免疫组织化学技术及应用 2

null 免疫组织化学技术及应用 前言 医学的目的是解除人体的病痛，其核心是疾病的诊断和治疗两个环节，而这两个环节的关系可以明确为：任何疾病的有效治疗均来源于正确的诊断。在当今医学发展的现状下，虽然疾病的诊断手段有几十种之多，但就其准确性来说，首推病理诊断准确性高，即病理组织学诊断要比化验、放射、核素等任何一种诊断方法更准确、更可信、更有权威性。而在病理诊断的大家族中，免疫组织化学（简称免疫组化）已成为其中的一种常有手段。 免疫组织化学技术及应用 前言 医学的目的是解除人体的病痛，其核心是疾病的诊断和治疗两个环节，而这两个环节的关系可以明确为：任何疾病的有效治疗均来源于正确的诊断。在当今医学发展的现状下，虽然疾病的诊断手段有几十种之多，但就其准确性来说，首推病理诊断准确性高，即病理组织学诊断要比化验、放射、核素等任何一种诊断方法更准确、更可信、更有权威性。而在病理诊断的大家族中，免疫组织化学（简称免疫组化）已成为其中的一种常有手段。 null我们从以下几个方面来介绍： 概述 免疫组化的理论和技术 免疫组化结果判断 免疫组化应用 常用抗体介绍null 概 述 null一、概念： 免疫组织化学（immunohistochemistry），或免疫细胞化学(immunocytochemistry)，是利用抗原抗体反应来定位、定量研究组织和细胞中的某种化学成份的技术, 是免疫学和传统的组织化学互相结合而发展起来的，也可以说是原位免疫学（in situ immunology） null 年代 研究者 事件 1941年 Coons 实用免疫荧光技术 1948年 Fagraeus 进一步发展免疫荧光技术 1970年 Sternberger 抗体酶标记技术 1974年 Tyalor 证实组织中的浆细胞免疫组化 1975年 Kohler和Milstein 单克隆抗体技术 1981年 Hsu ABC法 90年代以来 SP法、原位杂交、原位PCR等 二、免疫组化的发展过程三、IHC的优点三、IHC的优点定位（in situ）准 特异性（specificity）强 灵敏度（sensitivity）高 形态学改变与功能和代谢结合 多重标记和定量分析 可用存档的蜡块，回顾性研究null 免疫组化的理论和技术null 一、基本原理 抗原（antigen）是一种化学物质 →免疫系统→ 相应的抗体（antibody），并能在体内和体外特异性结合 →抗原-抗体复合物。 机体的免疫活性淋巴细胞在抗原的刺激下成为致敏淋巴细胞，进而分化、增殖为记忆细胞和淋巴母细胞，后者再分化为浆细胞，产生和分泌相应的抗体。null抗原抗体标记物null二、抗原和抗体： （一）抗原 ： 1、抗原的概念 进入机体后凡能刺激机体产生抗体（antibody, Ab），并能与相应的抗体发生特异性结合的物质成为抗原（antigen，Ag） 物质的这种特性称为抗原性（antigenicity） 抗原决定簇（antigen determinant, Epitope）：决定抗体的特异性的位于抗原分子 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面的一些特殊的化学结构和空间构型null抗原的抗原性 免疫原性，指抗原进入机体后能刺激免疫系统产生生成抗体 反应原性，即能与相应的抗体发生特异性的结合 具有免疫原性和反应原性的物质，叫做完全抗原 只有反应原性而不具备免疫原性的物质叫做半抗原（hapten） null抗原不单指能引起抗体生成的物质，还包括能引起免疫系统的T淋巴细胞致敏产生淋巴因子，并能与相应的淋巴因子反应的物质 目前对于抗原的定义为：能刺激机体的免疫系统产生免疫应答，即产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生特异性结合的物质null2、抗原的性质： 按照来源的不同，抗原可分为： 细胞结构抗原，包括：细胞膜成份，如桥粒蛋白；细胞器，如角蛋白等 细胞分泌物，如黏液、激素等 沉积抗原，如免疫球蛋白 入侵抗原:如细菌、病毒、药物、异物等.null 按照物理性质和抽提方法的不同， 抗原又可分为： 可溶性抗原：蛋白质属于可溶性抗原 颗粒性抗原：细胞结构成份、细菌、病毒等属于颗粒性抗原 颗粒性抗原一般具有较可溶性抗原更强的免疫原性null3、抗原的保存 如何保存抗原的反应原性，使得Ag-Ab反应能顺利进行，十分重要 组织取材后，为防止细胞自溶，减少抗原的扩散与失活，一般采取两种方法：及时液氮低温保存，或液氮速冻后低温冰箱保存。在此后的切片、干燥和染色过程中，均应当注意温度不要高于40℃ 固定, 一般用10%的缓冲福尔马林固定, 在此后的浸蜡、包埋、切片和染色过程中, 温度不宜超过60℃null（二）抗体 1、抗体概念： 抗体（antibody，Ab）是机体受抗原刺激后，由B细胞及其衍生物（浆细胞）分泌的一类能与相应抗原 特异结合的球蛋白，称为免疫球蛋白（immunoglo- bulin, Ig）null2、抗体的基本结构 人类的Ig有五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE Ig的基本结构是相似的，是由两条相同的重链（Heavy chian, H）和两条相同的轻链（Light chain, L）组成的大分子蛋白质 可变区（Variable region, V） 恒定区（Constant region, C） 值得注意的是一个抗体分子有两个相同的V区，因此一个抗体分子有两个抗原结合部位（双价）null抗体的基本结构null3、抗体的分类 抗体可分为多克隆（polyclonal antibody，PcAb）和单克隆（monoclonal antibody, McAb） PcAb 由纯化抗原注射免疫动物后提取动物血清纯化后制成. 