葡聚糖凝胶层析法分离纯化纤维素酶的研究

3 甘肃省教委科研资助课题33 西北师范大学生物系九六届毕业生 收稿日期 : 1998203225 　修改稿收到日期 : 1998206205 葡聚糖凝胶层析法分离纯化纤维素酶的研究3 曾家豫　冯克宽　王渭霞33 　张振霞33 (西北师范大学生物系 兰州 730070) 第一作者简介 　曾家豫 , 男 , 34 岁. 西北师范大学生物系讲师. 主要研究方向为生物化学及分子生 物学. 中图法分类号 　Q 936 摘 　要 　用绿色木霉 ( T richoderm a vi ride) 高产变异菌株 4131 产生的纤维素酶粗酶分别过 sephadex G225、sephadex G250、sephadex G275、sephadex G2100 和 sephadex G2150 柱层析. 结果表明 : sephadex G275 对纤维素酶的分离效果最佳 , 并获得了一个 CMC 酶组份 , 其比活力提高到原来的 419 倍 , 回收 率为 4116 %. 关键词 　葡聚糖凝胶 　分离纯化 　纤维素酶 近年来 , 纤维素酶已被广泛地应用于食品、饲料、医药和纺织等领域中 , 取得了一定的 经济效益. 纤维素酶的分离纯化及其性质研究逐渐引起了人们的关注. 笔者在本文中报道利 用葡聚糖凝胶分离纤维素酶的研究结果. 1 　材料和方法 111 　材料 11111 　粗酶液 　将经过 3 000 r/ min 离心的绿色木霉 ( T richoderm a vi ride) 4131〔1 〕发酵液 上清液 , 加入 20 %饱和度 (N H4) 2SO4 盐析 , 充分沉淀后 , 3 000 r/ min 离心 , 取上清液加入 6 %饱和度 (N H4) 2 SO4 盐析 , 3 000 r/ min 离心 , 所得沉淀经透析、冷冻、干燥 , 得粗酶粉. 用时 , 加入 p H 610 的 011 mol/ L 柠檬酸2柠檬酸钠缓冲液至原发酵液体积 , 3 000 r/ min 离 心 , 即得粗酶液. 11112 　层析用凝胶 　sephadex G225、sephadex G250、sephadex G275、sephadex G2100、 sephadex G2150 均为华美生物工程公司产品. 11113 　仪器 　层析用仪器为瑞典 L KB 2137 型柱层析系统. 112 　方法 11211 　分离纯化 　粗酶液用 p H 610 的 011 mol/ L 柠檬酸2柠檬酸钠缓冲液透析 24 h , 然后上 L KB 2137 型柱层析系统. 凝胶柱 216 cm ×120 cm , 洗脱液为 p H 610 的 011 mol/ L 柠檬酸2 柠檬酸钠缓冲液 , 洗脱速度为 12 mL/ h , 每管收集量为 214 mL , 核酸/ 蛋白检测仪检测 280 nm 处光吸收. 11212 　纤维素酶活性测定 　见文献 2. 11213 　可溶性蛋白测定 　据 Folin2酚法〔3 〕测定. 07 　 西 北 师 范 大 学 学 报 (自然科学版) 　　　　　 第 34 卷 1998 年第 4 期 　 　 Journal of Northwest Normal University (Natural Science) 　　　　　 Vol134 　1998 　No14 　 2 　结果 取粗酶液各 2 mL , 分别上 sephadex G225、sephadex G250、sephadex G275、sephadex G2 100、sephadex G2150 凝胶柱层析 , 结果如图 1 所示. 图 1 　葡聚糖凝胶层析图谱 图 2 　sephadex G275 图谱　　结果表明 , 5 种葡聚糖凝胶中 , sephadex G275 能将纤维素酶粗酶分离为 4 个较清晰的蛋白峰 (图 1 (a) ) . 测酶活 , 4 个蛋白峰中 , 峰 Ⅱ具有明显的 CMC酶活 (图 2) . 其余 4 种凝胶对纤维 素 酶 的 分 离 效 果 均 较sephadex G275 差. 因此 , 笔者选择 sephadex G275 分离纤维素酶 , 分离结果见表 1. 表 1 　sephadex G275 纯化纤维素酶结果 总酶活/ u 比活力/ u·mg - 1 纯化倍数 总蛋白/ mg 回收率/ % 粗酶液 466 0128 110 1 675 10010 sephadex G275 194 1136 419 142 4116 3 　讨论 1) 5 种葡聚糖凝胶中 , sephadex G275 对纤维素酶分离效果最佳. 