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鼠尾胶原制备.doc

鼠尾胶原制备

家玉很好
2017-11-10 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《鼠尾胶原制备doc》,可适用于自然科学领域

鼠尾胶原制备鼠尾胶原是一种天然培养基它具有促进体外培养细胞(特别是上皮细胞)贴壁的作用同时它也是一种天然的黏附剂当我们需要在培养瓶或培养皿内放置小玻片制备细胞爬片时可在瓶底涂一层胶原再放上小玻片自然干燥后小玻片就固定于培养瓶之中。通过本实验可掌握鼠尾胶原的制备方法以及如何切割小玻片并利用鼠尾胶原将其固定于培养瓶内。实验设备及材料:大鼠尾巴、剪刀、镊子、止血钳、弯头吸管、平皿、三角烧瓶、烧杯、量筒、天平、生理盐水、酒精、醋酸溶液、盖玻片、培养瓶、钻石笔、鼠尾胶原。实验内容:、制备鼠尾胶原。、切割小玻片。、利用鼠尾胶原将小玻片固定于培养瓶内。实验步骤:制备鼠尾胶原:、取大鼠尾巴洗净酒精浸泡分钟将尾巴剪开、去掉皮毛并剪成小段抽出银色的尾键、将尾腱剪断置于平皿中生理盐水浸泡、重复步骤、直至尾腱量够用、吸去生理盐水将尾腱称重(克)、将尾腱置于平皿内剪碎转移至三角烧瓶中、按每克尾腱ml的比例加入醋酸溶液、摇晃使尾腱分散于醋酸溶液中放置一星期、离心转分分钟、吸取上清分装成小瓶保存。醋酸的配置:molL,的醋酸如何配制成的醋酸溶液(molL)molL先计算,的醋酸的摩尔浓度稀释相应的倍数到。()一般来说常温下溶质是固体的其溶液的百分比浓度是质量比体积而常温下溶质为液体时其溶液百分比浓度是体积比体积。醋酸常温下为液态故,是体积比体积毫升溶液中含毫升的醋酸。×=醋酸的相对密度为故毫升醋酸的质量为克醋酸的分子式CHCOOH=(mol)分子量为故毫升醋酸的摩尔数为故,的醋酸溶=(molL)液的摩尔浓度为。molL取份,的醋酸溶液再加份的水即成。依次类推、鼠尾胶原鼠尾I型胶原蛋白鼠尾胶原蛋白SDSPAGE电泳对比简介鼠尾I型胶原蛋白(Collagenfromrattail,TypeI)系采用BirkedalHansen方法在无菌下制备纯度达到以上可溶于molL乙酸。本品可用于细胞培养皿的包被特别适合普通细胞培养器皿不易贴壁细胞的培养也可用于制备三维胶原凝胶使细胞在模拟的三维环境中生长。质量标准、SDSPAGE分析纯度大于。、无菌检验结果为阴性。、本品μgcm包被细胞培养皿后培养PC细胞贴壁及生长正常。、本品浓度mgmLpH时形成具有一定强度的三维胶原凝胶NIHT细胞在三维凝胶内生长正常、PC细胞在三维凝胶表面生长正常。使用方法、细胞培养器皿的表面包被以包被浓度为μgcm为例用无菌molL乙酸将胶原蛋白稀释到mgmL。加到相应的培养器皿中确保胶原蛋白溶液铺满器皿的表面。开盖在超净台上过夜晾干也可以在室温放置小时后用PBS洗~次后直接使用。包被好的器皿在~至少可保存三个月以上的时间。、三维胶原凝胶的制备A、无细胞三维胶原凝胶的制备(以配制mgmL三维胶mL为例)将μL本品加到置于冰浴的离心管中加入μL双蒸水然后加到μLmolLNaOH中(如果反过来把μLmolLNaOH加到胶原溶液中会由于NaOH不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结)立即混匀。再加入μL×PBS或×培养液混匀后立即加到培养器皿中(混匀后pH为左右如果PBS或培养液中没有加酚红初次使用时需要测定pH值)。将培养器皿在室温放置min待胶凝固后转移到培养箱内。如果配制中使用的是×PBS使用前需要加入适当体积的细胞培养液预平衡。B、含细胞三维胶原凝胶的制备(以配制mgmL三维胶mL为例)准备好悬浮于培养液的细胞并放置于冰浴中。