以L_半胱氨酸和吲哚酶法合成L_色氨酸

© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 药 　物 　生 　物 　技 　术 Pharmaceutical Biotechnology 　2000 ,7 (4) :197～199 文章编号 :100528915 (2000) 0420197203 　 以 L2半胱氨酸和吲哚酶法合成 L2色氨酸① 韦平和 　吴梧桐 (中国药科大学生物制药学院 ,南京 210009) 摘 　要 　用色氨酸酶基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 菌 WW24 催化 L2半胱氨酸和吲哚合成 L2色氨酸。80 ml 反应液 ( L2半胱氨 酸 0175 g ,吲哚 0. 75 g) 37 ℃反应 48 h ,可积累 L2色氨酸 1. 18 g。L2半胱氨酸转化率为 93. 2 % ,吲哚转化率为 90. 1 %。产品总回收率达 70 % ,所得晶体在熔点、旋光性和红外吸收光谱等方面与标准品完全一致。 关键词 　L2半胱氨酸 ; L2色氨酸 ;色氨酸酶基因工程菌 ;转化 中图分类号 : TQ46417 　　文献标识码 :A 　　L2色氨酸是人和动物体内的重要必需氨基 酸 ,在医药、食品和饲料添加剂等方面具有广泛的 用途。其生产方法有蛋白水解提取法、化学合成 法、微生物发酵法和酶促转化法四种 ,其中酶促转 化法是目前较为有效的工业化方法。转化途径主 要涉及色氨酸合成酶 ( EC4. 2. 1. 20) 和色氨酸酶 ( EC4. 1. 99. 1) 。由于底物吲哚对色氨酸合成酶抑 制强烈 ,而对色氨酸酶抑制较弱 ,所以近年来人们 更为倾向于将色氨酸酶用于 L2色氨酸的生物合 成[1 ] 。 色氨酸酶正常情况下降解 L2色氨酸生成丙酮 酸、吲哚和氨 ,但在高浓度的丙酮酸和氨条件下也 能有效地催化丙酮酸、吲哚和氨合成 L2色氨酸[2 ] 。 该酶还能催化 L2丝氨酸或 L2半胱氨酸和吲哚合 成 L2色氨酸[3 ] 。Nakazawa 等 (1972) [4 ]以 20 g 吲 哚、30 g 丙酮酸钠、50 g 乙酸铵和 4 g Proteus rettgeri 菌体作为色氨酸酶源 ,37 ℃反应 48 h ,可积 累 23 g L2色氨酸。Ujimaru 等 (1983) [5 ]用 A chro2 mobacter liqui dum 色氨酸酶催化 L2丝氨酸和吲哚 合成 L2色氨酸 , L2丝氨酸转化率为 8214 % ,吲哚 转化率为 9214 %。鉴于国内外尚未报道以 L2半 胱氨酸和吲哚为原料酶法生产 L2色氨酸 ,故本文 用自行构建的色氨酸酶基因工程菌 WW24[6 ] ,以 L2半胱氨酸和吲哚为底物合成 L2色氨酸 ,试图为 工业化生产 L2色氨酸建立一条合理、可行的 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 路线。 1 　材 　料 111 　菌株和培养基 色氨酸酶基因工程菌 WW24 由本室构建 , E. coli BL21 由南京大学生化系徐贤秀教授惠赠 ,LB 培养基 (1 %胰化蛋白胨 ,015 %酵母抽提物和 1 % 氯化钠) 。 112 　试剂 磷酸吡哆醛 ( PL P) 、异丙基硫代半乳糖苷 ( IPTG) 、还原型谷胱甘肽和对二甲氨基苯甲醛分 别购自 Sigma 公司、Promega 公司、中国新兴医药 保健品开发公司和上海试剂三厂 ; L2半胱氨酸、L2 色氨酸购自上海伯奥生物科技公司 ;吲哚购自上海 双喜香料助剂厂 ,其它试剂均为国产 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯。 113 　仪器 J22HS 高速冷冻离心机 ( Beckman 公司 ) , DDHZ2300 多用途台式恒温振荡器 (江苏太仓实验 设备厂) ,ZFQ85A 旋转蒸发器 (上海医械专机厂) , 835 氨基酸自动分析仪 ( Hitachi) ,DSC225 差示扫 描量热仪 ( Mettler 公司) , 241MC 旋光仪 ( PE 公 司) , IMPACT 410 红外光谱仪 (Nicolet 公司) 。 2 　方 　法 211 　工程菌 WW24色氨酸酶的诱导 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达 取一个 WW24单菌落接种于LB培养基 ,37 ℃培养 过夜以获得饱和培养物 ,将饱和培养物以 1 %接种于含 791 ① 收稿日期 :1999 - 10 - 10 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net Amp (100μg/ ml)的LB培养基中 ,37 ℃继续培养 2 h 后 , 添加 IPTG至终浓度 1 mmol/ L ,诱导表达色氨酸酶[7]。 