粗制的血清称为抗血清. 由于一般的蛋白质抗原含有多个不同的抗原决定簇, 免疫动物后动物体内产生了许多针对不同的抗原决定簇的B细胞克隆, 分泌的抗体因此是许多V区结构不同的抗体的混合物. PcAb具有敏感性较高, 价格低等优点.但在特异性和稳定性等方面不如McAbnullMcAb 将抗原免疫小鼠后, 用小鼠脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞株在一定的条件下融合, 形成具有长期存活并能分泌抗体的杂交瘤（hybridoma）细胞, 将其分离培养后可形成单个瘤细胞的克隆. 培养上清或将杂交瘤细胞注入裸鼠腹腔产生的腹水中都含有瘤细胞分泌的Ig, 这就是McAb. 由于McAb是由一个瘤细胞及其后代产生的, 它只针对一个抗原决定簇, 所有的抗体分子在结构上是完全一致的, 因此是最纯的抗体. 虽然成本较高,但它的高度特异性和稳定性是PcAb所无法比拟的 null多克隆抗体和单克隆抗体的比较多克隆抗体和单克隆抗体的比较多克隆抗体和单克隆抗体的比较 PcAb McAb 针对的抗原决定簇 多个 单一 产生Ig的B细胞克隆 多个 单一 特异性 ＋ ＋＋＋ 敏感性 ＋＋＋ ＋＋ 背景染色 ＋ ± 与其它抗原的交叉反应 ＋ － 各批Ab之间的特异性 和亲和性的可重复性 不一 不变 价格 低 较高 null4、抗体的购置 商品化抗体 最好购买DAKO、SIGMA、ZYMED、VICTOR LAB等国际知名的公司的原装产品 DAKO公司小包装原装抗体（0.1~0.2ml） 即用型抗体不需要稀释，可以直接使用，价格较低，对于研究生和基层病理科十分适用 null5、抗体的保存 在保存和运输时要考虑的最重要的两个因素是容器和温度 容器最好的是用聚丙烯或硼玻璃容器 容器的密封一定要严 最好是直接用原装抗体，每次使用时用微量移液器吸出(一定要用干净的吸头)所需的数量后，立即封严瓶盖，放入4℃冰箱保存（抗体是蛋白，不能放入更低的温度） 稀释后的抗体应当在当天使用, 未用完的在4℃可存放1~3天, 还可用. 一周后效价将显著下降, 不宜再用null6、抗体的标记 Ag-Ab产生特异性结合后，其Ag-Ab复合物是不可见的。为了使得反应的结果可见，必须将抗体加以标记并利用标记物与其它物质的反应将阳性的结果放大后转换成可见的发光或显色null从理论上讲，理想的标记物应具有以下的特点： 能与抗体形成比较牢固的共价键结合 不影响抗体与抗原的结合 放大的效益高 发光或显色反应要在抗原-抗体结合的原位并且鲜明，有良好的对比 经过几十年来不断地筛选, 目前较为成熟的标记物有: 异硫氰酸荧光素和四甲基异硫氰酸罗丹明, 辣根过氧化物酶, 碱性磷酸酶, 铁蛋白, 胶体金, 葡萄球菌A蛋白, 生物素和放射性同位素等null（1）荧光标记物和荧光抗体 异硫氰酸荧光素（fluorenscein isothio- cyanate, FITC） FITC是一种分子量为389 D的黄色结晶粉末.FITC的最大吸收光谱为490~495 nm. 最大发射光谱为520~530 nm, 为明亮的黄绿色荧光. 通过FITC的硫碳胺键与Ig中赖氨酸的ε-氨基在碱性条件下结合,ε-氨基碳酰胺化形成硫碳氨基键, 构成FITC-Ig结合物. 一个IgG分子含有86个赖氨酸残基, 最多能结合15~20个FITC分子.一般可结合2~8个null四甲基异硫氰酸罗丹明tetramethyl rhodamine isothiocyanate（TRITC） 是一种紫红色的粉末。最大吸收光谱为550 nm， 最大发射光谱为620 nm。为橙红色荧光。与FITC的黄绿色荧光对比十分鲜明。多用于双重标记荧光染色 现在常用的还有藻红蛋白（PE）、叶绿素蛋白（PerCP)nullnull荧光标记抗体的使用范围和优缺点 在IHC技术发展的早期，IF（免疫荧光）得到较多地使用。免疫酶标记抗体出现后，IF的应用有所减少 由于IF有其独特的能对活细胞进行染色的优点，以及在组织培养细胞、肾炎、皮肤免疫性疾病的研究和诊断，病原体及自身抗体的检测等方面，null在McAb出现后，荧光标记的McAb在流式细胞术(flowcytomitry, FCM)，荧光激活细胞分类器（fluorescein activated cell sorter, FACS），激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy，LSCM）， ISH以及新发展的DNA自动测序，生物芯片等得到越来越广泛的应用null（2）酶标记物和酶标抗体 理想的标记酶应当是： 酶的活性高并且稳定 终产物稳定，不扩散，有良好的定位 酶与抗体结合不影响Ag-Ab的特异性反应 在组织与体液中不存在内源性的酶及其底物。