮肤角质层深度的衡量指标更为准确 、合理 ,也为文献所应用。 - 1 - 1 () c m ,2950c m 附近的 C H伸缩振动峰的 2 在角质层的 IR 图谱 图 1中 , 发生在 2800 50 生 物 物 理 学 报 2000 年 0. 140 0. 120 0. 100 0. 080 0. 060 0. 040 0. 020 3500 3000 2500 2000 1500 1000 4000 - 1 ()Wa ve n u mbe r s c m h u ma n st rat u m co r ne u m i n vi vo Fi. 1 Rere se nt at i ve A T R - F T I R sect r u m ofg p p 位移是指示脂质侧链自由度水帄的灵敏指标 ,波数位移的大小与 C H- 的偏转/ 全反构象体的 2 5ν 人 、猪 、大鼠的角质层中均有一个随温度升高的相转变过程 , a s C H2比例有关 。有研究表明 - 1 - 1 ν 和C H位移大小在 6c m ,3c m 间 。提示了相转变后 ,脂质侧链中 C H- 偏转构象增多 ,角s 2 2 质层中脂质排列的无序性增加 。 ν以C H对单位面积剥离角质层的累积重量作图 ,所得图线见图 2 。从图中可以看出 ,无论 2 νν是对于C H还是C H, OA 和 Azo ne 均使得峰位蓝移 , 就峰位蓝移的大小来说 , Azo ne 比a s 2 s 2 OA 的作用更为强大 。但 ,这种作用随着角质层深度的增大而减弱。 这同一般情况下 Azo ne 比 OA 具有更强的促进渗透的结论相符合 。一般认为用压敏胶带剥离 15,20 次后 , 可以接近全 9 部剥离角质层 。实验中 , 剥离 15 次后两种渗透促进剂的影响仍然存在 , 但峰位蓝移的大小 2853 2923 2852 2921 2851 2919 2850 2917 2849 2915 2848 0 0. 2 0. 4 0. 6 0. 8 1 0 0. 2 0. 4 0. 6 0. 8 1 2 2 ( )SC wei ht m/ c m)( gg SC wei ht m/ c m gg ? Azo ne ? OA ? P G ? co nt rol ? Azo ne ? OA ? P G ? co nt rol ()()a b νPlo t s of C H2 - re mo ve d acc u m ulat i ve Fi. 2a ai n stSC wei htg g g Azo ne 和 OA 已经没有差别 。为了考察 P G 150 是否对峰位的蓝移有贡献 , 以 P G 处理皮肤 130 后进行 A T R - F T IR 测定 , 结果发现处理后 110 的角质层中的 C H- 伸缩振动峰位与未处理 2 90 的无明显的差别 。 70 人体角质层中脂质的纵向分布如图 3 , 50 从图中可以看出 , P G 对皮肤角质层中脂质 0 1 0. 5 2 的含量分布无明显影响 。对于油酸 , 在角质 ( )SC weiht m/ c mg g 层外层脂质的含量明显高于内层 。可能是由 SC Fi. 3 The lii d di st ri but io n rof ile s wi t hi ng pp 于油酸渗透进入外层角质层细胞间所致 。但 通过脂质含量的增加可以算出 , 即使在角质层的最外层外来油酸的数量也仅占脂质总量的 ν20 %左右 。随着角质层深度的增加 ,脂质总量也逐渐接近正常值 。由这些数据结合C H波数 2 5 , 7 , 10 ν位移的大小 , 从一个侧面证实了原来文献中的假设 C H的位移主要是角质层细胞间固2 有的脂质侧链 C H- 构象的偏转引起的而不是直接来源于外源性油酸 。Azo ne 本身含有内酰 2 胺基团 ,它具有很强的酰胺峰 ?。如果 Azo ne 大量的进入了角质层深层 ,用以上的定量的方法 ν来求得的脂质的分布显然有较大的偏差 , 因为由纯 Azo ne 的图谱求出的C H和酰胺 ?峰面 2 积之比为 2. 91 ,远远高于人体皮肤角质层的值 0. 38 。但从图 3 中我们可以看出 ,皮肤角质层经 ν过 5 % Azo ne 溶液处理后 , 脂质的分布并没有明显地变化 , 剥离两次后 ,C H和酰胺 ?峰面 2 积之比即恢复了正常值 。故可以证明 Azo ne 并没有大量地进入角质层深部 。用 OA 、Azo ne 处 理皮肤后 ,剥离角质层前求出的脂质含量均偏高 ,是由于外层角质细胞吸附了较多数量的渗透 促进剂所致 。 实验结果提示我们 , OA 作为透皮吸收促进剂的机理可能是与皮肤整个角质层中脂质发生作用 , 使侧链无序性变大 , 导致脂质的流动性增加 , 减少了药物透过皮肤进入体内的阻力 。 5 , 10 , 11 并对最外层的角质层作用最为强烈 。这一结论和文献报道一致 。Azo ne 的作用机制与 OA 相类似 ,同样是增大了角质层中脂质侧链排列的无序性 ,但相同条件下 Azo ne 作用更强 。 