植物过氧化物酶活性测定方法优化

第 29 卷 第 4 期 2010 年 4 月 实 验 室 研 究 与 探 索 RESEARCH AND EXPLORATION IN LABORATORY Vol. 29 No. 4 Apr. 2010 植物过氧化物酶活性测定方法优化 王伟玲， 王 展， 王晶英 (东北林业大学，黑龙江 哈尔滨 150040) 摘 要:以水曲柳、小黑杨、白菜和马铃薯为材料比较了测定方法、测定时间、pH 值及 H2O2 浓度对过氧 化物酶活性测定的影响。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明:过氧化物酶活性测定的最佳时间为 0 ～ 60 s;H2O2 浓度为 0. 5% ～ 2%;磷酸缓冲液 pH 值为 5. 7 ～ 7. 0;联苯胺法比愈创木酚法更为灵敏。该研究结果为用同一提取液测 定多项生理指标提供依据，对植物生理实验教学及相关科学研究有较大的参考价值。 关键词:过氧化物酶;酶活性;愈创木酚;联苯胺 中图分类号:Q 946-33 文献标识码:A 文章编号:1006 － 7167(2010)04 － 0021 － 03 Optimization of Determination Method of Peroxidase Activity in Plant WANG Wei-ling， WANG Zhan， WANG Jing-ying (Northeast Forestry University，Harbin 150040，China) Abstract:The peroxidase is one of the index of plant stress physiology. On the basis，this article researched the effects of different determination methods and determination time and pH of buffer and H2O2 concentration on the peroxidase ac- tivity in Fraxinus mandshurica，Populus simonii × P. nigra，Brassica pekinensis，and Solannum tuberosum. The appro- priate measure conditions are as follows:The range of measuring time of peroxidase is from 0 ～ 60 s and the concentra- tion of H2O2 is from 0. 5% ～ 2% and pH is 5. 7 ～ 7. 0. The method of benzieine is more sensitive than that of guaiacol. Conclusions obtained provide a basis for determination of several kinds of physiology items by using the same extract and have certain referential value for plants physiological experimental teaching and research. Key words:peroxidase;activity of enzyme;guaiacol;benzidine 收稿日期:2009 － 09 － 21 基金项目:黑龙江省科技攻关项目(GC05B604);黑龙江省农垦总 局资助项目(HNKXIV-07-04) 作者简介:王伟玲(1984 － )，女，黑龙江海林人，硕士生，主要研究 方向为植物逆境生理。 通讯作者:王晶英(1962 －)，女，黑龙江密山人，教授，硕士生导师， 主要研究方向为植物逆境生理。 Tel.:0451-82192156;E-mail:wangjingying801@ 163. com 1 引 言 过氧化物酶(Peroxidase，POD)是植物体内普遍 存在的、活性较高的一种酶，它与植物代谢及抗逆性都 有密切关系［1-2］。它的作用具有双重性:① POD 可在 逆境或衰老初期表达，表现为保护效应;② POD 也可 在逆境或衰老后期表达，参与活性氧的生成，是植物体 衰老到一定阶段的产物，甚至可作为衰老指标［3］。在 教学和研究中发现，POD 的测定方法较多［4-6］，即使是 相同的方法，其反应的 pH 值［4-8］、H2O2 浓度也有所差 异，在测定时要求每 15 s 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 一次，记录 3 ～ 5 min，降 低了实验效率。在结果计算中，经常由于反应时间的 取值范围不准确而导致结果错误。为此，本文以水曲 柳、小黑杨、白菜和马铃薯为材料比较了测定方法(愈 创木酚法和联苯胺法)、测定时间、pH 值及 H2O2 浓度 对过氧化物酶活性测定的影响，目的是优化植物过氧 化物酶活性测定方法。