在实际上没有一种酶能满足理想的条件 效果好又应用最多的是辣根过氧化物酶（HRP)和碱性磷酸酶(AP)null 辣根过氧化物酶（HRP) HRP为一种稳定性好的标记酶，在pH3.5~12范围内稳定，60℃加热15分钟不失活。分子量仅为40 000，故穿透性较强。其活性较高，溶解度大，等电点为7.2。是相当理想的标记酶。HRP的抑制剂有叠氮纳（NaCN3）、重铬酸钾、氰化物和氟化物等nullHRP的底物为H2O2。催化反应式为： → HRP + H2O2 = HRP. H2O2 HRP. H2O2 + DH2 → HRP + D + 2H2Onull要注意的是，在正常组织细胞中，如粒细胞、骨髓造血细胞中均含有丰富的内源性过氧化酶。成熟红细胞所含的伪过氧化酶也可使DAB显色。因此在过氧化物酶染色中一般要用3%过氧化氢水溶液或1%过氧化氢-甲醇液处理切片以阻断其内源性过氧化酶，以避免造成假阳性。这在冰冻切片时尤其重要nullDAB作为联苯胺类物质， 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 在动物中有致癌性。操作时要戴手套，尽量避免接触DAB原粉或溶液。建议将DAB以3-5mg分装于干净的青莓素瓶中，密封存于避光处。每次显色时，加入10ml缓冲液，避光过滤后尽快使用。用后剩余的DAB液亦不宜直接排放入下水道。最好以金属容器密封收存，交有关部门处理nullnull 碱性磷酸酶(AP) AP为分子量80,000的水解酶，最佳反应pH值8.9，活化剂为Mg++、Mn++。抑制剂有Zn++、Be++、PO4=、AsO4=、CN-、EDTA等。AP在碱性环境下，可催化下列水解反应: 磷酸萘酯 + H2O →α-萘酚 + 磷酸盐 α-萘酚 + 偶氮染料 →有色沉淀↓ null内源性AP的广泛存在。在肝、胎盘、小肠绒毛、骨基质、肾小管上皮等处均有活性很高的内源性AP。在冰冻切片和细胞涂片染色时对阳性反应产物的干扰尤为突出。需要在孵育液中加入左旋咪唑抑制内源性AP的活性。石蜡包埋组织中，除小肠上皮外，内源性AP基本上被灭活。AP标记抗体尤其适用于血细胞和骨髓涂片的IHC染色。因为造血组织中的内源性HRP特别强烈nullCD20 (red) positive small lymphocytic lymphoma免疫荧光技术和免疫酶技术的比较免疫荧光技术和免疫酶技术的比较 IF IPO 组织学 差 好 背景染色 ＋？ ± 是否需要冰冻切片 是 不必 可否用于石蜡切片 否？ 可以 染色后切片保存时间 一周 几年以上 可否用于电镜 否 可以 可否用于活细胞染色 可以 否 是否需要荧光显微镜 是 否 null（3）其它标记酶与非酶性标记物 葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶等，但未能得到广泛地使用 胶体金，铁蛋白，藻红蛋白等标记物也被应用。尤其是在免疫电镜中，胶体金与铁蛋白是两种主要的标记物。藻红蛋白是新发现的一种从植物叶绿素中提取的蛋白.在受到与FITC相同的激发光照射时,发出亮红色的荧光，可以与FITC同时用于双重标记null（4）亲和组织化学标记方法 亲和物质对的发现，如生物素与亲和素、葡萄球菌A蛋白与IgG的Fc片段、配体与受体等等，IHC技术从Ag-Ab的特异反应发展到更为广泛的利用亲和物质对的特异结合反应进行标记，放大信号及显色的阶段。就是亲和组织化学（affinity histochemistry） 亲和组织化学技术的发展使反应的灵敏度大为提高，非特异反应大为降低null 亲和组织化学 免疫组织化学 原位杂交 凝集素,激素 抗体 核酸 生物素标记 标记卵白素 ABC复合物 荧光素 铁蛋白 金 过氧化物酶 过氧化物酶 银 光镜 光镜,电镜 光镜,电镜 null生物素和亲和素系统 生物素和亲和素的化学结构与性质 生物素（biotin）是一种分子量为244，等电点为3.5的环性分子，分子式为C10 H16 C3 N2 S。生物素在体内是羧化酶的辅酶，曾命名为维生素H或辅酶R null亲和素（avidin）又称卵白素或抗生物素蛋白。是分子量为68KD的碱性蛋白。等电点为10.5。由4个128个氨基酸组成的亚基构成 1分子亲和素可与4分子生物素结合。二者的结合为非共价键结合，为不可逆反应。亲和常数KA达到1015M-1 。是自然界中已知的两种物质最紧密的结合之一。比Ag-Ab结合力大106倍。只有在pH1.5的条件下才能将二者完全分离null生物素-亲和素系统的优点 生物素分子量小，一分子抗体可结合多达150个生物素分子 与抗体分子结合（生物素化）后，不影响抗体与抗原结合的能力 多种酶与生物素结合后，其催化活性也不受到很大地影响 亲和素也可与荧光素、酶等标记物偶联 上述特点决定了生物素与亲和素是极为理想的一对亲和物质对，为它们在各个领域的广泛应用奠定了基础 null生物素-亲和素系统的缺点 体内也存在内源性的生物素，如肝、肾、肥大细胞等 近年来链亲和素（streptavidin）代替常规的亲和素。