附子双酯型二萜生物碱提取工艺及水解反应的研究（可编辑）

附子双酯型二萜生物碱提取工艺及水解反应的研究（可编辑） 附子双酯型二萜生物碱提取工艺及水解反应的研究 Index:0629 UDC:540 Southwest University of Scienceand Technology Master Thesis Degree Extraction and TechnologyHydrolisis Reactionof Diester―typeDiterpenoid Alkaloids fron3_Aconitumcarmichaeli debx Grade:2009 Candidate:LiuZhuo Academic Liedfor:Master DegreeApp Speciality:Botany Supervisor:Yuan Xiaohong 独创性声明 本人声明所早交的 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 是我个人在导师指导F进行的研究】作段取得的研究成果。 尽我所知，除，史中特 JI_加以标注*『致谢的地方外(论文中不包含其他人已经垃袁或撰 写过的研究胜果，山币包含为获得尚南科技人学业其它教育机构的学伟业证』 而使?过 的材料。与我一同I作的同志对本研究所做的任何贡献均已往论文中作了明确的说明计 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示r谢意。 箍2，?尊 日„2c,2_。‘o 关于论文使用和授权的说明 本人完全r解“南科妓k学有关保留、幢川学竹论文的规定(邮:学校宙权保留学 佩论文的复印什，允许谈论文被卉J?_l俯阅:学授。口吼公布该论文的全部业部分内存， 可U采川澎印、缩印城托他复制手段保存皓文。 保密『『J学位论文茁解督后应遵守此规定 箍幺:土?卑 铷黜砉十够„‟协“。‘ 西南科技大学硕士研究生学位论文 第1页 摘 要 附子具有强心、抗炎等药理功效，是重要的传统中药材，其所含的二萜 生物碱具有较好的杀虫活性，可作为 种新型的生物杀虫农药进行不发应 用。但附子。卜|的乌头碱等双酯型二衔生物碱具有极强的毒性(在临眯应用和 附子总二萜生物碱生物农药的不笈应用时，存在极大的安全隐患。尽管传统 的炮制工艺可以有效降低附子的毒性，但存在工艺繁琐、产品有效性难毗保 证等问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。本文通过对附子二萜生物碱的提取工艺、化学成分以及双酯型二 萜生物碱的水解反应等研究，得到附子总二萜生物碱及双酯型二15;!i生物碱的 提取工艺，分离得到了附子中的主要化学成分，并初步掌握了附 子双酯型二 萜生物碱的水解规律(为附子的减毒和附于-萜g二物碱杀虫农药的研发奠定 了牲础。 通过比较不酬的提墩因素对附子总二萜生物碱及双酯型生物碱提耿效 果的影l啊，得到最佳提取工艺:在I5?条件下，将附子粗粉置于10倍无水 己醉叶]冷浸3次，每次ld，总碱收率和纯度分别为o64,和2032,:双酯 碰生物碱收率为0 8 57,，纯度为I81,，其t扣中乌头碱、乌头碱和次乌头 喊的收率分别为01 6,、0032, L1038,。 采川柱层析和重结晶等方法，从附子厶醇提取物中分离得剑8个化合 物(通过波谱学技术或与 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品比较鉴定为:口一谷带醇、次乌头碱、乌头碱、 中乌头碱、束架灵、尼奥灵、苯甲酰次乌头碱和附子灵。 -与头碱、巾鸟头碱和次乌头碱等附于双酯型生物碱在小同的溶剂、pH、 温度和反应时Iq等条什F反应，得到苯甲酰单酯型，L物碱、原碱等6个水解 产物。 通过比较币l刊反应温度、时问、醇浓度等条件列附’r总二萜生物碱及附 r粉末水解反戍的影响，得到产物中J_fL酯型生物碱含量较多、般酯型生物碱 较少的附子总二萜生物碱水解条1q-。附予总二萜生物碱溶于l倍2,乙醇中， 100?加热3 h后，rfi鸟头碱、乌头碱、次乌头碱、苯r1_i酰中乌头碱、苯甲 酰乌头碱、苯甲酰次乌头碱的含量分别为056,、056,、O88,、3343,、 631,、20 92,。附子相粉同样处理后，中乌头碱、乌头碱、次乌头碱、苯 甲酰中乌头碱、苯甲酰q头碱、苯刊酰次乌头碱的禽最分别为524,、154,、 ll3,、282,、412,、171,。 西南科技大学硕士研究生学位论文 第1I页 关键字:附于 中乌头碱 乌头碱 次乌头铖 苯甲酰中乌头碱 苯甲酰乌头碱 苯甲酰次乌头碱 西南科技大学硕士研究生学位论文 第?