硅胶基质高效液相色谱填料研究进展

第 24 卷 第 1 期 2012 年 1 月 化 学 进 展 PROGRESS IN CHEMISTRY Vol． 24 No． 1 Jan．，2012 收稿:2011 年 5 月，收修改稿:2011 年 6 月 * 国家重点基础研究发展计划(973)项目(No． 2007CB914100，2011CB910404) ，国家自然科学基金(No． 21075039 / B050106) ，江苏省科技支撑计划社会发展项目(No． BE2010731)和大连市科学技术基金计划项目(No． 2009J22DW015) 资助 ＊＊Corresponding author e-mail:ici_njust@ yahoo． cn 硅胶基质高效液相色谱填料研究进展* 赵贝贝1 张 艳1 唐 涛1，2 王风云1＊＊ 张维冰2，3 李 彤2 (1. 南京理工大学工业化学研究所 南京 210094;2. 大连依利特 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 仪器有限公司 大连 116023; 3. 华东理工大学上海市功能性 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 化学重点实验室 上海 200237) 摘 要 高效液相色谱(HPLC)不仅是一种有效的分析分离手段，也是一种重要的高效制备分离技术。 色谱柱是 HPLC 系统的核心，不同性能的填料是 HPLC 广泛应用的基础。硅胶是开发最早、研究最为深入、 应用最为广泛的 HPLC 固定相基质，其制备方法主要有喷雾干燥法、溶胶-凝胶法、聚合诱导胶体凝聚法及模 板法等。近年来，亚 2μm 小粒径硅胶、核-壳型硅胶、双孔径硅胶、介孔性硅胶、有机杂化硅胶等新型硅胶应 用于 HPLC 并取得了色谱分离技术的飞速发展，例如基于亚 2μm 填料的超高压液相色谱技术、基于核-壳型 填料的快速分离技术、基于杂化硅胶填料的高温液相色谱技术等。硅胶经 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面化学键合、聚合物包覆等有机 改性可制得先进的大分子限进填料、温敏性填料、手性填料等，大大扩展了 HPLC 的应用范围。本文对液相 色谱用硅胶的制备方法、改性与修饰方法以及硅胶基质固定相的评价方法加以系统综述，概述了新型硅胶在 HPLC 中的应用进展，并对硅胶基质填料的发展方向与应用前景进行了展望。 关键词 高效液相色谱 硅胶 填料 中图分类号:O657. 7 文献标识码:A 文章编号:1005-281X(2012)01-0122-09 Silica Based Stationary Phases for High Performance Liquid Chromatography Zhao Beibei1 Zhang Yan1 Tang Tao1，2 Wang Fengyun1＊＊ Zhang Weibing2，3 Li Tong2 (1. Chemical Engineering Institute，Nanjing University of Science and Technology，Nanjing 210094，China; 2. Dalian Elite Analytical Instruments Co．，Ltd．，Dalian 116023，China;3. Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China) Abstract High performance liquid chromatography is not only a useful analytical technique，but also an effective preparation method． The availability of a variety of stationary phases for column has been a key factor in the development of HPLC as a major scientific tool． With the most desirable compromise of properties that provide for effective and reproducible separations，silica has been the most widely used HPLC packing material． The silica microspheres are synthesized by various methods，including spray drying，sol-gel，polymerization induced colloid aggregation and templating methods． In recent years，atypical types of silica are prepared and applied in HPLC， such as sub-2μm silica particles，superficially porous silica particles，bimodal silica particles，mesoporous silica particles，organic / silica hybrid particles，etc． As a result，unique separation properties that enlarge the capabilities of HPLC methods have been achieved，such as ultrahigh-pressure liquid chromatography based on sub-2μm silica particles，fast liquid chromatography based on superficially porous silica particles， high temperature liquid chromatography based on organic / silica