链亲和素分子量为60KD，等电点为中性，故不与内源性生物素结合 null葡萄球菌A蛋白与IgG 葡萄球菌A蛋白（staphylocoal protein A,SPA）是金黄色葡萄球菌细胞壁的一种蛋白成份，分子量为42KD，pI为5.1。含有4个高度相似的Fc片断结合区，对热稳定。SPA能与人和多种哺乳动物的IgG的Fc片断非特异结合。这种结合是双价的，即1分子SPA能与2个IgG分子结合。利用这一特点，可以将APA与荧光素/酶等结合后作为IHC中的第二抗体使用null其他的亲和物质对 凝集素及糖结合物（lectin and glycoconjucates） 雌、孕、雄激素及其受体 三、免疫组织化学的主要染色方法 直接法 间接法 酶桥法 PAP法 APAAP法 ABC法 三、免疫组织化学的主要染色方法 直接法 间接法 酶桥法 PAP法 APAAP法 ABC法 null（一）直接法（direct method，又称一步法） 直接法的优缺点和应用范围 直接法的优缺点和应用范围特异性高，但敏感性较低 每种抗体均需要单独标记，十分不便 现由于已经有大量的标记好的商品化抗体，已经得到较为广泛的运用 流式细胞术用于测定各种CD系列抗原 免疫荧光染色中用于免疫细胞的双重测定 在检测乳腺癌的雌激素、孕激素受体时荧光标记抗体仍然是标准的方法 在激光扫描共焦显微术，任何物质只要能够自发荧光或者由荧光标记，都可以检测（二）间接法（indirect method, 又称sandwith method,夹心法）（二）间接法（indirect method, 又称sandwith method,夹心法）间接法的优缺点和应用间接法的优缺点和应用可用于检测抗原或抗体 敏感性是直接法的3~4倍，特异性低于直接法 最大的优点在于不必标记每一种第一抗体，而只要有抗一种动物的标记抗体，就可用于此种动物的多种第一抗体 第一抗体的工作稀释度较直接法高得多，即同样体积的一抗用间接法较直接法可着染更多的切片 间接法还可省去一抗，用PBS代替，作空白对照。（三）未标记抗体法（三）未标记抗体法由于抗体和酶或荧光素以化学方式结合后，或多或少地降低了抗体和抗原结合的能力，并且对标记物的活性也有影响，所以不用化学方法使抗体和标记物结合的方法得到发展 Mason等1969年报告了酶桥法 Sternberger等1974年报告了PAP法 1、酶桥法(enzyme bridge technique)1、酶桥法(enzyme bridge technique)酶桥法的缺点酶桥法的缺点 酶桥法大大地提高了反应的敏感性 缺点是游离的酶难以精确地稀释到所需要的浓度，以达到和三抗的抗酶部位全部结合 与组织中其它成份非特异结合的酶也难以全部洗去，因此背景染色较重 此法未得到广泛地使用2、PAP法 PAP法的优点和应用2、PAP法 PAP法的优点和应用在酶桥法的基础上改进而成。将游离酶和抗酶抗体在使用前先制成稳定的酶-抗酶抗体复合物（PAP复合物），再稀释后使用，解决了酶与抗酶抗体的比例难以确定的问题 经测定PAP复合物由两分子抗酶抗体和3分子酶组成，为直径20.5nm的环形分子，分子量432kd。小而稳定的PAP复合物的穿透性较好，容易达到抗原部位 较间接荧光法敏感约20倍，较间接酶标法敏感约100倍，而且非特异染色极轻微。故得到了广泛地使用PAP法的关键PAP法的关键PAP复合物中的抗酶抗体必需与第一抗体为同种动物所产生 第二抗体必需过量，以保证第二抗体分子的两个结合部位分别与一抗和抗酶抗体结合 null（四）APAAP法（四）APAAP法APAAP是碱性磷酸酶（AP）-抗碱性磷酸酶抗体（anti-AP）复合物的简称 此法由Mason等1983年首次报告 用AP取代PAP法的过氧化物酶（P）而成，原理与PAP法相似 APAAP法由于避免了使用有致癌嫌疑的DAB，显色对比好，在国外得到广泛地使用 null（五）ABC法（Avidin-Biotin-Complex method）（五）ABC法（Avidin-Biotin-Complex method）有直接与间接两种 直接ABC法以生物素标记的抗体与抗原反应后，洗去未结合抗体，再以卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC复合物)与之结合，显色。 间接ABC法是用生物素化的二抗与一抗反应后，再与ABC复合物结合 间接ABC法在1981年由许世明推出后，迅速成为IHC的标准方法，并广泛地运用在ELASA，核酸分子杂交等方面 ABC法的关键 ABC法的关键ABC复合物的配制 ABC复合物在使用前半小时由等体积的A液和B液稀释而成。A液为亲和素液，B液为生物素结合的过氧化物酶液。配制成的ABC复合物中的一个亲和素分子只结合三个与酶交联的生物素分子，而留下一个结合位置给二抗上的生物素 与PAP法相比较，ABC法的最大优点是敏感性高，是PAP法的20至40倍。其次是背景清晰。尤其适用于单克隆抗体nullnullnullPAP法和ABC法的比较PAP法和ABC法的比较 ABC法 PAP法 敏感度 20-40 1 非特异性染色 几乎没有 一般有 复合物 ABC复合物可与生物素 PAP复合物只能与 化的任一种抗体结合 同种动物的一抗配套 复合物用前配制 复合物预先制成 生物素可与多种物质结合 仅能用于酶 应用范围 IHC,ELISA,核酸杂交等 IHC ABC法的变型 ABC法的变型 LAB法，LsAB法，ABPAP法，EnVision法，CSA法等 LAB法则用亲合素分子直接与酶分子结合，形成酶-亲合素复合物（enzyme-labelled avidin），再与生物素标记的二抗结合。