页 Abstract Aconitumcarmichaeli aconiti an debx Radix lateralis isimportant traditionalChineseherbal chouldbeusedasnew medicine，and biological Becauseof is hazardonthe pesticide strongtoxicity,theregreatpotentialsafety clinical and traditional applicationbiologicalpesticideapplicationUsing ofAconitumcarmichaelidebxcouldbe toxicity processingtechnology-the reduced the is andtheeffectivenessof effectively，buttechnologycomplex is notsureInthis andchemical products paper,extractiontechnology constitutionof alkaloidsfromAconitumcalmichaeli diterpenoid debx，and reactionon alkaloidswerestudied hydrolysis diester―typediterpenoid Thesuitableextraction of alkaloidsfromtherootsof technologyditerpenoid Aconitumcarmichaelidebxwasasfollowcoarse oftherootsof sizings Aconitumcarmichaelidebxwereextracted10timesethanolfor3 by times each timeforI at1 5?Pheextractionrateand oftotal dayl purity diterpenoid total alkaloidswereO64,and2032,The of diterpenoid yielddiester―type alkaloidswasO 016,aconitine，0032, mesaconitineand 57,(including 0 ve The of 38,hypaconitine(respecy puritydiester-typediterpenoid alkaloldswas】88】, fronltherootsofAconitumcd， mickaelidebxbv 8 were1solated compounds and methods wereelucidatedas recrystalllzatIo【1They chroinaIogr8phy 一一sitosterol andfuziline methodor with benzoy?1ypacoltfnebyspectrum comparing authentic sample reactionof alkaloidswasstudiedon Hydrolysis diester-typediterpenoid as andreactiontime6 differentcondition，such solvent，pH，temperature were monesteralkaloidsandaconines benzoyl productsgained，including dissolvedin2, alcoholandheatedat100?for Afterthetotalalkaloidswas 3h，thecontent and wereO56,，O56,， 088,，3347,， benzoyIaconlllnebenzoyIhypaconltlne 631,and20 the ofAconitumcarmichaeli 92,respectively(Afterpowder contentof debxwastreatedasabove，the 西南科技大学硕士研究生学位论文 第1v页 and were1 benzoylmesaconlnne，benzoylaconlflne54,， benzoylhypaconIIlne 524,，113,，282,，412,andI 71,，respectively words:Aconitum Key 西南科技大学硕士研究生学位论文 第v页 目 录 绪论 „ l „ l 1附子的研究概况 l l 2附子的化学成分 l l 3，L物碱的提取、分离研充进展 2 l 4附子中 萜生物碱的药理毒理活性 3 l 4I药理作用研 究 ?? 3 „ „ l 42毒性研究 5 1 5附子的炮制 6 l 5l附予炮制现有方 法 „ 6 l 52附子炮制诸法利弊 7 l 53 改进附子炮制应遵循中医临床用药要求 8 I 6选题的目的意义 10 l 61选题H的 10 „ l 62选题意义 10 2材料与方法 2l实验材料、试剂及仪器 1l 2l 1实验材 料 】l 21 2实验仪器 1I 213蛮验试剂及试剂断!