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急性肺损伤大鼠肺组织神经导向因子Slit2及Robo4的表达急性肺损伤大鼠肺组织神经导向因子Slit2及Robo4的表达.doc

急性肺损伤大鼠肺组织神经导向因子Slit2及Robo4的表达急…

当时太幼稚啊
2019-06-11 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《急性肺损伤大鼠肺组织神经导向因子Slit2及Robo4的表达急性肺损伤大鼠肺组织神经导向因子Slit2及Robo4的表达doc》,可适用于医药卫生领域

描述:目的观察神经导向因子Slit及Robo在肺组织的表达并探讨二者在ALI发病中的作用。方法在南华大学实验动物部将只SD雄性大鼠随机(随机数字法)分为对照组(n=)与ALI组(n=)。【摘要】目的观察神经导向因子Slit及Robo在肺组织的表达并探讨二者在ALI发病中的作用。方法在南华大学实验动物部将只SD雄性大鼠随机(随机数字法)分为对照组(n=)与ALI组(n=)。ALI组采用盲肠结扎穿孔术复制急性肺损伤模型,对照组只开腹关腹,不行盲肠结扎穿孔术,以血清)、组织水肿、肺部特征性病理改变作为ALI炎症因子浓度、动脉血氧分压(PaO模型成功主要指标。两组又分为术后、、h个组,每组只。取大鼠取肺组织测定湿干质量(WD)比值,并观察肺毛细血管通动脉血测定PaO透性及组织病理学改变ELISA检测血清TNFα水平RTPCR测定肺组织Slit及RobomRNA表达,免疫组织化学法观察蛋白表达情况。采用SPSS统计软件行单因素方差分析,P<为差异具有统计学意义。结果与对照组比较,ALI均降低,肺WD比值、肺毛细血管通透性、血清TNFα组致伤后各时间点PaO水平均升高(P<),病理观察显示肺组织受损RTPCR结果显示ALI组h,h,h肺组织SlitmRNA表达量较同期对照组下降(±)vs(±),F=,P<,(±)vs(±),F=P<,(±)vs(±),F=,P<ALI组肺组织RobomRNA表达量与同期对照组比较,差异无统计学意义(±)vs(±),F=,P>,(±)vs(±),F=,P>,(±)vs(±),F=,P>免疫组织化学研究显示Slit主要表达于内皮细胞膜上,亦可表达于肺上皮细胞胞核及胞浆,Robo则只表达于内皮细胞膜上ALI组个时间点肺组织Slit蛋白表达量较同期对照组下降(±)vs(±),F=,P<,(±)vs(±),F=,P<,(±)vs(±),F=,P<与对照组比较,ALI组肺组织Robo蛋白表达量差异无统计学意义(±)vs(±),F=,P>,(±)vs(±),F=,P>,(±)vs(±),F=,P>。结论对照组大鼠肺组织可表达Slit及Robo,盲肠结扎穿孔致ALI大鼠肺组织Slit表达下降,这可能与ALI发病有关。临床上脓毒症作为ALI急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS)的间接诱因,常可伴发ALIARDS。随着肺保护性通气策略的推广,ALI的病死率已趋下降,但仍高达~。MacSweeney等研究发现,在早期对ALI进行积极治疗,能够有效阻断MODS中各器官衰竭的序贯进行,从而提高危重症患者的治愈率。以往对于ALI发病机制的研究集中在“瀑布样”炎症反应导致肺上皮细胞及血管内皮细胞受损。分泌性糖蛋白Slit与其配体Robo最初只被定义为神经导向因子中的一员,年,Lee和Slutsky研究发现SlitRobo信号通路与白细胞的迁移、血管的生成及维持内皮功能的稳定有一定的关系,但对Slit及Robo在急性肺损伤发病机制中的作用方面的研究尚不多。本研究通过观察ALI大鼠肺组织神经导向因子Slit及Robo的表达,探讨二者在脓毒症ALI发生、发展中的作用。材料与方法主要材料清洁级雄性SD大鼠只,体质量(±)g,购自南华大学实验动物部。TNFα、IL(ELISA)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司伊文思蓝(大连美仑生物科技有限公司)。Trizol(美国Invitrogen公司),cDNA逆转录试剂盒(美国fermentas公司),内参照βactin,Slit和Robo的特异性引物(上海桑尼生物科技有限公司),兔抗大鼠Slit多克隆抗体及兔抗大鼠Robo多克隆抗体(北京博奥森生物有限公司)。PCR扩增仪(美国Axygen公司)。血气分析仪(瑞士Roche公司OPTICCA型)。动物分组只SD大鼠按随机数字表法分为对照组只和ALI组只。参照Rittirsh等报道的盲肠结扎穿孔术(cecumligationandpuncture,CLP)复制脓毒症ALI模型。