通过 sephadex G275 柱层 析 , 笔者获得了纤维素酶的 CMC酶组分 , 其比活力提高到原来的 419 倍 , 回收率为 4116 %. 2) 葡聚糖凝胶柱层析获得的 CMC 酶组分 , 还可通过其它方法 (如离子交换层析等) 进一步分离纯化 , 得到纯度更高的纤维素酶组分. 3) 纤维素酶主要有 3 类〔4 〕. 笔者通过 sephadex G275 柱层析获得了 CMC 酶 (内切 β21 ,42葡聚糖苷酶) 组分. 葡聚糖凝胶对于纤维素酶其余组分的分离效果尚待进一步研究. 17 　1998 年第 4 期 　　　　曾家豫等 : 葡聚糖凝胶层析法分离纯化纤维素酶的研究 　1998 　No14　　　　The isolate and purification of cellulase by chromatography column of dextran gel 　 　　　　参 考 文 献 1 　冯克宽. 产纤维素的木霉高产变异菌株 4131 的选育. 西北师范大学学报 (自然科学版) , 1989 , (1) : 58 ～62 2 　〔德〕施特尔 ·马赫 B 著. 酶的测定方法. 钱嘉渊译. 北京 : 中国轻工业出版社 , 1992. 102～107 3 　Lowry O H. Protein measurement with the Folin phenol reagent . J Biol Chem , 1951 , 193 : 265 4 　吴东儒主编. 糖类的生物化学. 北京 : 高等教育出版社 , 1987. 348 The isolate and purification of cellulase by chromatography column of dextran gel Zeng Jiayu 　 Feng Kekuan 　 Wang Weixia 　 Zhang Zhenxia (Department of Biology , Northwest Normal University 730070 Lanzhou PRC) Abstract 　 A cellulase from T richoderm a vi ridevariety st rain 4131 was purified by chromaography column of sephadex G225、sephadex G250、sephadex G275、sephadex G2100 and sephadex G2150. Analysis showed that the purified proteinase was CMC , and when it was purified by sephadex G275 , the effect was the best . The specific activity of CMC was increased by 3192fold with an activity recovery of 4116 %. Key words 　dextran gel 　 purification 　 cellulase (责任编辑 　王 　峰) 　 我国选定的作为法定单位的非 SI的单位 量的名称 单位名称 单位符号 换算关系和说明 时间 分 min 1 min = 60 s 〔小〕时 h 1 h = 60 min = 3 600 s 日 , (天) d 1 d = 24 h = 86 400 s 〔平面〕角 〔角〕秒 ″ 1″= (π/ 648 000) rad 〔角〕分 ′ 1′= 60″= (π/ 10 800) rad 度 ° 1°= 60′= (π/ 180) rad 旋转速度 转每分 r/ min 1 r/ min = (1/ 60) s - 1 长度 海里 n mile 1 n mile = 1 852 m(只用于航程) 质量 吨 t 1 t = 103 kg 原子质量单位 u 1 u≈11660 540 ×10 - 27 kg 体积 升 L , (l) 1 L = 1 dm3 = 10 - 3 m3 能 电子伏 eV 1 eV≈11602 177 ×10 - 19 J 级差 分贝 dB 线密度 特〔克斯〕 tex 1 tex = 10 - 6 kg/ m = 1 g/ km 面积 公顷 hm2 1 hm2 = 10 000 m2 速度 节 kn 1 kn = 1 n mile/ h = (1 852/ 3 600) m/ s(只用于航行) 27 西 北 师 范 大 学 学 报 (自然科学版) 　　 第 34 卷 　 Journal of Northwest Normal University (Natural Science) 　　 Vol134