制 1l 22实验方法 l 2 22l t要的研究思路 12 222技术路线 13 223测定指标及其方法 13 22A附予总碱及取酯型生物碱提取工艺研究 14 225附予化学成分研究 15 226舣酯型二萜生物碱水解反应研究 18 „ 227总碱水解反应研究 20 228附子水解反应研究 21 3实验结果与分析 23 31 附子总碱及烈酯型生物碱提取，r艺研究 23 西南科技大学硕士研究生学位论文 第vI页 3l l标准曲线的制 作 „ ，1 31 2精密度试 验 ， 1 31 3加样回收率实 验 ，1 3 I 4提取溶 剂 ’d 31 5提取方 式 ，E 3l 6提取温度 26 3I 7粉碎 度 „ 28 31 8料液比 28 31 9提取时 唰 ( „ 3n 3 1 10提墩次数 32 32附子化学成分研究 34 33取酯型二(萜电物碱水解反应研究 36 331单酯型生物碱的结构攀定 36 3(32原碱的结构鉴定 37 333水解舰律的探讨 38 34总碱水解反应研究 38 3,41杯准曲线的制作 38 3(42精密度试验 39 343加样回收率实鲶 39 3(44总碱的提取 39 345总城水解反应条件优化 一 39 3(46总碱水解产物的定蛹分析 40 35附子水解反应研究 40 351附丁水解反应条件优化 40 352|:什子水解产物的定量分析 41 4讨论 „ 42 4l 附子总碱投积酯型生物碱提J:Dc工艺研究 42 4,2附子化学成分研究 42 43积酯州二帖7L物碱水解反廊研究 42 44总碱水解反应条什优化 43 45附J:水解反应条什优化 43 46薄性及杀虫活性讨论 44 结 论 45 西南科技大学硕士研究生学位论文 第VII页 致 谢 46 参考文献 47 附 录 5l 附录l化台物5的质谱图 5I 附录2化台物5的氢谱 图 „ 52 附录3化合物5的碳谱图 53 附录4化合物6的质谱圈 54 附录5化合物6的氢谱圈 55 附录6化合物6的碳谱圈 56 附录7化台物7的质谱图 57 附录8化合物9的质谱 罔 ?? 58 附录9化台物10的质谱图 59 附录10化合物11的质潜图 60 附录11化合物12的质涪图 61 攻读硕士学位期间发表的学术论文及研究成果 62 西南科技大学硕士研究生学位论文 第1页 l 绪论 I 1附子的研究概况 附子为毛茛科马头属乌头即 onitumcarmichaeliDebx 的侧根加工品一i 是公认的川产道地药材(在四川i【油市具有悠久的种植历史，质量上乘，是 作为当地一种具不发价值的药用植物。目前，附予资源撤其 富，当地年产 约600万Kg。l | 子具有回阳救逆、温补肾阳、祛寒止痛、糖】叟质激象样作 用之J; !J效，也能够强心、升压、抗休克、抗m栓形成、抗缺氧、抗心肌缺血、 抗缓慢性心律失常、抗炎、抗衰老、抗肿瘤、蛹节免疫、抗溃疡、抗腹泻、 发汗、解热、镇静„。这与乌头药理学的抗炎止痛、镇静麻醉、改善内分泌 功能和心血管系统功能等多方面的综合效应有关。因此，附了被_ !f 为“回阳 救逆第一药”，是治疗危急重症和疑难杂症的常用药。附子第一次有文字记 载是在《神农本草经》卜。在唐代，附子JfJ于治虚寒、M痰。《伤寒沦》收 载附F的配方就有20个。在宋朝叫人们发现它具有峻补作JH。到了会、元 时代加深了对其的药用研究。《本草纲目》记载的附子为主的药方有】l3种。 在现代，《中心药媳》及H。【(部标准螭I―19册叫1食有乌头类的r|l成药制剂 扣 除重复鼎种 共计340多种。附子及其配伍，可冶疾病达80余种，具有强 心升压作用的代表性复方cp药注射液有参附注射涟、四逆71: 埘液等。在我| !i| ,11医l临床处方中，鸟头类药物被经常运用(如征救治因急性，LI,肌梗塞所敛的 休克、低血压、冠心病、风心病、风湿，医治关节炎、胸膜炎、肿炎、 l|l经 痛及M寒湿痹的关舯车痛等方面t”，都表现出了良好的疗效。U见，|i|寸r应 用十分广泛，但是，生附子毒性较大，《种农本草经》将m产列为“下品”。 其药用或误服后产，上中毒甚至死亡的事例至今仍时有发生。川此，附f只能 加工炮制后入约。 1 2附子的化学成分 附了rI一生物碱的含量、利??娄匍埘H多(其类型主要为 多取代的属于C-。类型 乌头碱型二萜生物碱，大多数具有1(2个酯健，酯基主要为醋酸、苯甲酸及其 衍，L物或掣芦酸等，其中包括乌头碱、中‘?头碱、次乌头碱、塔拉地萨敏等 44种一萜牛物碱。多数附子所禽生物碱的结构已确定。例撕l:次乌头碱、乌 头碱、t”乌头碱、川乌碱甲、川鸟碱己、塔扭地萨敏、有强心作川构水洛性 西南科技大学硕士研究生学位论文 第2页 成分d1一去甲乌药碱Ii、具有弱强心作用的昆常碱151、卡拉可林八十、己酰塔拉 萨敏„„、塔拉胺iiIi、氯化甲基多巴胺i6?】、lipoaconitineI5l，11pohypaconltIne„、 15n一羟基新乌碱、苯甲酰中乌头碱、水溶性生物碱(去甲猪毛菜碱、4一乙酰塔 葛尔乌头碱、1l口omesaconltin“尼奥灵、附子灵、美沙乌头碱、异翠雀碱、苯 去甲乌药碱、新江油鸟头碱„、尿啼啶„、华北乌头碱ri、黄草乌头碱„、海特 生、8(乙氧基(14一苯甲酰基中乌头原碱、lO一羟基乌头碱等。 :怍生物碱类:附予中还含有其他种类的化合物如挥发油、酶、多糖、微 量元素、有机酸、有机碱、蛋白质、氨基酸等成分。 1 3生物碱的提取、分离研究进展 附于中的生物碱既是土要成分，又是有效成分。为了减少有效成分的流 逝，因此(对啦物碱提取、分离的研究，具有重要意义。 生物碱提取方法有以卜几种: m水提取法 商拔以水作为溶剂。此法操作简便，成本较低，但存在提墩次数多，水 用量大的缺点。 21酸性水溶液提取法 使生物碱与酸作刚生成盐而得到提取物 再?J碱进行巾和得到生物碱。 3 碱性水溶液提墩法 使，L物碱与碱作刖牛成盐而得到提墩物 再J射陵进行中和得到生物碱。 f41有机溶剂提10c法 可采用单 有机溶剂或采用混合溶剂进行提取。乙醇作为提取溶剂较为 普遍。 51超临羿提取法 超临界流体提取法有超临界流体萃取法和超临界流体也瞒法等方法。