故名LAB法（labelled-avidin-biotin）。LsAB法则以链亲合素（streptavidin，SA）代替亲合素（又称S-P法），LAB法较ABC法大约敏感4~8倍，而LsAB法采用的链亲合素由于避免了与切片中的内源性生物素结合的可能，其特异性更高。现在以LsAB试剂替代ABC试剂已得到广泛地使用（六）提高免疫组化敏感性的新方法（六）提高免疫组化敏感性的新方法EnVision二步法 催化信号放大法(catalyzed signal amplification, CSA) 抗原修复法(antigen retrieval,AR)1、EnVision法1、EnVision法原理:抗原和非标记第一抗体结合后，再与标记有多聚葡聚糖-酶复合物的第二抗体结合。实际上是间接法的更新。 优点： 由于多聚物酶上结合有多个酶分子，使得信号放大作用比较传统的ABC法高出几十倍。 背景染色极少，因为多聚葡聚糖在人体内不存在，无非特异性干扰。 染色时间短。半天出片。 试剂已经商品化。2、催化信号放大法（catalyzed signal amplification,CSA法）2、催化信号放大法（catalyzed signal amplification,CSA法）原理：一抗和抗原结合后，加生物素化的二抗，再加链亲和素-HRP复合物。（LsAB法）。再加生物素化酪胺基团分子，后者在HRP的催化下，立刻在抗原抗体结合部位形成一个共价结合位点。使得大量的生物素沉积在此处。再加入链亲和素-HRP复合物后，再结合上大量的复合物，使得信号呈几何级数的放大。nullCSA法的优点： 敏感性较常规LSAB法高1000倍。 应用在免疫组织化学和原位核酸分子杂交中。 Immunohistochemistry Sensitivity Chart:Immunohistochemistry Sensitivity Chart:Standard Moderate Most Sensitivity Sensitivity Sensitivity ABC Method, EnVision, CSA Method, PAP Method, EnVision+, CSA II Method LSAB Method ImmPRESS小结 免疫组化染色方法选择的原则小结 免疫组化染色方法选择的原则要根据需要证明的抗原的种类，标本中的抗原保存情况，实验的精度要求和实验室的条件来选择最佳的方法。简单来说，就是五个"S" Specificity，最为重要。特异性的计算方法为： 特异性=观察的阴性结果数/预期的阴性结果数×%. SensitivitynullSimplicity，简便性。在达到要求的前提下，越简单的方法，越能节约时间和经费。如能用PAP法就不要用ABPAP法 Safely，安全性。免疫组化操作要使用DAB，酸，碱，二甲苯，过氧化氢等有害物质。不仅对操作者有一定的危害，对环境也有一定的污染。在选用方法时，如果条件允许，应尽量用对人体危害小的方法 Save of time and money，即省时省钱。实际上与第二条简便性相似。简单的方法一般省时省钱 null总之，在方法的选择上，最为重要的是特异性。其他的条件要在满足特异性后才考虑。 四、组织和细胞样本的准备和处理，抗原修复 （一）标本的收集与处理 （二）标本的来源和分类 （三）标本的取材与储存 （四）新鲜标本的进一步处理 （五）细胞学标本的取材和储存 （一）标本的收集与处理（一）标本的收集与处理Good results = good samples + proper method 决定免疫组化染色结果的条件除了染色法外，就是标本的处理。在实际工作中，常常由于标本的处理欠佳，而导致染色失败。因此组织和细胞的收集和处理万万不可轻视。这方面的教训在研究生的科研实践中累见不鲜。 目的：save the antigen and keep the morphology as far as possible（二）标本的来源和分类（二）标本的来源和分类人体标本 试验动物标本 新鲜的未固定的标本 已固定的（蜡块） 组织 细胞（三）组织标本的取材与储存（三）组织标本的取材与储存人体组织的免疫组化一般要求手术活检或内镜活检标本。尸体解剖标本由于自溶较重，抗原分解或扩散，故作免疫组化效果一般不好。 对于活检标本的取材与储存而言，原则是应尽快地将组织固定或冻存，以尽量减少抗原的破坏。null大组织，如外科手术切除标本，应在手术后尽快取材，再次固定。取材时应注意不要取坏死出血区。