4-荧光分析法

null第三章 荧光分析法第三章 荧光分析法第一节 概述（了解） 第二节 基本原理（熟悉） 一、荧光的产生 二、影响荧光的因素 1、分子结构与荧光的关系 2、影响荧光强度的外部因素第三章 荧光分析法第三章 荧光分析法第三节 荧光光度计 第四节 定量分析方法（掌握） 第五节 分析条件的选择 仪器与荧光分析新技术（了解） 第六节 应用与示例(自学)第一节 概述第一节 概述一、光致发光：某些物质对特定波长的光有一定的吸收，从而产生吸收光谱。有些物质受到光的照射时，除吸收某种波长的光之外还会发射出波长相同或比吸收波长更长的光，这种现象称为光致发光。最常见的两种光致发光现象是荧光和磷光。第一节 概述第一节 概述二、荧光：物质分子吸收光子能量而被激发,然后从激发态的最低振动能级返回到基态所发射出的光称为荧光(fluorescence) 三、荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和物质含量测定的方法称为荧光分析法（flourometry）第二节 基本原理第二节 基本原理一、荧光的产生 （一）分子的激发 （二）荧光的产生 二、影响荧光的因素 （一）荧光效率 （二）影响荧光的因素一、荧光的产生 一、荧光的产生 （一）分子的激发 Pauli不相容原理:一个轨道中两个电子,自旋相反,自旋量子数1/2和-1/2. 基态的多重性：2S+1=1 （单线态） 两电子自旋相反 2S+1=1 （激发单线态）两电子自旋相反 激发态： 2S+1=3 （激发三线态）两电子自旋相同 能量低于单线态nullnull（二）荧光的产生 基态 吸收紫外光 激发单线态 （激发三线态禁阻） 激发态 基态 振动弛豫、内部能量转换、荧光发射、外部能量转换、 体系间跨越、磷光发射荧光与磷光产生示意图荧光与磷光产生示意图1、振动弛豫1、振动弛豫物质分子被激发后，其电子可能跃迁到第一电子激发态或更高的电子激发态的几个振动能级上。在溶液中，激发态分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。 特点：无辐射跃迁，只能在同一电子能级内进行，发生振动弛豫时间约10-12s数量级。2、荧光发射2、荧光发射 激发单线态（激发态） 振动驰豫 内转换 第一激发单线态的最低振动能级 辐射跃迁 发射光量子 荧光 基态任一振动能级 振动驰豫 基态最低振动能级（基态）3、磷光发射3、磷光发射 激发单线态S1*最低振动能级 体系间跨越 激发三线态T1* 振动驰豫 激发三线态的最低振动能级 磷光 基态各个振动能级振动驰豫基态最低振动能级荧光与磷光荧光与磷光问题： 1.荧光与磷光产生机制有何异同? 2.荧光与磷光的性质有何差异? 3.激发态的分子回到基态的途径有哪些?二、影响荧光的因素 （一）荧光效率二、影响荧光的因素 （一）荧光效率荧光效率 （fluorescence efficiency）=荧光量子产率 指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比。 f = f 0~1 例：荧光素钠 在水中f =0.92,荧光素在水中f =0.65, 蒽在乙醇中f =0.30, 菲在乙醇中f =0.10(二)影响荧光的因素 1、分子结构与荧光的关系(二)影响荧光的因素 1、分子结构与荧光的关系强的紫外-可见吸收 一定的荧光效率 物质分子发射荧光条件 * 跃迁，K带强吸收 可能产生 荧光 长共轭分子、刚性平面结构分子、共轭体系上的取代基影响。 （1）长共轭结构（1）长共轭结构 苯 萘 蒽 ex 205nm 286nm 356nm em 278nm 231nm 404nm f 0.11 0.29 0.36 VA ex=327nm em=510nm （2）分子的刚性和共平面性（2）分子的刚性和共平面性例1 联苯 f =0.2 芴 f =1.0 例2 酚酞(荧光很弱)和荧光素(多一个氧桥),共平面性增加,强烈荧光. 例3 8-羟基喹啉(弱荧光物质) 8-羟基喹啉镁(荧光增强) 例4 1,2-二苯乙烯反式异构体强烈荧光, 顺式异构体无荧光. （3）取代基（3）取代基第一类取代基：增加分子的 电子共轭程度 荧光效率 荧光波长长移 — NH2、— OH、— OCH3、— NHR、— NR2、— CN等 第二类取代基：减弱分子的 电子共轭程度 荧光减弱甚至熄灭 — COOH、— NO2、— C=O、— NO、— SH、— NHCOCH3 — F、— Cl、— Br、— I等 第三类取代基：对 电子共轭体系作用较小 — R、— SO3H、— NH3+等2、环境因素2、环境因素温度 溶剂 pH值的影响 荧光熄灭剂的影响 散射光的干扰（1）温度（1）温度 温度 荧光强度 影响显著 温度 f  ；F  原因：温度 分子运动速度 分子间碰撞几率 无辐射跃迁 f  例：荧光素钠乙醇溶液，0°C以下，T  10 °C，f  3% — 80 °C时， f =1 （2） 溶剂（2） 溶剂同一物质在不同溶剂中，其荧光光谱的形状和强度都有差别。 