以 二氧化碳最为常用。具有以F特点:1、司在常温F操作。2、可有效地防止 热敏性和化学不稳定性成分的高温破坏和氧化。3、溶剂污染，使用安全。4、 操作费j1J低，选择陛好。世生产成本高，小适合工、Ik化生产。 日前，虽然对附了的提取工艺研究较多，但是主要是侧重J总喊的提取， 而对3种双酯型，L物碱提取工艺研究较少。口只考虑了提耿溶剂、时|1Ij、 西南科技大学硕士研究生学位论文 第3页 次数等因素。 分离方法秆以下几种:主要是硅胶杜色谱分离法、AI 203杜色谱分离法、 LH20色谱分离法、大孔树脂分离法、离子交换树脂分离法、结晶 Sephadex 法。用硅胶、氧化铝柱层析分离纯化生物碱易产生拖尾现象，分离效果不好。 在硅胶早加了氢氧化钾而显碱性，能较好的解决泼问题。 1 4附子中二萜生物碱的药理毒理活性 1 4l药理作用研究 1 对心血管系统的作用 ?对心脏的作用 |【ff予具有口受体兴奋作用、d受体兴畲作用m1111]，能促进神经术梢释放儿荣 酚胺。睫通道激动剂一去甲乌药碱对蟾蜍离体心脏和家兔在体心脏均罹?i强心 作用，这属芦受体部分激动剂。附子和附片均能增加冠状动脉流量和心肌收缩 力。离体蛙心及在体大鼠实验方法t121表明了炮制前后附子都具有较强的币性肌 山作川。川不州的制剂在不同的吱验模型r都可以证驯，附子有强心作用， _|iii床也宵许多治疗心力衰竭取得成功的例r。 ?对血管和血Lfi的作用 实验表明，川附子浸煮液静脉注射给药对麻醉猫有升压作川。c?能与体内 的组版、乙酰胆碱的释放有关。 2 对植物神经系统的怍川 生附r对植物神经系统的作川出乌头碱类生物碱qI起113]，加』:炮制后的附 子则无此药理活性:阿托品能抑制生附予和鸟头碱对大鼠离体回肠肌的收缩 作用，圳此，町能具有副交感神经兴奋作用。例如，对乙酰胆碱、组胺、二 氯化钡对州肠收缩无影响，而对电刺激副交感神经引起的收缩呈明显抑制作 用。，士附子也能引起大鼠血压下降及心率减慢，对豚鼠右心房呈负性H儿力作 用。 f3 对中枢神经系统的作用 附予表现镇痈作片】实验表明，01 mg,kg的镇墒效果较吗啡6mg,kg的作用 还强。给大鼠灌服附子水煎剂后，也能延长小鼠对热痛反应的潜伏期Iu】，减少 腹腔注射酒石酸锑铧或乙酸引起的扭体反应次数。另外，生附予能够使小鼠 假性痛闽值上TI-30(40,。 f41抗炎作川 西南科技大学硕士研究生学位论文 第4页 乌头碱类的抗炎作用以抗应激性反应为主，提示可能与中枢神经系统有 关a如附子煎荆口URx,tA鼠甲醛性及蛋清性踝关节肿有明显抑制作用„I。乌头 碱娄生物碱能明显抑制对毛细血管渗透性增加角叉菜碱足跺肿胀受精月;f;浆膜 r”。 囊上的肉芽形成?。I 5 抗肿瘤及对免疫功能 附子在抗耐药肿瘤方面具有潜在的研究价值，有抑瘤及抑制癌转移的作 用。例如，精制鸟头注射液全身给药能抑制小鼠移植性肿瘤前胃癌Fc和肉瘤 s180、L肺癌自发转移，可治疗晚期胃癌。其抑瘤作用效应机制可能与活化细 胞凋亡信号传导通路，与环磷酰胺有曲In]增效作用„，，诱导肿瘸细胞凋亡。有关。 鸟头碱能增fittest药物的敏感性，鸟头碱能够增加长春新碱对KBv200细胞杀 伤的敏感性i”1。 附予有l删显增强抗体产，上的作刚?，，可增强脾细胞、产生抗体。实验表明， 附予注射液可提高小鼠体液免疫功能及豚鼠血清补体含量，担对小鼠血清溶 菌酶活性无明显影响。 6 杀虫作川 附f(萜生物碱的系虫麻川有着很久的历史。在我国民叫就有用附 于浸液作土农药和制作箭毒。一r衍‘仁物碱作为附于的主要杀虫活性部位。 Patricia Gonz’alez等发现阿替生艇一萜生物碱埘利什曼原虫有抗增熵作用 m、。附子炮制加工浸渍液可以高教地防治蚜虫、红蜘蛛、银纹夜蛾、菜菏虫、 卫矛尺螳等m嗜虫:附子浸渍液及附r或提取物一叮以杀草坪害虫斜纹夜蛾、 ^龄期lJ矛尺蠖”31、粘虫、桃蚜、办拟谷盗、家蝇、蚜虫和菜奇虫等。草鸟 索，脱氧己酰乌头碱封韭菜根!|!?幼虫有明显的杀虫活性七I，从臼喉乌头一l- 提取得到的二枇屯物碱配制成不同浓度的药液，埘花房中的蚜虫进行杀 虫效粜试验(杀虫效粜发现，药液100 ppm浓度以h只对幼虫起作川而 浓度500 ppm以上对E虫杀虫率达90,以i二，药液对成虫的最适曲+浓度 为1500 ppm(杀虫作用两天时叫就基本完成，其效粜与化学农药氧化乐 粜药效相当。乌头生物碱对桃蚜具有较好的防治效粜和毒杀作用。露蕊 鸟头的’ |醇提取物对纹伐蛾的拒食活性约为72,。瓜叶乌头对斜蚊夜蛾 和小菜蛾具柯明显的杀虫活性。乌头的乙醚、乙醇提取物对粘虫其有一 定的防效作用。杜晓英等发现乌头甲醇提取物对家蝇、赤拟谷盗具有一 定的趋避硐j毒杀 ，日性。J匕吗头 Aconitum kusnezojfii 的阿酮浸液对绣线菊 蚶、装缢管蚜和汞谷缢管崎具钉较商的电物杀虫活性，且计化学农药氧 化乐果和吡虫啉均收现叫丝增散作川。由此可以看山，卅f中的(萜生物 西南科技大学硕士研究生学位论文 第5页 碱能够有效地杀灭农业害虫，是鼠有广阔前景的植物源农药不发品种 l 42毒性研究 附予的毒性成分主要是乌头碱、中乌头碱和次乌头碱等般酯型二萜生物 1-1 ，乌头碱的成人致毒量为O 碱 Fig 2mg，致死量为0(4mg。主要是山其 分子叶1C-8位和C(14位的乙酰基和苯甲酰基引起毒|生反应(毒性主要作川 机制是是抑制呼吸、引起心律失常。