动物以水合氯醛腹腔注射麻醉后,无菌条件下,取正中切口开腹,将盲肠移出腹腔,在其根部结扎,用号针贯穿次,挤出少量肠内容物,留置cm皮瓣防止针孔闭合,还纳盲肠于腹腔,缝合切口,置笼内活动,不禁饮食。对照组只开腹、关腹,不行盲肠结扎穿孔。每组又分为术后、、h个时间点组,每组只大鼠。ALI造模成功标准如下:①有肺上皮细胞及肺血管内皮细胞损伤的证据(血液、肺支气管灌洗液或肺组织局部有相应的细胞应子或酶的变化)②病理切片上轻度肺水肿,或仅有间质性水肿,无透明膜形成③有肺血管通透性升高的证据④氧分压下降,同时满足点即判定为负荷急性肺损伤模型。本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。检测指标及方法两组按不同时间点采颈动脉血mL,采用血气分析仪测定动脉血氧分压)。各观察时间点分别取各组大鼠只,用水合氯醛(mLg)(PaO腹腔注射麻醉,开胸经心脏取血,置于不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,rmin离心min将血清和红细胞迅速小心地分离,即得血清,于℃超低温冰箱保存。取右下肺组织用于测定肺湿干质量比(WD),左下肺组织测定伊文思蓝含量,留取适量肺组织,置于mLEP管中,并放适量RNA保存液,右肺组织用多聚甲醛溶液固定,用于石蜡包埋、备做HE染色及免疫组化。大鼠血清TNFα质量浓度检测严格按试剂盒操作说明书进行,选择nm波长进行检测,确定标准品和空白对照区域,由酶标检测仪自动检测计算并绘制标准曲线,计算检测结果。肺毛细血管通透性检测两组大鼠于麻醉后处死前min经尾静脉注射伊文思蓝,水合氯醛腹腔注射后开胸心脏取血,立即处死并取少量左下肺,将肺组织浸泡于甲酰胺溶液,℃恒温箱中温浴h,待组织中色素浸出,取出肺组织,离心min后取上清液,用分光光度计(波长nm)比色,根据标准曲线计算伊文思蓝的含量,以此反映肺血管壁通透性改变。肺WD比值测定将右下肺组织称质量(湿质量)后置于℃烘箱内,真空条件下烘烤h称干质量,计算肺WD比值。肺组织病理观察取右上肺组织置多聚甲醛溶液中,依次进行脱水、石蜡包埋、制成切片,苏木精伊红(HE)染色后光镜检查。医教论文RTPCR检测肺组织Slit及RobomRNA表达取右肺冷冻组织mg,按Trizol法常规提取组织总RNA,反转录合成cDNA,行逆转录PCR扩增,引物序列及扩增长度见表。Slit反应条件:℃min,℃s,℃s,℃min,共个循环。Robo反应条件:℃min,℃s,℃s,℃min,共个循环。内参βactin反应条件:℃min,℃s,℃s,℃min,共个循环。以SlitmRNA及RobomRNACt值分别与相应内参照基因βactinCt值的差值标化表示各项目的即应的表达量。肺组织中Slit及Robo免疫组化观察采用过氧化物酶标记的链霉卵白素法(SP法),将肺组织石蜡包埋、切片,常规脱蜡,磷酸盐缓冲液(PBS)溶液消除内源性过氧化物酶,胰蛋白酶修复后,正常兔血清封闭漂洗,HO非特异性抗原,各自滴加∶羊抗大鼠Slit抗体及∶羊抗大鼠Robo抗体,℃过夜。PBS漂洗后滴加辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗,℃孵育minPBS漂洗后,’二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染,脱水、透明、封片,光镜下观察,以细胞核呈棕黄色染色为阳性细胞。将免疫组化染色结果进行显微照相后,每张切片随机选取个视野,采用图像分析系统检测出每个视野的A值和面积,得出其单位面积的平均A值,作为该样本的染色强度。统计学方法使用SPSS统计软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析,以P<为差异具有统计学意义。结果PaO、肺毛细血管通透性、肺WD比、血清TNFα质量浓度在术后、、h均降低(P<),以h与对照组相比,ALI组PaO降低最明显。ALI组个时间点肺毛细血管通透性均高于对照组组(P<)。ALI组个时间点肺WD质量比值均高于对照组(P<),随着时间推移,比值逐渐上升,个时间点以h升高最明显。ALI组各时间点血清TNFα水平较对照组升高(P<),个时间点,以ALI组h升高最为显著(表)。肺组织病理学观察对照组大鼠肺泡大小均匀,结构完整,肺泡上皮细胞形态正常,肺泡间隔未见增宽,微血管无充血和淤血,肺间质间隙未见出血、水肿及炎性细胞浸润。ALI组可见:肺组织血管充血,血管周围间质水肿及密集的炎细胞浸润,肺泡隔水肿,肺泡腔内大量渗出,肺泡壁显著增厚,部分肺部上皮细胞变性、肿胀、脱落、间质灶性出血,肺泡腔变小,局限性肺不张(图)。