12 尽管有文献 报导 Azo ne 处理无毛大鼠 SC 后 , 酰胺 I 峰显著增加 ; 但在本实验中 , 我们没有 发现这一现象 。而且从文献中 IR 图谱来看 ,Azo ne 的图谱和用 Azo ne 处理后 SC 样的较为接 近 。故推测这一现象的发生是由于吸附在角质层中的 Azo ne 没有完全除掉所致 。 参考文献 1 Elia s PM , Coe r ER , Ko rc A et al . Pe rc u t a neo us t r a ns o r t i n rel at i o n t o s t r at u m co r ne u m s t r uct u repp p ( ) J I n v es t De r m at ol , 1981 ,76 1: 297 - 301 a n d l i i d co m osi t i o n .p p 2 Ma k V HW , Po t t s RO , Guy R H . Pe rc u t a neo us Pe net r at i o n E n h a nce m e n t i n v i v o m eas u re d bat t e n u at e dy ( ) t ot al relect a nce i nr a re d s ect rosco. Ph a r m R es , 1990 ,7 8: 835 - 841f f pp y 郝劲松 ,郑俊民 ,张汝华等 . 渗透促进剂对 5 - D SA 标记裸鼠皮肤角质层影响的 ESR 研究 . 生物物理学报 . 3 ( ) 1995 ,11 4: 587 - 590 郝劲松 ,郑俊民 ,李大为等 . 离子导入法和渗透促进剂并用对裸鼠皮肤角质层影响 ESR 的研究 . 4 ( ) 生物物理学报 . 1996 ,12 2: 253 - 256 5 Nai k A , Pec htol d L A R M , Po t t s RO et al . M ec h a n is m oolei c aci d i n d uce d s k i n e net r at i o n e n h a nce m e n tf p ( ) i n v i v o i n h u m a ns . J Co n t r R el , 1995 ,37 2: 299 - 306 52 生 物 物 理 学 报 2000 年 张叔良 ,易大帄 ,吴天明 . 红外光谱分析与新技术 . 北京 :中国医药科技出版出版 , 1993 6 Ta ke uc hi Y , Ya su ka wa H , Ya mao ka Y et al . Eects oat t aci ds , at t a m i nes a n d role ne l col o n 7 f f f f y f y p p y gy r ats s t r at u m co r ne u m l i i ds a n d rot ei ns i n v i t ro m eas u re d bFo u rie r T r a nso r m I nr a re d T ot alp p y f f ( ) R elect i o n s ect rosco. C he m Ph a m B u l l , 1992 ,40 7: 1887 - 1892 f pp y 8 E x a m i n at i o n oba r rie r u nct i o n bi nr a re ds t r at u m co r ne u m Bo m ma n na n D , Po t t s RO , Guy R H . f f y f ( ) s ect rosco.J I n v es t De r m at ol , 1990 ,95 4: 403 - 408 pp y R e m ov al oS C i n v i v o : a n i m rov e m e n t t he cel l oh a ne t a e s t ri i n t ec h n i ue .Wei a n d DA , Galo r J R . 9 gyf p p pp p g q ( ) J I n v es t De r m at ol , 1973 ,60 1: 86 - 91 10 Cla ncMJ , co ri sh J , Co r ria n O I . Aco m a riso n ot he eects oelect ri cal c u r re n t a n d e net r at i o ny g p f f f f p ( )( ) e n h a nce rs o n t he roe r t ies oh u m a n s k i n usi n s ect roscoi c F T Z R a n d cal o ri m et ri c D S Cm et ho ds . p pf g pp ( ) I n t J Ph a r m , 1994 ,105 1: 47 - 