对心脏的毒性作用是使心肌细胞Na+逋 道不放ml，从而加速Na+内流，健细胜膜去极化，导致心律失常。附于中的 双酯型二萜生物碱的C(14-OCOC6H 是其心脏毒性的结构基础:其中 :一14-OCOC6H6是乌头碱致心律失常必不可 少的;仕』C一15-OH对毒性影响较小?1。乌头碱，中乌头碱和次乌头础相应 生物碱的水解产物火剂量只引起窦房传导阻滞而不引起异位节律和室颤。可 见，他们的毒性授小。因此，通过合适晌方法控制|j| 予中杖酯型二萜生物碱 的含量，爿能有效解决附子的安全性问题[27，，并在临床上合理地使用。 A?conaicti„ne: RneI REtl,鬓喘:。H Hypaconitine:R1 Me(R2 H 图I(1 乌头碱、中乌头碱和皮乌头碱的结构 of and I-I Structuresacomtinemesaconitine Fig hypaconitine 双酯型二_萜生物碱在炮制过程一p酯键容易发‘卜水解反 应，失去C一8位的 乙酰基生成单酯型二萜‘L物碱，迁可进一步水解失去c一14 位的苯甲酰基生 成鸟太原碱，也可发生脱水、醚化、酯化等反应。目|j，『，一 般的炮制方法是 通过高温、离噩、浸泡等方法使毒性极大的乌头碱、中乌头碱和次鸟头碱等 双酯型 萜生物碱的含量降低。例如，在漂、浸、煮等附F JliZ,f11炮制过程 zI碱小附子的毒性。 一p，包括双稚’咝二萜生物碱等大部分啦物碱发生流失，t 或使双酯型q-物碱酯键断裂。生成单酯型7L物碱或原碱低毒性生物碱t也可 通过使达到减毒的目的。例如，苯o『1酰乌头碱等单酯型一萜生物碱的毒性为 双酯型鸟头碱的l,50―1,500，-与头原碱等酵胺裂二萜‘L物喊的毒性仅为双酯 西南科技大学硕士研究生学位论文 第6页 型乌头碱的I,2000―1,4000 E:sl。此外，还可以通过使双酯型一萜生物碱』-成具 有减毒增效的大分子络合物_I或毒性较小的脂生物碱??‟从而达到减毒的 目的。例如，附予与大黄、干姜或"草等药材共煎。由于附子炮制古今方法 甚多，且工序极不统一。因此，各地所得的炮制品，其毒性也相差8倍，总 生物碱的含量相羞10倍，无疑会给临床用药带柬很大的不便。 近年来的研究表明，双酯型二萜生物碱的水解反应还足个比较复杂的 过程，水解产物多样。刘永刚等m-采用高效液相色谱一I包喷 鳟,质谱,质谱方法， 发现乌头碱和中乌头碱的水解产物除单酯型和醇脏型二萜生物碱外，迸有多 种未知产物。王勇m，等在草乌花煎煮过程中，发现了剖酯交换反应产生成的积 酯型和三酯型脂类牛物碱。都瑞云等[34I采用HPLC―ESI―MS“的方法对次乌头 碱水解反应进行研究，发现了次马头次碱、次乌头原碱、N一去L 1基乙酰基次 岛头原碱和焦次乌头次碱等4种水解产物。研究表明，双略型一萜生物碱的水 解反应是一个比较复杂的过程，水解产物多样。不仅包括酯世的断裂，也有 脱水、醚化、脱N上的甲基或16位C上的甲链、酯交换等反应。双酯型二萜生 物碱在水中可以发生脱乙酰基反应同I时脱水的反应，脱苯甲酰肇反应同时脱 16位ch的H‘基或脱N卜的甲基等。Hf讨，t要通过质潜对1一这些复杂的水解 产物进行推测，尚未获得这些成分jr进步通过棱磁，,振等波措学技术进行 结构确定，其毒性和药理作』;|; 等也不清楚。冈此，明确双哺型二萜生物碱水 解产物的结构驶其水解胤律，对r提高炮制的科学性等具有重要的意义。 1(5附子的炮制 l 5(1 附子炮制现有方法 “1火炮法 炮附片的方法是附片拌净河砂炒至膨胀变色?】。此法缺点是火候大小、 时州睦短不易精确掌握。 2 水漂法 采刚_[|11辅料水漂，即取附子置于辅料水中浸泡，晒晾。水漂法:清水漂、 加辅料水漂。炮制品:舳附子、醋漂附子等。 3 水漂 Il】燕煮法 附子经水漂，蒸煮的加热等。炮制晶:黑顺片、白附”、挂片HI、黄附 片、热片”I等。 4 入辅料_lJ【l热法 西南科技大学硕士研究生学位论文 第7页 加入辅料炙。方法分为:醋煮制、蛮煮制m?w。常用的辅料:lr草汁?l、 姜汁圳、黑豆[391等。 r5 微波炮制 5 h， 附子去皮，加入50,的老水浸泡10(1h，再清水浸泡2-4次(20一24 次，蒸lO-20rain，晾干，烘干，微波机辐射干燥m1。 6 高』E蒸煮炮制 附予浸食盐胆巴水，水漂，切片，在高温、高压条件下蒸30rain，干燥。 1 52附子炮制诸法利弊 水浸泡法缺点是易损失有效成分。例如，生附子尤其是鲜附子用水冷浸 或切片后浸泡五天，就有50―90,的生物铖随水流失。燕、煮都因蒸制后， 分解破坏了大部分生物碱，虽可以减低附子的毒性，但因水解产物易溶予水， 5 因此也存在有效成分流失的缺点。例如，用氯化镁煮生附片1 min(牛物碱 古量则下降约50,。为了避免有效成分的流失，也可采取加雎蒸制法。但存 在央生现象，在工艺L有 定的难度，不适合工业化生产。火制法能避免有 效成分的流失(便于保存药效。似缺点是去毒的秤度搬难掌握，且易使药材 烧焦、烧坏。III此可见，|;f_ r的炮制存在1i少问题，亟待改进。 由J一中药附于的传统炮制l一艺着眼于减毒为第‘耍务而延用至今，忽视 了药效成分的保尉，导致有效成分损失大，既浪费了药材资源，又难以达到 冶疗的效果。乌头碱等般酯型二萜啦物碱【!:E是附f的毒陛成分，义是附子抗 炎、镇痛的主要药效成分，对心?L管系统和神经系统具有较强的药理作用。 