一般情况下，溶剂极性 荧光波长 F  原因：极性溶剂，*跃迁所需能量差E小，跃迁几率 紫外吸收波长、荧光波长 、F  溶剂粘度 F  （3）pH值的影响（3）pH值的影响 无荧光 蓝色荧光 无荧光（4）荧光熄灭剂的影响（4）荧光熄灭剂的影响荧光熄灭：指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。 荧光熄灭剂（quenching medium）：引起荧光熄灭的物质。 常见的荧光熄灭剂：卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。荧光熄灭形式荧光熄灭形式1. 荧光物质分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量. 2. 荧光物质分子 熄灭剂分子 本身不发光的配位化合物 3. 在荧光物质的分子中引入溴或碘后易发生体系间跨越而转变至三线态 4. 溶解氧的存在 荧光物质氧化; 氧分子的顺磁性 促进体系间跨越 激发三线态 5. 溶液过浓 碰撞 荧光自熄灭 荧光熄灭法荧光熄灭法如果一个荧光物质在加入某种熄灭剂后,荧光强度的减少和荧光熄灭剂的浓度呈线性关系,则可以利用这一性质测定荧光熄灭剂的含量,这种方法称为荧光熄灭法(fluorescence quenching ). 例：微量氧的测定：氧分子对硼酸根-二苯乙醇酮配合物的荧光熄灭效应。（5）散射光的影响（5）散射光的影响散射光：当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液，小部分由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光（scattering light）。 光子 相互作用 物质分子 弹性碰撞；非弹性碰撞散射光的干扰散射光的干扰 弹性碰撞 非弹性碰撞 不发生能量交换 能量交换；光子运动方向改变 光子运动方向发生改变 光子 能量 物质 瑞利光 拉曼光 （Reyleigh scattering light） （Raman scattering light） 波长与入射光相同 波长比入射光波长稍长或稍短 （不干扰荧光测定） （干扰荧光测定，尤其波长更长的光） 注：选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰。见P91图13-9第三节 荧光光度计第三节 荧光光度计第四节 定量分析方法 一、荧光强度与荧光物质浓度的关系第四节 定量分析方法 一、荧光强度与荧光物质浓度的关系 荧光物质吸收光能的程度 荧光效率 荧光强度 荧光强度与荧光物质浓度的关系荧光强度与荧光物质浓度的关系设溶液中荧光物质浓度为C，经激发后发出的荧光强度为F，则： F=KC （条件：C 很小，ECL  0.05）二、定量分析方法二、定量分析方法 标准曲线法 比例法 荧光强度~标准溶液浓度 对照品FS 、样品FX 作法：空白溶液调0 ，某一 比例关系计算 标准溶液F 调至100%~50%， 空白溶液F 调不到0 ，必须 再测其他各个标准溶液。 扣除空白值（F 0）。 多组分混合物的荧光分析：荧光强度加和性第五节 分析条件的选择第五节 分析条件的选择一、线性范围选择 当浓度较低时（ECL  0.05） ，荧光强度才呈线性关系。 二、选择激发波长和荧光波长二、选择激发波长和荧光波长（一）激发光谱（excitation spectrum）：指不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。 测绘方法：通过激发单色器扫描，以使不同波长的入射光激发荧光物质，然后让其所产生的荧光通过固定在某一波长的发射单色器后由检测器检测相应的荧光强度，以荧光强度（F）为纵坐标，激发波长（ex）为横坐标作图，即可得到激发光谱。null激发光波长不断变化固定荧光波长null（二）荧光（发射）光谱（fluorescence spectrum）：使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所产生的荧光通过发射单色器后照射于检测器上，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度，然后记录荧光强度（F）对发射波长（em）的关系曲线，所得到的图谱称为荧光光谱。荧光光谱 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。null荧光光谱特征荧光光谱特征1.斯托克斯位移(Stokes shift)： 荧光波长总是大于激发光波长 能量损失 2.荧光光谱的形状与激发波长无关 S1*的最低振动能级 基态 荧光发射通常发生于第一电子激发态的最低振动能级,与激发至哪一个电子激发态无关. 3.荧光光谱与激发光谱的镜像（对称）关系 激发光谱两个峰a、b峰 a（S0 S2*）、b （S0 S1*（不同振动能级））b0、b1、b2、b3、b4 荧光光谱（S1* S0不同振动能级）c0、c1、c2、c3、c4第六节 应用与示例第六节 应用与示例一、有机化合物的荧光分析 具芳香结构的化合物；荧光试剂衍生化 强荧光产物 有机物：多环胺类、萘酚类、吲哚类…… 药物：生物碱类；甾体类；抗生素类；维生素类；中草药有效成分等。 二、无机化合物的荧光分析 配位化合物 三、应用示例（自学） 利血平片的含量测定