因为大组织的固定一般不良，尤其是肿瘤包块内部，如不切开，很难达到良好的固定 小组织，如内镜活检，以及宫颈、鼻咽、口腔、皮肤、喉、骨髓活检等，取材后应立即放入装有固定液的小瓶中null标本的标识和送达 写明病人的姓名，性别，年龄和取材部位 仔细地填写病理申请单 防止污染 null如果要活细胞的新鲜标本，应在手术时尽快取材，如细胞培养、流式细胞术等 对于提取组织DNA和RNA，一般将小块组织速冻于-20℃即可 如果需用新鲜未固定组织（如激素受体检测），应立即装入有生理盐水的小瓶中，封口后写明病人的姓名，年龄性别部位，连瓶装入冰壶，在一小时内送到 （四）新鲜组织的进一步处理（四）新鲜组织的进一步处理立即作冰冻切片，如快速病理诊断、雌激素受体检测 多数是将组织以生理盐水或OCT(羧甲基纤维素)包埋后，放入液氮中速冻，然后置-70℃的低温冰箱中保存至需要时null在液氮速冻时，组织块应不大于1×1×0.4 cm，先用一张大小适当的铝箔纸，放入组织，以OCT覆盖组织，包好纸，写上标记和编号，放入塑料瓶盖或塑料盒中，密封。浸入液氮时先应将组织置于液面上数秒，待组织初步冷冻后再浸入液氮。否则组织容易冻裂。 取出组织进行冰冻切片或DNA提取时，可用37℃加温或微波速融，以免组织结构受到破坏。组织标本的处理和用途组织标本的处理和用途组织 固定 不固定 冻存 包埋 冻存 冰冻切片 细胞培养 DNA，RNA提取 固定 不固定 光镜免疫组化 分子生物学 光镜免疫组化 电镜原位杂交 原位杂交 原位杂交（五）细胞学标本的取材和储存（五）细胞学标本的取材和储存 细胞学涂片 细胞离心涂片 形态学，IHC，ISH 细胞离心后包埋制片 活细胞 细胞培养 冻存 DNA提取，分子生物学实验 细胞悬液 IF，流式细胞术，LSCM null 细胞材料的来源： 周围血分离的白细胞，穿刺细胞，胸腹水，脑脊液，尿，宫颈分泌物，手术取材，培养细胞等免疫组织化学结果判断 免疫组织化学结果判断 null 一、免疫组化标记的形态学特征 免疫组化标记具有形态学特点，若能熟练掌握，有助于对免疫组化结果的正确判断。现择要分述如下： null（一）阳性色度标记特征： 免疫组化标记时细胞阳性染色程度取决于抗原含量、分布密度、标记方法及其敏感性。阳性标记显色程度分为：淡黄色（弱阳性），棕黄色（中等阳性），棕黑色（强阳性）。null（二）阳性标记细胞学特征 免疫组化标记中，阳性标记细胞学特征是反映抗原在细胞内的定位及分布情况。在诊断中以拟标记的细胞为前提，阳性表达必须在细胞特定的抗原部位，若不在抗原所在部位的阳性表达或非目标细胞即使阳性也不能作为判断依据。根据抗原在细胞中分布和阳性颗粒沉淀部位可分为以下 　5种类型：null１、胞膜型：阳性颗粒主要分布于细胞膜表 面，形成一薄层棕黄色颗粒包绕整个细 胞。此类型常见于某些膜抗原，如： EMA，LCA，B细胞，T细胞，粒细胞相关 抗原（GAA）等。nullnull2、胞核型：阳性颗粒定位于细胞核，呈均匀 分布或位于核膜下，有的呈小斑块妆不均 匀分布。如：PCNA，KI-67，ER，PR， P53等。nullnull3、胞浆型：阳性颗粒主要分布于细胞浆。大部分抗原属于该类型。如：细胞角蛋白、波形蛋白、肌动蛋白、结蛋白、前列腺特异性抗原（PSA）等。根据抗原在胞浆内分布形式，通常表现为弥漫性分布或局限性分布。nullnull4、微绒毛型：抗原颗粒主要分布于腺癌细胞的微绒毛，而胞浆或胞膜可以是阳性或阴性表达。这种表现形式最常见于各种腺癌。其特点是阳性颗粒除靠近腔面阳性外，其基底部可呈阴性反应。在肿瘤标记物中多见于上皮膜抗原、上皮特异性抗原、结肠相关抗原、卵巢癌抗原等。null5、复合型：在常规免疫组化标记中同一种抗原可以同时表达于胞膜和胞浆、胞核和胞浆、微绒毛和胞浆，但很少发现胞膜和胞核同时表达。值得注意的是，组织标本固定不及时造成抗原移位或乳腺ER和PR修复不充分也可以发生胞膜和胞核同时阳性。nullnull（三）阳性标记组织学特征 根据免疫组化阳性细胞的组织学特点，免疫组化阳性细胞或阳性颗粒可呈以下类型排列： 　1、局灶型　　　　5、腺管型 　2、弥漫型　　　　6、腔缘型 　3、片块型　　　　7、菊团型 　4、网状型 nullCD20 staining in a germinal centernullnullCD56+nullC-erb-B2 positivity in a case of breast carcinoma。 The patient with a positive reaction will get Herceptin treatment and with a good prognosis.nullCONFIRM Anti-Melanosome primary antibody (clone HMB45) is a mouse monoclonal antibody useful in the identification of melanocytic tumors. nullnull（四）阳性标记强度特征： 细胞免疫组化标记根据显色称度分为弱阳性、中等阳性和强阳性。也可根据阳性细胞在细胞中所占比例大致分为：弱阳性（阳性细胞≤25%),中等阳性(25%-50%),强阳性(≥50%)。null（五）非特异着色特征 以下情况可干扰免疫组化结果判断： 1、抗体交叉反应： 是由于抗原决定簇同 时存在于多种组织细胞中，如GFAP 可存在于星形胶质细胞和唾液腺及上 皮细胞中，S-100蛋白则更为严重。因 此，应全面了解该抗体的功能和标记 范围。null2、肿瘤细胞异常表达：可选用多种标记去证实或 排除，鉴别其真正组织来源或向某一组织分化。 