SlitmRNA、RobomRNA表达变化ALI组大鼠各时间点肺组织SlitmRNA表达水平与对照组大鼠相比表达明显降低,差异具有统计学意义(P<),且随CLP术后时间延长,肺组织SlitmRNA表达水平呈逐渐降低趋势,个时间点中CLP术后h表达量最少。对照组与ALI组大鼠各时间点均可见肺组织RobomRNA表达,两组RobomRNA表达差异无统计学意义(P>)(图,图)。肺组织Slit及Robo免疫组化观察对照组均可见Slit及Robo蛋白表达,Slit主要表达于内皮细胞膜上,亦可表达于肺上皮细胞胞核及胞浆,Robo则只表达于内皮细胞膜上。ALI组大鼠各时间点肺组织Slit蛋白阳性染色表达部位无改变,随CLP术后时间的延长,肺组织Slit蛋白表达水平呈逐渐下降趋势,两组差异有统计学意义(P<),个时间点中CLP术后h表达量最少。ALI组亦可见Robo蛋白(图)表达于内皮细胞膜上,与对照组相比,Robo蛋白表达水平差异无统计学意义(P>)。见表,图、图。讨论下降,肺HE本实验中,健康大鼠行CLP术后,血清TNFα显著升高,PaO染色可见轻度肺水肿及间质性水肿,伊文思蓝测定示肺血管通透性升高,均满足文献报道的ALI造模成功标准,证明脓毒症ALI模型造模成功。在脓毒症致ALI发病过程中,白细胞在趋化因子的作用下,聚集于肺部,并黏附于肺血管内皮细胞,进而释放各种炎症因子如ILβ、IL、TNFα等,这些炎症因子又进一步促使内皮细胞表达多种黏附分子,促进内皮细胞活化及局部炎症的发展。血管内皮细胞在多种炎症因子刺激下,经过活化、损伤、凋亡的过程,导致肺血管通透性逐渐增高,引起组织水肿。组织水肿可进一步压迫周围组织,造成缺血缺氧。而缺氧又诱发组织VEGF表达增强而促进病理性血管新生。新生的微血管基底膜不完整,通透性高,可引起肺间质水肿、出血、肺不张及血流通气比例失调等现象。因此,肺血管内皮细胞既是ALI时的靶细胞也是效应细胞。分泌性糖蛋白Slit与其配体Robo最初只被定义为神经导向因子家族中的一员。在哺乳动物,Slit有个成员,即Slit、Slit和Slit,三者均可表达于神经系统中线,亦可表达于其他的细胞类型。Wu等研究发现,Slit作为一种分泌性的糖蛋白,可表达于血管内皮细胞。Roundabout蛋白是一种跨膜蛋白受体,亦称Robo受体,哺乳动物有种Robo受体,即Robo,,,。Robo和Robo在成熟个体的多数组织和器官中均有表达,但主要表达在发育中的神经系统,Robo只在发育中的中枢神经系统表达,而Robo则表达于内皮细胞中。新近有研究发现SlitRobo信号通路参与维持内皮细胞功能稳定。Jones等采用体外实验的方法,发现Slit能够抑制外源性血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)诱导的血管新生和渗漏,Slit并不能抑制VEGF诱发的VEGFR磷酸化,而是通过对其下游的Src家族非受体型络氨酸激酶(srcfamilynonreceptortyrosinekinases,SFKs)的抑制(SFKRac信号通路)产生上述效应的。Warren等提出,Slit与Robo结合可防止VE钙黏蛋白(VEcadherin)“内化”,稳定VE钙黏蛋白与P连环蛋白(Pcatenin)的连接,保持相邻内皮细胞紧密连接,避免间质水肿。同年另一课题组进一步发现,在内毒素、盲肠结扎穿孔术以及感染HN流感病毒的三种不同动物模型中,ILβ通过促进VE钙黏蛋白Tyr磷酸化,导致其“内化”,Slit与Robo结合后是通过抑制Tyr磷酸化,保持血管内皮完整性。本研究结果显示,应用RTPCR检测出正常大鼠肺组织表达了较高水平的SlitmRNA及RobomRNA。免疫组化染色表明,正常大鼠肺组织Slit主要表达在内皮细胞上,亦可表达于肺上皮细胞胞核及胞浆。CLP术后h肺组织SlitmRNA开始下降,个时间点中,h下降最明显。免疫组化染色显示ALI组Slit蛋白在CLP术后h开始下降,、、h均呈下降趋势,以h下降最明显。而ALI组及对照组均可见Robo基因和蛋白的表达,且表达水平较高。上述结果表明,CLP致ALI时,大鼠肺组织Slit的mRNA和蛋白表达水平均下降,其下降的趋势与肺水肿及肺毛细血管通透性增加的趋势相似,表明Slit可能参与了ALI的发生发展。综上所述,本实验检测到对照组大鼠肺组织表达了较高水平的Slit。当受到炎症打击等刺激时,其合成机制从转录水平受到抑制,继而蛋白表达下降,其下降程度与组织水肿加重、肺毛细血管通透性增加及动脉血氧分压降低的趋势相似,因此,本实验中Slit表达在个时间点中以h下降最明显。是何种原因导致Slit表达下降还需进一步研究。Slit及Robo可能成为今后临床干预脓毒症ALI的新靶点。

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