双酯型(萜生物碱水解形成的芥‘P酰乌头碱、苯l甲酰中乌头碱、苯甲酰次乌 头碱等单酯型(萜生物碱，仍具有一定的抗炎和镇痛等药理作tlJ(而醇胺型 生物碱的药理活性微弱。如鸟头碱经120?、30min处叫!后(毒性虽然F降， 但镇痛和消炎的作刚也随之降低。由此可见，直接影II向附f的毒性和抗炎镇 痈疗效的是双酯型生物碱和单酯删生物碱的古量。如果要使制附子饮片达到 低毒高效的目的，必须适当控制炮制程度，使饮片中的取酯型生物碱和单酯 型生物碱成分含错保持枉定水平和比例。另外，通过对苯甲酰鸟头碱等单 酯型二萜生物碱以及其它水衅产物的毒性和药理活陛等方面研究(她有利于 附子临床应川的安全性和有效性。除烈酯型一萜7k物碱及其水 解产物外，附 子还含有多种药理作J1j的小同樊，型的活性成分，如消旋去甲岛药碱、去甲猪 毛菜碱和棍掌碱等具有较强的强心活性的水溶性7L物碱、具有一定强心作用 的尿嘧啶和附r眠具有抗癌、抗衰老平?增强免瘦机能的作用的多糖w，。炮 西南科技大学硕士研究生学位论文 第8页 制后对附予的药敛足西有影响有待更进一步的研究。 对附子中的乌头碱、中乌头碱和次乌头碱的水解产物和水解规律进行研 究很有必要，既能为附子炮制减毒新技术提供新的思路和方法，又有利于发 展适合十正业化生产的炮制方法，还有利于提高附子炮制的安全性和有效 性。以期达到在减毒的同时尽可能地保存附子中的有效成分，获得满足临床 不同需求的附子炮制品的目的。 1(5_3改进附子炮制应遵循中医临床用药要求 目前，关于附子附子炮制有以下问题:1、山于附于产区分和广泛，原 药材规格及炮制工艺变化很大，跚此，附子的质量参差小齐Ic，。需要建立能 够同H0兼顾附予安全性和有效性的科学、链化的质量控制标准。《中国药典》 „时附予品质的检测主要包括总碱含量和鸟头碱的限量，但采用分光光度法 鉴别‘-物碱类成分，专属性较差，且不能区分毒性强的烈酯型成分和毒性较 弱的单酯型啦分:采用薄层色谱法对乌头碱进行限量检奄，方法较为柑放， 难以有效控制质皱。2、附子的毒陛主要柬源于所含的双酯型生物碱，艘炮 制时犬多以降低双酯型卫:物碱的仃量来实现去除毒性的目的，但双酯型生物 碱又足有效成分。过去对附r炮制后侧重于减毒，忽视了药效。例如，乌头 原碱的谁眭虽然仅为原生物碱的I,2000一I,4000:但已无明显强心作Ji 1。3、 母性成分j二要是硪醣型生物碱，但是行全部柬源于双酯型生物碱，还有待进 步研究证实。除去般酯型生物碱的附1:水溶液，仍有毒眭， 且研究表明( 附子的总生物碱岔量与毒性指标LD50之问不存在线性关系。日前，对附子 炮制减毒增效的作J聃l理尚不太清楚，以致附予的安全性和有效性受到膨 l棚，因此，难以满足l_|_】药现代化的要求。改进附子炮制的主要目的是既要降 低附子的毒性，义要保证药效不减少。炮制品最好是根据不同的药用要求， 制订出附子炮制质量的指纹罔潜，【!王需要建立能够同时兼顾附了安全性和有 效性的科学、量化的质量控制标准。。一T保证了附子药J_|;J”发的安全雨I有效。 日前，总生物碱含量的测定有以下方法:1、中和法:《中国药典》14t一 采用回滴定法测定总生物碱的含量。但操作不便。2、酸性染料比色法I“I?I: 分为澳甲盼绿法、甲幡提取比色法等。此法是利J J生物碱与酸性染料反应生 成离子对，再进行比色测定的方法。3、蹙流示波极谱滴定法:此方法测定 终点赢观、准确，f|二l受口H的影l响较人?I。总7L物碱的含挝测定方法々属r土 较差，凡小能区分酯型‘L物碱成分平?非酯型生物碱成分。般略型生物碱的含 壁的测定有LlFh法:l、盐酸羟睦(岛氯酸铁池m，:指m盐酸羟啵、商氯酸 西南科技大学硕士研究生学位论文 第9页 铁使双酯型生物碱生成紫ll:色的结合物，进行比色的方法。2、复合缓冲纸 色谱一比色洼。双酯型生物碱的含量测定方法专属性较差，日不能较好地区 分毒性强的双酯型成分和毒性较弱的单酯型成分。附子在炮制加工过程中双 酯型二萜生物碱的水解产物是附子炮制减毒增 存 效的物质基础，对3种 双酯型生物碱及其水解产物的检测，对于阐明附子炮制减毒存效的科学内 涵、促进附子炮制生产实现 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 化、饮片质量的标准化，有效地提高附子药 材的的社会效益和经济效益，指导毒性中药临床应用，具有重要的现实意义， 并为毒性中药安全陛评价的研究提供了一个良好的示范。测定艰 酯型生物碱 和单酯型生物碱的含量对附子的毒性控制和药效控制非常重要，主要方法 有:】、采用薄层色谱法:采用薄层色谱法对乌头碱进行限量检查，方法较 为事H放，难以有效控制质量。2、双波k薄层扫描法m，:歧法具有分离效果 好，含量测定的结果准确、可靠、精密度好、回收率稳定、操作简单快速的 特点。3、岛效液相色谱法:高效液柑色谱法用样量少，准确度高，在微量 71( 分析中占有优势。198】年? (首次在ODS柱|(用磷酸盐缓冲溶液 pH-2 四氢吠哺 89:1】 作流动相，分离了乌头类生物碱。聂黎行等???以附子中的单 酯型和域酯型7I二物碱采刖薄层色谱法和高教液相法，以附了巾的-尊酯型和般 酯型7L物碱分别对附子和附片的质量进行了较全向的评价，并时建立的方法 进行丁i节辟的方法学考察，为附F及附片质母标准的提高提供了实验依捌， 可进一步指导安全有效川药。