3、肿瘤细胞吞噬细胞抗原：是由于某些恶性肿瘤 细胞吞噬周围正常组织细胞所致。虽然后者也 存在抗原成分，但不是瘤细胞固有成分。 4、非特异性染色：是指抗原无明确定位，肿瘤细 胞与间质细胞、细胞与间质均为黄色，无深浅 之分。这种标记组织片不能作为免疫组化标记 结果判断。 null 原因： （1）标本固定不佳 （2）抗体质量问题或稀释度不合理 （3）操作方法不 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 另如标本边缘反应或出血坏死灶周围阳性不能 作为诊断依据。 null二、免疫组化结果判断及对假阴性假阳性的 认识 免疫组化结果判断原则： 1、必须设染色（阳性、阴性）对照 2、阳性表达必须在特定部位 3、阴性结果不能视为抗原不表达 4、免疫组化结果与HE切片诊断不一致时， 应以HE诊断为准。null引起假阴性、假阳性结果的原因： 1、假阴性结果原因主要是： （1）抗体失活、浓度不当。 （2）组织自溶，抗原扩散致抗原消失，特别是长期 固定的标本，新鲜标本最好。 （3）操作步骤不当，如反应时间过长或不够等。 （4）组织或细胞中抗原含量太低，所用的方法难以 检测到，改用敏感的方法。null2、假阳性结果的主要原因： （1）出现交叉反应，特别是多克隆抗血清易出现。 （2）抗体浓度过高或染色过程中切片干燥造成抗 体与组织产生非特异结合。 （3）组织或细胞中有内源性过氧化物酶、碱性磷 酸酶及生物素等产生非特异性显色。 null 免疫组化的应用null一、提高病理诊断准确性 在免疫组化应用以前，约有10%的肿瘤诊断是疑难的。对这些病例采用免疫组化检查后，依据抗体的种类、数量及经验不同，最后获得正确诊断的达疑难病例的50%—80%不等。例如，来源不明的淋巴结转移肿瘤，用角蛋白抗体获阳性，就支持癌的诊断，用波形蛋白抗体获阳性则支持肉瘤的诊断，这样就为临床处理提供了可靠的依据而不仅仅诊断为来源不明的淋巴结转移癌。 二、IHC在肿瘤病理学的研究和诊断中的主要应用二、IHC在肿瘤病理学的研究和诊断中的主要应用研究病原体与肿瘤的关系 如用IHC方法在组织切片上证明 人类乳头状瘤病毒（HPV）在尖锐湿疣和宫颈癌细胞中的存在 乙型肝炎病毒（HBV）在肝细胞性肝癌细胞中的存在 EB病毒抗原在鼻咽癌细胞中的存在等null协助确定肿瘤的良恶性 如bcl-2蛋白用于区分淋巴结反应性滤泡增生和滤泡性淋巴瘤 轻链限制性表达可用于鉴别多克隆性和单克隆性的B细胞增生。如果是单克隆性增生，而且增生的克隆已经占据整个细胞群的大部分。就可以用Ig轻链（κ，λ）染色来证实 null确定肿瘤细胞的增殖活性 恶性肿瘤的生物学行为在很大程度上与肿瘤细胞的增殖活性有关 免疫组织化学的方法已经可以通过测定细胞核内的与细胞增殖有关的蛋白酶，如Ki-67、PCNA等，而间接的确定肿瘤细胞的增殖活性，从而为临床估计肿瘤的恶性程度和确定治疗 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 提供重要的数据null分化差的恶性肿瘤的鉴别诊断问题，此时可以使用CK、Vimentin、LCA和S-100蛋白等标记区别未分化癌、恶性淋巴瘤、恶性黑色素瘤和小细胞肉瘤null确定转移性恶性肿瘤的原发灶 肿瘤病理诊断中常常遇到发现淋巴结转移癌，而临床上查不到原发灶的问题，使得治疗无法进行 免疫组化技术可以帮助鉴定原发灶 如PSA阳性提示为前列腺癌转移 Thyroglobin阳性提示来自甲状腺等null恶性淋巴瘤的诊断和分型 恶性淋巴瘤的分型现在已经不能离开免疫组化。许多特殊类型的淋巴瘤要靠一些免疫组化标记来确诊 如bcl-2蛋白阳性对于滤泡性淋巴瘤 cyclin D1阳性对于套细胞淋巴瘤 CD30和CD15阳性对于霍奇金病等null 激素受体检测对预后及治疗的意义 应用免疫组化方法，可对肿瘤内各种激素受体与生长因子进行定位、定量分析，已广泛应用于肿瘤临床工作。如对乳腺癌与激素受体（ER、PR）关系的研究已有了较明确的结论。 null 癌基因蛋白的临床应用 对癌基因（oncogenes）在肿瘤生物学中的价值已有大量的研究，在瘤细胞内常表现为癌基因的扩增、突变、移位等，其活性的异常则通过mRNA瘤蛋白的水平增加表达出来，用免疫组化的方法可对这些瘤蛋白进行定位和定量的检测，以探讨其临床意义。目前有临床意义的癌基因主要是c-erb-2、c-myc、ras和p53。 null 在肿瘤分期上的意义 在判断肿瘤是原位还是有浸润发生以及有无血管、淋巴管转移是与肿瘤分期密切相关的，用常规病理组织学方法对于上述问题的判断有时是十分困难的但用免疫组化法检查可获得明确的结果。如采用层粘连蛋白和Ⅳ性胶原的单克隆抗体可以清楚地显示基底膜的主要成分。采用第八因子相关抗原、UCA凝集素等显示血管和淋巴管内皮细胞的免疫组化方法则可清楚地显示肿瘤对血管和淋巴管的浸润情况。 