在实验材料较少时，此实验结 果可以为用同一提取液测定多项生理指标提供依据。 2 材料与方法 2. 1 供试材料 水曲柳(Fraxinus mandshurica)叶片;小黑杨(Pop- ulus simonii × P. nigra)叶片，白菜(Brassica pekinensis) 叶片;马铃薯(Solannum tuberosum)块茎。 2. 2 试验方法 (1)愈创木酚法。此方法参照李合生的方法［4］， 略有改动。步骤如下:称取一定质量的植物材料放入 研钵中，加入提取液 1 mL(0. 05 mol /L pH 5. 5 的磷酸 缓冲液)，研磨，再加入 9 mL 提取液，将匀浆全部转入 离心管中，4 000 r /min 4 ℃离心 10 min，上清液即酶的 粗提取液。测定酶活性时，将 4 mL 反应混合液(磷酸 缓冲液 2 mL、酶液 1 mL、0. 05 mol /L 愈创木酚 1 mL) 和 1 mL 2% H2O2 加入试管中立即摇匀并迅速倒入比 色皿中，于 470 nm 波长下用 U-2800 型紫外可见分光 光度计比色，立刻记录吸光度值，以后每 30 s 记录 1 次，记录 4 min，以缓冲液代替酶液作对照， POD 活性 = V1·ΔOD 0. 01V2W·Δt 式中:ΔOD 为反应初速度阶段的吸光度差，比色波长 470 nm;Δt 为 ΔOD 对应的时间(min);ΔOD /Δt 为直 线部分的斜率，在此阶段吸光度与反应时间成正比;V1 为提取酶液总体积(mL);V2 为测定时取用的提取酶 液体积(mL);W 为植物样品鲜重(g);0. 01 为以吸光 度值(ΔOD)变化 0. 01 为 1 个酶活性单位(u)。 (2)联苯胺法。此方法参照王晶英的方法［5］，略 有改动。主要步骤如下:基本操作与愈创木酚法相同， 区别在于提取液为 0. 2 mol /L pH 4. 7 的醋酸缓冲液 10 mL，研磨后加几滴甲苯静置 0. 5 h，然后再离心。反 应混合液为 3 mL(l%联苯胺试剂 0. 2 mL、0. 2 mol /L pH4. 7 醋酸缓冲液 1. 8 mL、酶的粗提取液或其稀释液 1 mL)。其他步骤与愈创木酚法相同。 (3)三氯乙酸终止法。此方法参照郝再彬［6，9-10］ 方法，略有改动。主要步骤如下:前部分步骤与愈创木 酚法相同，只是在加入酶液后，立即于 37 ℃水浴中保 温 15 min，然后迅速转入冰浴中，并加入 20% 三氯乙 酸 2 mL 终止反应，再次离心后收集上清液并适当稀 释，470 nm 测吸光度。实验用煮沸 5 min 酶液作对照。 3 结果与分析 3. 1 不同测定方法、测定时间 POD 活性的差异 在 POD 的测定过程中，随着反应时间的进行，愈 创木酚法生成的茶褐色产物和联苯胺法生成的蓝色产 物不断增多，吸光度 OD 不断增大。为寻找最佳测定 时间，4 种植物材料均取 0. 1 g，H2O2 浓度为 2%，磷酸 缓冲液 pH 值为 6. 0。反应体系中加入酶提取液后，每 30 s 记录一次，持续 4 min，以时间 t 对吸光度 OD 作 图，得到的 POD 反应曲线。 从图 1 可见:愈创木酚法中水曲柳吸光度很快达 到 3. 0，增加率也较为恒定，即反应处于初速度阶段; 小黑杨、白菜、马铃薯 90 s 内 OD 平稳增加，属于初速 度阶段，随后曲线变平缓。联苯胺法变化更明显，水曲 柳的 SOD 活性很强，吸光度 3 以下，其时间进程曲线 接近于直线。其他 3 种植物反应前期为直线，之后 OD 增幅逐渐变小，在 180 s 之后，OD 甚至有下降。如果 反应时间过长，OD 的增加量不断降低甚至为负值。 (a)愈创木酚法 (b)联苯胺法 图 1 POD 测定中吸光度 OD 与时间 t 进程曲线 表 1 为小黑杨(联苯胺法)不同测定时间的 ΔOD /Δt值，A、B、C、D 4 点在一条直线上(见图 1)，不 论 Δt = 30 s 还是 60 s，通过这 4 点计算的 ΔOD /Δt 值， 基本相近，在 0. 008 7 ～ 0. 009 0，E、F 点的 ΔOD /Δt 逐 渐降低。因此 Δt 的取值范围，一定要在反应初速度范 围内，酶活性与 ΔOD / Δ t值呈正相关。本实验选取 表 1 小黑杨(联苯胺法)不同测定时间的 ΔOD /Δt 值 测定点 A B C D E F t / s 0 30 60 90 120 150 OD 0. 51 0. 77 1. 04 1. 30 1. 53 1. 67 Δt = 30 s 30 ～ 0 60 ～ 30 90 ～ 60 120 ～ 90 150 ～ 120 ΔOD(Δt = 30 s) 0. 26 0. 27 0. 26 0. 23 0. 14 ΔOD /Δt(Δt = 30 s) 0. 008 7 0. 009 0 0. 008 7 0. 007 7 0. 004 7 Δt = 60 s 60 ～ 0 90 ～ 30 120 ～ 60 150 ～ 90 ΔOD(Δt = 60 s) 0. 53 0. 53 0. 49 0. 37 ΔOD /Δt(Δt = 60 s) 0. 008 8 0. 008 8 0. 008 2 0. 006 2 22 实 验 室 研 究 与 探 索 第 29 卷 0 ～ 60 s 较好，不用 3 min 或更长时间。