将μL本品加到μLmolLNaOH中(如果反过来把μLmolLNaOH加到胶原溶液中会由于NaOH不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结)立即混匀。再加入μL×PBS或×培养液混匀后立即加到培养器皿中(混匀后pH为左右如果PBS或培养液中没有加酚红初次使用时需要测定pH值)。加入μL的细胞悬浮液混匀后立即加到培养器皿中。将培养器皿在室温放置min待胶凝固后加入适当体积的细胞培养液转移到培养箱中培养。本品在室温下pH中性时可迅速成胶在操作过程中要尽量保持低温。保存条件保存切勿冻存有效期一年。鼠尾胶原实验应用涂布鼠尾胶原探讨应用鼠尾胶原在豚鼠前庭毛细胞膜片钳实验中的促进毛细胞贴壁效果。方法制作鼠尾胶原观察全细胞膜片钳实验中自制的鼠尾胶原对前庭毛细胞的贴壁黏附作用。结果无鼠尾胶原时前庭毛细胞悬浮于外液不宜封接有鼠尾胶原时前庭毛细胞贴附于培养皿底壁易于封接和长时间(约h)的观察和记录。鼠尾胶原对前庭毛细胞具有良好的贴壁黏附促进作用。结论鼠尾胶原能促进毛细胞贴壁涂布鼠尾胶原有利于膜片钳实验的长时程记录并且制作简便成本低廉。鼠尾胶原在原代培养耳蜗血管纹边缘细胞中的应用。目的:建立利用自制的鼠尾胶原培养大鼠耳蜗边缘细胞的方法。方法:制作鼠尾胶原,并观察利用自制的鼠尾胶原所培养出大鼠耳蜗边缘细胞的效果。结果:自制的鼠尾胶原能正常地培养出大鼠耳蜗边缘细胞细胞角蛋白表达阳性免疫组织化学结果和扫描电镜证实所培养的细胞具有典型的分泌上皮细胞特征。结论:成功建立了利用自制鼠尾胶原培养大鼠耳蜗边缘细胞的方法并且制作简便,成本低廉。鼠尾胶原为底物的人鼻腔纤毛上皮细胞培养模式的建立目的建立以鼠尾胶原为贴附底物的人鼻腔纤毛上皮细胞的体外培养模式为人鼻腔黏液纤毛运输系统的研究提供科学有效的方法方法制备鼠尾胶原并铺片以鼠尾胶原为贴附底物组织块培养法培养人鼻腔纤毛上皮细胞培养天时进行HE染色及扫描电镜和透射电镜观察细胞形态和结构应用高速摄像技术测量纤毛摆动频率结果鼠尾胶原要平坦均匀平均厚度约为mmHE染色可见上皮细胞呈单层向周围爬开扫描电镜下见纤毛上皮细胞呈不规则多角形纤毛周围可见微绒毛透射电镜下可见纤毛上皮细胞间为紧密连接同一细胞任意两点纤毛摆动频率是相同的同一来源体外培养的钩突和下鼻甲的纤毛摆动频率是相同的结论以鼠尾胶原为贴附底物人鼻腔纤毛上皮细胞的体外培养模式的成功建立为今后研究鼻内用药对纤毛清除功能的影响提供了良好的方法和途径。鼠尾胶原醋酸溶解无菌室(将鼠尾胶原加入到M的醋酸中制备成浓度为的溶液。在室温中搅拌小时直到完全溶解。(建议将溶液转移到拧口的玻璃瓶中并小心的在瓶底铺上一层氯仿。氯仿的量约为胶原溶液的。不要晃动或搅拌。在度中放置过夜。在无菌条件下转移上层的胶原溶液。我们不建议用过滤的方法无菌化。已经发现该方法会导致丢失蛋白。(稀释一定数量的胶原溶液。(按照ugcm的浓度包被培养瓶。在室温或度结合数小时或者度过夜。(从包被表面除去多余的液体。过夜干燥。如果胶原溶液不是无菌的这时候可以在无菌细胞操作室中暴光在紫外线下过夜消毒。在接种细胞前用无菌的水漂洗。鼠尾胶原真皮类似物的建立生友鼠尾胶原蛋白I型目的:探寻建立真皮类似物的培养方法。方法:原代培养人皮肤成纤维细胞制备鼠尾胶原将鼠尾胶原溶液、浓缩培养基、NaOH溶液和以血清重悬的成纤维细胞溶液在适当的比例下混合后形成凝胶构建真皮类似物。结果:形成的真皮类似物中成纤维细胞生长状态良好并且组织块具有一定弹性和抗拉伸能力。结论:利用鼠尾胶原可以构建真皮类似物该模型是进行皮肤器官型培养和制作复合皮的关键与基础成纤维细胞胶原凝胶复合物有着良好的生物学特性它是研究成纤维细胞与细胞外基质之间以及细胞之间相互作用的良好模型。

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