j:_|1兰等w??莱川高效液相色谱建立了同时附子中 单酯及双酯’锉生物碱成分的定量方法，办法稳定可靠、简便易行，r-川]丁附 丁类药材中单酯型和般酯型生物碱的同时定量分析，为附r药材及其炮制品 的质母评价和质量控制奠定了基 i Ij。4、反相高教液相法。5、商效毛细管电 泳法[52I。6、液质联用技术:液质联用技术由于具有快速、灵敏、可分析无 紫外吸收的成分并对未知成分进行结构推测等优点，在对|:什子二话生物碱成 分的分析榆测?? J发挥着雁要的作J Jm，。t ，药指纹图谱能够较全面反映tI??药化 学成分的全貌，是U 辩确保中药质量稳定、可控的一种有效手段，也足中药 标准化的内容之一。凼此，通过对附子般酯型二牺生物碱水解产物及其药理 活性等方而的研究，根据临床药用要求制订出附予炮制质量的指纹图谱，由 产地按统加』 方法进行炮制(既可避免全囡各地匹l附子加丁 炮制方法小同 |『1j造成成分的含量小均技有效成分大睦流失，义可防止毒性差异较大带来的 不良后粜，保证中医临床使朋附r的安全和有效。 删定双酯掣生物碱和堆酯型生物碱的合最对附子的1霉性控制和药效控 制非常震婴，埘健地生产实现_| 91范化、标准化、解释减毒仔效的内涵、扩大 西南科技大学硕士研究生学位论文 第10页 应斤j、提高经济础益具有重要意义。 综上所述，对附子的双酯型二萜生物碱，进行水解反应的研究，旨在确 定其水解产物的结构、探讨其水解规律，有利于附子炮制减毒的 安全性、l临 床使用的有效性和品质检测的规范性等，具有重要的理论和现实意义。 1(6选题的目的意义 l 61选题目的 为了使附于在杀虫方面到达减毒，增效或存教的目的，降低附子对人、 环境的危害。对附予的总二萜生物碱及双酯型二萜生物碱提取工艺、化学成 分、般酯型生物碱、总 萜生物碱碱、附子粉术水解反应进行了研究。为了 避免有效成分的流逝，对总二萜生物碱及烈酯型二一萜生物碱的提取[艺进行 研究;为r了解附f的成分，对l,化学成分进行了研究:为了 了解水解产物 的结构及其规律，首先对双酯型’(萜生物碱进行了研究;为了减少双酯型生 物碱，增加单酯型7k物碱含量，对总碱、附子进行水解反I蚓竹研究。 l 6(2选题意义 本课题的意义在于: 1 研究般酯型二萜生物碱、总碱、附予提取工艺及其水解产物的结构、 水解规律，对于削明附子减毒增效的机理，提高炮制的科学性等具有重要的 意义。 r21研究双酯犁二萜，L物碱、总碱、附r提取工艺及其水解产物的结构、 水解规律，宵利于提高附子炮制的安全性和有澈性。 r3 研究双酯型二帖生物碱、总碱、附子提取工艺及其水解产物的结构、 水解舰伴，有利于附子品质检测的胤范性。 41Jf鼓新型商致低毒的植物源教药，对健进我国农业可持续发展具有重 要作用。附于是我幽著名的常川中药，为四川省道地药材，在四川绵阳市常 年种植面积大，资源极其丰富，因此，极具门:笈价值。可促进我刚农业可持 续发展。 西南科技大学硕士研究生学位论文 第1I页 2材料与方法 21实验材料、试剂及仪器 2l l实验材料 材料购于四川江油附于GAP基地，经西南科技人学候人斌教授鉴定为乌头 Aconitumcarmiehaeli Debx的子根。 2l 2实验仪器 XJ(2型小型提取浓缩机绑 天津大明制药制备厂 :RE5220型旋转蒸 发仪 上海亚荣生化仪器J :Varianl200LC,MS液(质联用仪 火国Varian 5200B型超声清沈仪 昆tlJ市超声仪器有限公刊 : TU―1900双 公司 :KQ 光束紫外可见分光光度计 北尔瞥析通用仪器有限责任公司 ;Finnigan Avance一600 !I!核磁共振 LCQDE“质普仪 英国阿美特克有限公司 :Bruker 仪 德国m曾克公司，TMS为内杯 2l3实验试剂及试剂配制 0317 对 照品蚴于成都端芬思’E物科技公司(谷 醇、刚r灵对照11^本实验室自制: 己腈 色诰纯 ;二氯叩烷、钮仿、献酸、硫酸、冰醋酸、氨水、溴甲酚绿、 乙醚、石汕醚、丙酮、乙酸乙酯、正水己醇、甲醇、氢氧化钠、氢氧化钾、 醋酸钠、碘化铋钟、香草醛 以L试剂均为分析纯 :水为超纯水:薄层层析 075 LH20 化工厂 ，反J_| l硅胶 O040―0 mm，YMC公司 、Sephadex Biotech Silica60 O040―0063mm， AmershamPhar-maciaAB公司 t gel MerckKGaA公司 。 5(4?0 16 pH I溴甲酚绿染料溶液的配制?】:墩27g醋酸钠 NaAc一3H20 ( 4?01，加水至 1000mL(备川。 加入900mL水使溶解，J J冰酣睃嘣节pH至5 5 05mol,L氧氧化钠3mL置超声波仪 -l，10min溶解 取溴甲盼绿约100mg，"j0 4?0 mL，过滤， 墩滤液蔷川。 后，l’ 加^(pH51的酣酸一醋酸钠缓冲液至200 西南科技大学硕士研究生学位论文 第12页 碱性硅胶的制作:取氢氧化钟溶于纯水中与硅胶搅拌均匀 氢氧化钳l 硅胶5:100 ，置于120?烘箱中，烘8h。 2(2实验方法 2(21 主要的研究思路 附子具有强心、抗炎等药理功效，是重要的传统中药村，其所含的二萜 生物碱具有较好的杀虫活性，可作为一种新型的生物杀虫农药进 ?JI’发应 用。