nullnull为制定肿瘤的治疗方案提供依据 对于Hernew/2阳性的乳腺癌病人可进行单克隆抗体Herceptin治疗 对于CD20阳性的淋巴瘤可使用单克隆抗体美乐华治疗 耐药基因产物，如p170，可以帮助肿瘤科医师发现对于化疗耐药的病人，及时更换方案和药物，提高疗效三、在病原微生物的鉴定中的应用三、在病原微生物的鉴定中的应用免疫组化方法不仅可以检出病原体，而且可以检测病原体感染后表达的各种抗原，这就大大地增加了检测的敏感性 使用免疫组化方法检测病原体的标本可以为组织、细胞涂片、血清、分泌物、脑脊液、尿液等nullHBcAg in liver cellsHBsAg in liver cellsnullDouble IF stain shows the hepatocytes (green cytoplasm) and HCV (red nuclei).nullPrion Protein (red) and neurofilament (green) Nuclei of astrocyte are blue.null病毒： EB病毒---EBNA抗原和LMP-1蛋白 尖锐湿疣----HPV6、11型 宫颈癌---HPV16、18型 腺病毒、肠病毒、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒、流感和副流感病毒等 各种衣原体null细菌： 结核杆菌 大肠杆菌 淋球菌 幽门螺杆菌等 真菌： 曲菌 卡氏肺囊虫等 四、在免疫性皮肤疾病诊断中的应用四、在免疫性皮肤疾病诊断中的应用皮肤的免疫性疾病，如天泡疮、红斑狼疮等, 常常在皮损处有免疫复合物沉积, 因此使用免疫荧光或者免疫酶技术定位. 这对于某些皮肤疾病的确诊, 是十分必要的. 在冰冻切片上使用抗补体C5b-9的单抗可以对红斑狼疮进行分型 目前尚未出现在石蜡切片上工作良好的抗体, 主要还是使用冰冻切片和免疫荧光染色.nullPemphigus Foliaceus 叶状天疱疮 Direct fluorescence 五、在肾病的病理诊断中的应用五、在肾病的病理诊断中的应用肾小球肾炎的免疫分型在国外已成常规 在冰冻切片上或者石蜡切片使用抗免疫球蛋白、补体等抗体对于肾小球肾炎的诊断和分型 nullIn the post-streptococcal glomerulonephritis the immune deposits are distributed in the capillary loops in a granular, bumpy pattern. nullIn the post-streptococcal glomerulonephritis the C4d deposits are distributed in the capillary loops in a line pattern. 常用抗体的介绍 常用抗体的介绍 null   一、 一、  上皮性肿瘤标记 1、细胞角蛋白（cytokeration，CK） CK虽然是上皮组织的特有标记，但也可 以出现于滑膜肉瘤及类上皮肉瘤、胚胎瘤等。 因此有时必须联合应用多种标记才能确定 肿瘤的来源。 nullCK 5 and CK 6 in Squamous cell Carcinoma of the lungCK 5 and CK 6 in esophageal squamous cellsnull腺鳞癌的鳞状细胞为CK10+, 而腺癌细胞阴性nullCK8 immunostain in normal colon mucosanullCK20表达见于正常胃肠道上皮nullCK 7 stain in pancreas ductsnull2、上皮膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA） EMA是上皮细胞分泌的一种乳汁小球膜糖蛋白，它广 泛分布于各种上皮细胞中，其分布与细胞角蛋白极为相似， 但对内脏腺上皮优于角蛋白。 EMA可作为上皮源性肿瘤的常用标记物，阳性表达的肿 瘤包括鳞癌、胃肠道腺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、 滑膜肉瘤上皮样肉瘤等。在某些上皮性肿瘤的鉴别诊断中， 最好与细胞角蛋白联合应用，可提高诊断率。 nullAnti-Epithelial Membrane Antigen (EMA) primary antibody (clone Mc5) is a mouse monoclonal antibody useful in the detection of normal and neoplastic epithelium. nullEMAnull 二、间叶组织肿瘤标记 1、  机动蛋白（action） 是一种具有收缩能力的微丝蛋白，广泛分布于几乎所有的肌型细胞。根据其结构形式的不同，至少有六种不同形式的action：即横纹肌型、心肌型、平滑肌型（两种）和非肌源性型（两种）。 nullSmooth muscle actinnullSmooth muscle actinnull1、  2、波形蛋白（vimentin） 是一种分子量为52-58Ku胞浆蛋白，主要分布于 间叶细胞及其起源的肿瘤，上皮细胞及其肿瘤多不含 此蛋白。它是正常间叶细胞及其肿瘤的特异性标志。 3、 结蛋白（desmin） 是一种分子量为51-55ku的细胞浆蛋白，胚胎和成 人横纹肌和平滑肌细胞及其肿瘤均可表达。但血管 的平滑肌不表达。表达程度与分化程度一致。 null结