212 　色氨酸酶的活力测定 按文献[ 8 ]进行。酶的一个活力单位定义为 : 在一定反应条件下 ,37 ℃、10 min 催化形成 0101 μmol 吲哚所需要的酶量。 213 　L2色氨酸的酶法合成条件 在 80 ml 0. 1 mol/ L 磷酸钾缓冲液中 ,分别添 加 0. 75 g L2半胱氨酸、0. 75 g 吲哚、0. 5 mmol/ L PL P 以及由 150 ml 培养液离心后收集的细菌沉 淀 ,调 p H 8. 8 后置 37 ℃摇床轻缓振荡使反应进行 12 ,24 ,36 和 48 h。 214 　反应液中 L2色氨酸的 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 将振摇一定时间的反应液经适当稀释后于 12 000 r/ min 离心 2 min ,取上清液 10μl 进行纸层析检 测 ,展开剂系统正丙醇∶氨水∶水 (20∶15∶3) 。对不同 转化时间反应液中的 L2色氨酸以氨基酸自动分析 仪进行定量分析。 3 　结 　果 3. 1 　WW24 色氨酸酶最佳活力的选择 经 IPTG诱导 0. 5 ,1 ,2 ,3 和 4 h 的色氨酸酶基 因工程菌 WW24 ,其活力测定结果见图 1。由图 1 可知 :诱导 1 h 左右的色氨酸酶活力最高 ,故选择 诱导 1 h 的细胞作为 L2色氨酸酶法合成的酶源。 Fig 1 　Effect of induction time on the activity of WW24 tryp2 tophanase 312 　L2色氨酸的酶法合成 由 0. 75 g L2半胱氨酸、0. 75 g 吲哚、0. 5 mmol/ L PLP、0. 1 mol/ L 磷酸钾缓冲液及 150 ml 培养液离心 后收集的细菌沉淀组成 80 ml 的反应体系 ,调 pH 8. 8 后于 37 ℃反应 48 h ,通过纸层析分析 (图 2)和氨基酸 自动分析仪定量 ,可积累 1118 g L2色氨酸。L2半胱 氨酸转化率为 93. 2 % ,吲哚转化率为 90. 1 %。L2色 氨酸随转化时间的浓度变化见 Fig 3。 1 :Authentic L2cysteine (5 mg/ ml) ; 2 : Reaction catalyzed by trypto2 phanase from host strain (reaction 48 h) ;3、4、5 :Reactions catalyzed by tryptophanase from engineered strain WW24 (reaction 24、36 and 48 h , respectively) ;6 :Authentic L2tryptophan (5 mg/ ml) Fig 2 　Paper chromatogram of L2tryptophan Fig 3 　Synthesis of L2tryptophan by tryptophanase 313 　L2色氨酸的分离纯化 将收获的转化液于 5 000 r/ min 离心 15 min , 以分离残留的吲哚和菌体。弃沉淀 ,上清用 1 %活 性炭于 80 ℃脱色处理 20 min ,抽滤 ,滤液用 HCl 调 p H 至 510 ,并于 4 ℃静置 12 h。离心后所得上清用 # 732阳离子交换树脂分离 ,5 %氨水洗脱 ,洗脱液 的纸层析图谱显示 L2色氨酸和 L2半胱氨酸混合 物可逐渐分离为单一的 L2色氨酸。将纸层析显示 只含 L2色氨酸斑点 的洗脱液合并 ,55 ℃减压浓缩 近乎糊状 ,过滤后所得粗品于水中重结晶两次 ,可 得白色、片状的 L2色氨酸晶体。产品 L2色氨酸的 总回收率为 70 %。 891 药 物 生 物 技 术 第 7 卷第 4 期 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 314 　L2色氨酸产品的质量分析 31411 　熔点 　差示扫描量热仪测定结果为 27418 ℃,与标准品 27613 ℃相差 115 ℃。 31412 　旋光度 　PE2241MC 测定结果为 [α]28D - 31. 34°,符合《中国药典》(1990 版附录) - 30°～ - 33°要求。 3. 4. 3 　红外吸收图谱 　与标准品图谱一致。 4 　讨 　论 色氨酸酶催化丙酮酸、吲哚和氨合成 L2色氨 酸的酶法途径中 ,由于底物吲哚对色氨酸酶抑制作 用较弱 ,且丙酮酸价格不高 ,因而具有一定的实用 性 ,但该途径是色氨酸水解的逆反应 ,要求底物浓 度较高 ,反应平衡不易把握。以 L2丝氨酸和吲哚 为原料合成 L2色氨酸的酶法途径 ,所用的 L2丝氨 酸价格几乎与 L2色氨酸相当 ,因此实用性不强。 本文用色氨酸酶基因工程菌催化 L2半胱氨酸和吲 哚合成 L2色氨酸 ,所用底物 L2半胱氨酸可通过毛 发水解提取 L2胱氨酸后电解还原制得 ,产量高 ,价 格低廉 ,且 L2半胱氨酸转化率为 93. 