若选取的时间 范围过大，一是计算出的酶活性也许会偏低;二是降低 了实验效率。 由图 1 还可以看出，联苯胺法测定的酶活性较愈 创木酚法大，但如果反应时间超过 120 s，酶活性又大 幅度降低，说明此方法测定 POD 比较灵敏，但其产物 不稳定。 3. 2 H2O2 浓度对 POD 的影响 用愈创木酚法研究了 H2O2 浓度对 POD 活性测定 结果的影响，设置其浓度分别为 0. 1、0. 25、0. 5、1、2、 4、8%，小黑杨取样 0. 1 g，白菜取0. 2 g，其余测定条件 相同，结果如图 2 所示。 图 2 不同 H2O2 浓度下的 POD 活性 由图 2 可见，在 H2O2 浓度 0. 1% ～ 8%，随着 H2O2 浓度的增加，小黑杨和白菜的 POD 活性均下降， 当 H2O2 浓度为 8%时，两者活性最低且几乎相同，说 明过高的 H2O2 浓度对酶反应起强烈的抑制作用， H2O2 浓度在 0. 1% ～ 2%，两者的差异较明显，但 H2O2 作为反应底物，浓度太低不能满足反应的需要。平衡 考虑，测定 POD 活性的 H2O2 浓度为 0. 5% ～ 2%。 3. 3 pH 值对 POD 的影响 用愈创木酚法测定 POD 活性时，不同实验书中所 用磷酸缓冲液(提取液、反应液)pH 值不同:pH = 5. 5、 6. 0、7. 0 等。本文研究了不同 pH 值对 POD 活性的影 响。H2O2 浓度取 0. 5 %，其余测定条件相同。结果如 图 3 所示。小黑杨、白菜和马铃薯的 POD 活性有相似 的变化趋势，随着 pH 值的增加，POD 活性先升高后下 降，pH 在 5. 7 ～ 7. 0 均能测出不同植物材料的 POD 活 性，并且数值的变化趋势一致，最适 pH = 6. 0。 图 3 不同 pH 值下的 POD 活性 在植物逆境生理研究中，POD、SOD(超氧化物歧 化酶)、MDA(丙二醛)等指标测定时，其样品提取缓冲 液都要求用磷酸缓冲液，但 pH 不同，由于 pH 在 5. 7 ～ 7. 0 POD 活性有一致的变化趋势，所以当实验材料 较少时可以考虑将 POD 与 SOD、MDA 等指标用同一 个提取液测定。 3. 4 利用三氯乙酸终止法进行的测定 除以上 2 种方法外，本实验还试图用加 20 %三氯 乙酸 2 mL 终止反应，但从冰浴中取出后应有的茶褐色 消失，ΔOD(OD 反应液—OD 对照液)接近于零，多次 重复均无结果，所用 4 种植物表现一致。分析原因可 能是加酸使溶液浓度变低，茶褐色产物在酸中不稳定 或冰浴使其分解。而每次用不同煮沸的酶液作对照增 大实验误差，又用掉很多不必要的时间。李忠光等也 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 用酸终止法能测出的值偏低，不宜采用此方法测 定 POD 活性。 4 结 语 通过以上研究分析发现，计算 POD 活性所取最佳 时间范围 0 ～ 60 s;合理的 H2O2 浓度为 0. 5% ～ 2%， 浓度越小，活性越强;缓冲液 pH 在 5. 7 ～ 7. 0 均能测 出不同植物材料的 POD 活性，测定结果具有可比性， 最适 pH 为 6. 0;联苯胺法更为灵敏，但反应产物不太 稳定;三氯乙酸终止法不适合某些植物。本实验为用 同一提取液测定多项生理指标提供依据。 参考文献(References): ［1］ 王晶英，赵雨森，王 臻，等 . 干旱胁迫对银中杨生理生化特性 的影响［J］. 水土保持学报，2006，20(1):197-200. ［2］ 缴丽莉，倪志云，路丙社，等 . 低温胁迫对青榨槭幼树抗寒指标 的影响［J］.河北农业大学学报，2006，29(4):44-47. ［3］ 张蜀宁，张振超，张红亮，等 . 低温胁迫对不同倍性不结球白菜 生长及生理生化特征的影响［J］. 西北植物学报，2008，28(1): 109-112. ［4］ 赵丽英，邓西平，山 仑 . 活性氧清除系统对干旱胁迫的响应机 制［J］. 西北植物学报，2005，25(2):413-418. ［5］ 王晶英，敖 红，张 杰，等 . 植物生理生化实验技术与原理 ［M］. 哈尔滨:东北林业大学出版社，2003:79-81. ［6］ 李合生 .植物生理生化实验原理和技术［M］. 北京:高等教育出 版社，2000:164-165. ［7］ 郝再彬，苍 晶，徐 仲 . 植物生理实验［M］. 哈尔滨:哈尔滨工 业大学出版社，2004:115-116. ［8］ 张以顺，黄 霞，陈云凤 . 植物生理学实验教程 . 北京:高等教育 出版社，2009:139-140. ［9］ 陈建勋，王晓峰 . 植物生理学实验指导［M］. 广州:华南理工大 学出版社，2006:72-73. ［10］ 王学奎 .植物生理生化实验原理和技术［M］. 北京:高等教育出 版社，2006:167-168. ［11］ 刘 萍，李明军 .植物生理学实验技术［M］. 北京:科学出版社， 2007:123-125. ［12］ 李忠光，龚 明 . 愈创木酚法测定植物过氧化物酶活性的改进 ［J］.植物生理学通讯，2008，44(2):323-324. 32第 4 期 王伟玲，等:植物过氧化物酶活性测定方法优化