nullReal-Time PCR实验Real-Time PCR实验目标目标建立SYBR GREEN实时定量PCR体系
掌握绝对定量和相对定量的原理和应用
运用Bio-Rad IQ2 PCR仪进行实验的设定和
分析
定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析
了解定量PCR实验的操作注意事项SYBR GREEN实时定量PCR体系SYBR GREEN实时定量PCR体系反应体系的建立及优化:
SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测
MgCl2的浓度:可以降低以减少非特异性产物
反应Buffer 体系的优化
----使用REAL-TIME PCR KIT
Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准
反应温度和时间参数:由酶和引物决定
其他与常规PCR相同
本次实验体系本次实验体系模板（Template） 2ul
引物（Primer） 4ul
PCR试剂（Mix） 10ul
水 4ul
总量 20ulnullSYBR GREEN法引物设计 扩增子的长度应不超过400bp，理想的最好能在80－150bp
引物长度18~25bp，Tm值在63-67 ℃，GC含量30-80%（最好40-60 %），退火温度在58-62 ℃
上下游引物间Tm值差小于4 ℃
避免引物错误引发，且引物末端（最后5个核苷酸)不能超过2个G或C
避免引物内和引物间的互补（避免形成发夹结构和引物二聚体）
跨一个或多个内含子设计引物（避免对基因组DNA的扩增）
使用Blast检查引物特异性（www.nibi.nlm.nih.gov/blast) 跨内含子设计引物 跨内含子设计引物nullnullBaseline
背景曲线的一段，范围Threshold 阈值
荧光超过本底，进入相对稳定对数增长期时的临界数值CT值
threshold Cycle，阈值与扩增曲线相交，所得交点所对应的循环数。 null
为什么CT ∝起始DNA浓度?null
为什么CT ∝起始DNA浓度?绝对定量和相对定量绝对定量和相对定量null绝对定量由已知模板的浓度值和CT值标准曲线
获得未知样品的模板浓度标准品：
必须与目标基因引物相同，且扩增效率一致
标准品必须准确定量 (e.g. UV spectrophotometer)
每套实验必须设定同样的域值，才可计算未知样品的Ct值nullExperiment Example相对定量——基因表达量的比较相对定量——基因表达量的比较使用∆∆CT分析法或Pfaffel法
样品模板必须用内参照基因标准化
运用最广泛和最强大的方法
nullnullnullnullnullComparative Delta-Delta CtnullPfaffel (2001)注意事项：注意事项：nullnullnullnullnullnullnull选择一个内标基因。
确定内标的有效性，确保它不会受到实验处理的影响。
通过PCR 扩增目标基因和内标基因RNA 或cDNA 的一系列梯度稀释模板确保它们的扩增效率相同。
最後通过2－△CT 计算将统计数据转化成线性形式而不是原始CT值 Precision is essential to Real-Time PCR!Precision is essential to Real-Time PCR!What factors affect precision? 移液器 - 经常校准移液器 - 确定移液器和枪头配套
分装试剂 - 缓慢移液 - 用新枪头 - 靠近液面取液 - 尽可能使用自动移液装置
温度 - 仪器孔与孔之间，设定温度与实际温度之间差异要小
平衡时间 - 所有的孔达到相同温度的时间 - 收集所有的孔数据的时间
光源强度一致 - 光源照射每个样品的强度达到孔与孔信号恒定
必要的维护 - 仪器定期维护
浙公网安备 33021202002483