2 % ,吲哚转 化率为 90. 1 % ,产品总回收率达 70 %。所以该酶 法途径具有重要的工业化应用价值。 以 L2半胱氨酸和吲哚合成 L2色氨酸的酶法 途径主要存在两方面的困难 ,一是 L2半胱氨酸在 反应过程中易氧化成 L2胱氨酸 ;另一是在分离纯 化过程中吲哚、L2半胱氨酸和 L2色氨酸不易分离。 前者可通过抗氧化剂、间歇添加 L2半胱氨酸等方 法予以部分解决。至于后者 ,杨文革等 (1996) [9 ] 报道用 # 330 和 # 732 两种树脂串联起来能有效地 去除残留吲哚 ,并且对色氨酸的总回收率大于 70 %。但 L2半胱氨酸和 L2色氨酸的有效分离尚 有待进一步的完善。 参 考 文 献 1 　韦平和 ,吴梧桐 1 色氨酸生物工程研究进展 [ J ]1 药物生物技 术 ,1998 ,5 (3) :180 2 　Watanabe T ,Snell E. Reversibility of the tryptophanase reaction : synthesis of tryptophan from indole ,pyruvate and ammonia [ J ] . Proc Natl Acad Sci USA ,1972 ,69 (5) :1086 3 　Newton W A ,Morina Y ,Snell E. Properties of crystalline trypto2 phanase [ J] . J Biol Chem ,1965 ,240 (3) :1211 4 　Nakazawa H , Enei H ,Okumura S , et al . Synthesis of L2trypto2 phan from pyruvate , ammonia and indole [ J ] . A gr Biol Chem , 1972 ,36 (13) :2523 5 　Ujimaru T , Kakimoto T , Chibata I. L2Tryptophan production by Achromobacter liquidum [ J ] . A ppl Envi ron Microbiol ,1983 ,46 (1) :1 6 　韦平和 ,吴梧桐 ,张玉彬 1 大肠杆菌色氨酸酶基因的克隆和表 达[ J] 1 中国药科大学学报 ,1999 ,30 (2) :139 7 　Sambrook J ,Fritsch E F ,Maniatis T. Molecular cloning [ M ] . 2nd ed New York Cold Spring Harbor Laboratory press ,1989 8 　韦平和 ,吴梧桐 ,余方兵 1 色氨酸酶基因工程菌的活力及其与 表达关系研究[J ] 1 药物生物技术 ,1999 ,6 (2) :70 9 　杨文革 ,胡永红 ,欧阳平凯 ,等 1 酶法合成中色氨酸的分离 [J ]1 工业微生物 ,1996 ,26 (1) :27 Enzymatic Synthesis of L2Tryptophan from L2Cysteine and Indole Wei Pinghe ,Wu Wutong ( School of B iopharm aceutics , Chi na Pharm aceutical U niversity , N anji ng 210009) Abstract 　L2Tryptophan was enzymatically synthesized by tryptophanase in genetic engineered strain WW24 from L2cysteine and indole. 1. 18g of L2t ryptophan was formed from 0. 75g of L2cysteine and 0. 75g of in2 dole in 80ml reaction mixture shaking for 48h at 37 ℃. The conversion rate was 93. 2 % for L2cysteine and 90. 1 % for indole. The total separation recovery of the products was 70 % ,and the prepared crystals were identical with authentic L2t ryptophan ,in respects of melting point ,optical activity and IR2spectrum. Key Words 　L2Cysteine , L2Tryptophan , Tryptophanase genetic engineered strain ,Conversion 991韦平和等 :以 L2半胱氨酸和吲哚酶法合成 L2色氨酸