56 11 Ta noo H , J u ni ne rH E , Bo dde H E . I n v i v o h u m a n s k i n e r m eabi l i t e n h a nce m e n t bolei c aci d :jgg py y t r a nse i de r m al w at e r l oss a n d o u rie r - t r a nso r m i n r a re d s ect roscos t u d ies .J Co n t rol R el , p f f f pp y ( ) 1997 ,47 1: 31 - 39 12 Sui ba a shi K , Na kaa ma S , Se ki T et al .M ec h a n is m os k i n e net r at i o n e n h a nci n eect bL a u roca r a m .gyy f pg f f y p ( ) J Ph a r m S ci , 1992 ,81 1: 58 - 64 T HE STUDY OF T HE M EC HA NISM OF TWO E N HA NCERS I N HUM A N I N VI VO BY ATR - FTI R ZH EN G J u n - mi n D IN G Pi n - t ia n , HAO J i n - so n ,g g )( Ph a r m ace u t i ca l U n i v e rs i t , S he n a n , 110015De a r t m e n t oPh a r m ac, S he n a n y y g p f y y g ABSTRACT wi del ( ) mec ha ni sm of t wo The use d e n ha nce r s oleic aci d OAa n d Azo ne wa s y st udie d i n h u ma n i n vi vo . At t e n ua t e d to t al ref lect a nce Fo urie r - t ra n sfo r m i nf ra re d ) ( F T IR wa s use d to mo ni to r t he wa ve n u mbe r s shif t s of C H- sect ro scoA T R -2 p p y a bso r ba nce s a n d t he di st ri but io n ac ro ss t he st ra t u m co r ne u m st ret c hi n li i drof ile sg p p ( ) e xlai nt he mec ha ni sm of t he e n ha nce r s . In t he SC, w hic h we re use d a s c ri t e ria to p sect ra ,t rea t me nt wi t h bo t h OA a n d Azo ne re sul t e d i n si nif ica ntshif t s to wa r d hi he r p g g νν wa ve n u mbe r s a t a s C H2 - a n d s C H2 -, a n d t he eff ect of Azo ne wa s st ro n rt ha n t ha t eg of OA . It wa s sho w n t ha t t he di st ri but io n ac ro ss t he SC we re no t li i drof ile sp p a dso r be d i nto t he sur2 c ha n dbut t he o ut e r mo st la r ,a n d t he e n hace r s we re mai nl eeg y y ν f ace co n si de re d , t he of SC . Ho we ve r a s i n t he la e rwa ve n u m be r s of C Hbei n lii dy 2 -g p w hole SC wa s aff ect e d , re sul t i n st r uct ural di so r de r a n d a mo re f l ui d st a t e . So t he g re si st a nce of dr u t ra n sde r mal deli ve r wa s re duce d . gy Wor ds : Oleic aci d ; Azo ne ; A T R - F T IR ; SC Key 致谢 : 实验中 A T R - F T I R 数据的测定得到了北京大学化学系红外光谱室翁诗甫老师的帮助 , 在此深表感谢 。