但附子cfl的乌头碱等双酯型二(萜生物碱具有极强的毒性，在临床应用和 附子总二萜生物碱生物农药的不发应用时，存在极大的安全隐患。尽管传统 的炮制工艺可以有效降低附予的毒性，但存在工艺繁琐、产品有效性难以保 证等问题。本文对总二帖，I二物碱及双酯型萜生物碱的提取工艺、化学成分、 耿酯型生物碱、总碱、附子水解反应进行了研究。为了避免有效成分的流逝， 时总二:萜生物碱及双酯型二萜生物碱的提取工艺进行研究:为了了解总(辅 小物碱的成分，对附子的化学成分进行了研究:为了了解水解结构及其规律， 首先对双酯型一:_6li生物碱进行了研究:为了减少坝酯型生物碱，增加唯酯型 生物碱的含量，对总二萜生物碱、附子粉木进行水解反成研究。 r1 附子总二萜生物碱提取研究 通过比较提J;0c温度、时删、次数、溶剂 小I-J浓度乙醇、酸水 、提取 力法、药材粉碎度等提取因素对总碱及双酯型生物碱提取工艺的影呐，找出 最佳提取工艺。 2 附子总碱化学成分研究 LH20等 、 通过比较不同分离材料 碱性硅胶、反梢巯腔、Sephadex 洗脱剂 石油醚与乙酸乙酯、石油醚与丙酮、二氯甲烷与甲醇、二辅II’烷与 内酮等 及结晶条件。找出最佳分离条件。 31水解反应研究 ?中乌头喊、乌头碱、次乌头碱承解反应研究 通过比较溶荆、碱浓度、反应温度、反应时州、料液比等反应幽索对中 乌头碱、鸟头碱、次鸟头碱水解反应的影响，找„水解规律。 ?|5I寸于总(萜生物碱水解反应研究: 通过比较乙醇浓度、反应温度、反应时问等反应心索计总减水解影II目， 西南科技大学硕士研究生学位论文 第13页 找出水解规律及产物中双酯型生物碱台量较少，增加单酯型生物碱的含量鞍 多的水解条件。 ?附子水解反应研究 通过比较乙醇浓度、反应温度、反应时问等反应凼索对附子粉束水解影 响，找出水解规律投产物中双酯型生物碱含量鞍少，单酯型生物碱的台量较 多的水解条件。 222技术路线 总城及般酯型:萜生物碱提取工艺研究――+附子化学成分研究――+ 中乌头碱、鸟"L-碱、次乌头碱水解反应研究― 总碱水解反应研究―+ 附子粉末水解反应研究 22(3测定指标及其方法 541 1 附子总碱测定方法:酸性染料比色法E ?对照品溶液的制备 取鸟戈r碱对j i品约4 0?01 mg，管50 HAC―NaAc的缓 mL蛙瓶 h]J,JpH为3 冲液至刻度。 ?最大吸收峰的确定 州文献„，的条件使照品液与澳甲酚绿形成离子对的氯仿溶 液，用紫外分光 光度计从340―520 nm的范| |j】内扫描，其最大吸收峰为415nm(与文献?时日道 相同。 ?禽晕测定 参照文献mI的订法。取浸膏按标准曲线制备，在415nm测定吸收度，并 从标准曲线上求得供试品中总乌头碱相当于鸟头碱的量(再?算禽餐。 5 5]。 2 取酯型生物碱测定方法:HPLC法1 ?色浩条件 extend 美LI,]ZorbaxC18 150ram×4(6mm，5 0,tm 色谱托:枉温;?j30?: 检测波K240nm:流动相为A和B两相梯度洗脱 A:乙腈，B:0 1,己二胺; 洗脱程序:0一10rain，A为35,，10―15nfin，A为35―50,;l5-30min，A为 50―75,;30―35min，A为75―35,:35-60min，A为35, ，流速为10mL,min， 进样量20“L。 体拟流鞋为110mL,min。边样耻均为20“L。 ?供试品溶液的配制 西南科技大学硕士研究生学位论文 第14页 取适量浸膏用甲醇定溶于10mL容量瓶中。 ?对照品液制蔷 称取中乌头碱、乌头碱、次乌头碱3 1 5mg、1 8mg，分别置于10 mg、2 mL的容量瓶中，用甲醇溶解，定容，摇匀，作为储备液，其他 不同浓度的 对照品溶液山储备液稀释得到。 3 单酯型生物碱测定方法:HPLC法„】。 ?色谱条件 Extend-C1 AgilentZorbax 酸铵缓冲液 氨水调DH】00 ;冼脱程序:0。10min，A为28,;10一15min， A为28―33,(1 0 mL,min。进样量为20“L。 ?供试品溶液制并 取适量浸舒不]III醇定i窬于】0mL容量瓶巾。 ?对照品液制旃 称墩乌头碱、次呜头碱、中-’々头触、苯甲酰乌头原碱、 苯l +酰次鸟头原 38 51 61 碱、苯‘"酰新q头原碱0nag、Omg、O45mg、0mg、047mg、05】 mg， 胃1一同一10mL屠瓶内，用001,盐酸5 1醇溶液 i:f解并 定容至刻度，摇匀，得 质量浓度分别为o38 5l 5 61 47 mg,mL、0 mg,mL、O mg,mL、4mg,mL、0 mg,mL、O5】mg,mL的6个生物碱的X,(tN品液。 224 附子总碱及双酯型生物碱提取工艺研究 f1 提墩溶卉u 在15?条件r，Il_ 烘干药材 l粉3 g，分别置于10倍曲材量的口Hl、3、5盐 酸溶液、水、30,乙醇、50,乙醇、70,乙醇、85,乙醇、95,乙醇、无水乙 醇rh冷浸24h，过滤，滤液燕h参考药典提取方法„i操作。印称取烘干的 2 药粉3 1 混合溶液15mL与氨试液lrnL密塞，摇匀放胃过 g， JiI己醚一氯仿f3 5 mL，振摇1h，过滤。洗液与滤 夜，滤过(药渣:[_?乙醚一氯仿 3:1 混合浒液1 泄台并，燕r，洲浸膏、总碱、3种双酯型生物碱的含量t计算收率和纯度。 2 提取方式 ?冷浸法 祉15?条件F(舣烘1的曲粉3 g，川10倍于药村量的无水乙醇冷浸 24h，