hybrid particles． Moreover，novel stationary phase can be obtained by 第 1 期 赵贝贝等 硅胶基质高效液相色谱填料研究进展 ·123· chemical bonding or polymer modification of silica surface，such as chiral stationary phase，temperature-responsive stationary phase and restricted access materials． In this paper，the preparation methods and modification modes of silica particles are introduced，as well as the characterization methods of HPLC stationary phase． The applications of silica packing material in HPLC and its developing trends are also outlined． Key words high performance liquid chromatography (HPLC) ;silica;packing material Contents 1 Introduction 2 Preparation methods of silica 2. 1 Spray drying method 2. 2 Polymerization induced colloid aggregation method 2. 3 One-step catalytic sol-gel method 2. 4 Two-step catalytic sol-gel method 2. 5 Templating method 2. 6 Preparation methods of atypical silica 2. 7 Preparation methods of organic / silica hybrid particles 3 Modification methods and characterization methods of silica 3. 1 Modification of silica 3. 2 Characterization of silica based packing materials 4 Application of silica based packing materials 4. 1 Application of atypical silica 4. 2 Application of organic / silica hybrid particles 5 Conclusions and outlook 1 引言 HPLC 不仅是一种有效的分析分离手段，也是 一种重要的高效制备分离技术，其选择性好、分离效 能高，广泛应用于生物、化工、医药食品、环保、石油 化工等领域。色谱柱是 HPLC 系统的核心，能够产 生有效分离的色谱填料技术的发展，是 HPLC 技术 发展的一个有效驱动力［1］。 常用的 HPLC 柱填料类型按基质不同可分为三 类:无机基质、有机基质和有机-无机复合基质填 料［2］。无机基质填料机械强度高，在任何介质中均 呈现不可压缩性，且色谱柱柱效高，是色谱填料研究 和应用的主流［3，4］。硅胶以其柱效高、机械强度高， 物理性质如粒径分布、孔结构、比表面积易于控制， 表面易改性等优点，是最主要的 HPLC 固定相基质。 早期经典液相色谱填料通常是 30—40μm、40— 60μm 或更大粒径的不定形硅胶，这些硅胶由更大 粒径的硅胶研磨，再经过粒径分级得到，柱效仅为 1 000 /m;20 世纪 70 年代后期，5—10μm 不定形硅 胶填料应用于 HPLC，柱效25 000 /m;80 年代至今， 在分析型色谱柱领域，5—10μm 球形硅胶填料逐渐 取 代 无 定 形 硅 胶 填 料，柱 效 可 达 50 000— 80 000 /m［5］;90 年代初，亚 2μm 硅胶填料用于 HPLC 的快速分离成为一种新的发展趋势［6，7］。有 机基质材料主要为有机聚合物和石墨碳，此类材料 克服了硅胶基质填料不耐强酸强碱的缺点，化学稳 定性好，pH 值适用范围宽，疏水保留性很强，近年来 获得飞速的发展［8—10］。与相同粒度硅胶基质色谱 柱相比，其主要缺点是柱效低，且在不同有机改性剂 中溶胀程度不同，只能应用于单一有机改性剂的等 度分离。有机-无机复合材料结合了无机材料的高 效性、优良的机械强度以及有机材料的耐热性、pH 使用范围宽等特点，日益受到人们的重视［11—13］。 Unger 等［1］概述了自 HPLC 问世 50 年来色谱柱 的发展历程与目前研究现状，并展望了 HPLC 的未 来发展方向。钱小红等［14］阐述了点击化学法、原子 转移自由基聚合法、电荷转移法等新型硅胶化学键 合固定相的键合反应机制和分离效果。Jiang 等［15］ 综述了硅胶基质固定相在亲水作用色谱(HILIC)、 手性分离色谱、离子色谱中的应用。本文以液相色 谱用硅胶微球为核心，详细介绍了其制备方法、改性 与修饰方法，以及硅胶基质固定相的评价方法，概述 了新型硅胶在 HPLC 中的应用进展，展望了硅胶基 质填料的发展方向。 2 硅胶的制备 目前，超纯硅胶微球的制备一般以正硅酸乙酯 (TEOS)为硅源，采用喷雾干燥法、聚合诱导胶体聚 集法(PICA)［16—18］、一次催化溶胶-凝胶法［19—22］、二 次催化溶胶-凝胶法［23—29］、模板法［30—39］ 等 方法 制备。 2. 1 喷雾干燥法 喷雾干燥法是在不融合的两相条件下使硅酸盐 聚合生成溶胶，再将硅溶胶喷雾成形变为凝胶，然后 在热气流或石蜡油等分散剂中固化得到最终的硅胶 ·124· 化 学 进 展 第 24 卷 微球产品，这是目前催化剂等化工产品用硅胶的最 主要制备方法之一。制得微球粒径分布范围一般较 宽，用作 HPLC 填料分级必不可少。目前市场上平 均孔径在 6—12nm，比表面积在 300—500m2·g － 1范 围的多孔硅胶微球，如国产的 YQG 型、瑞典的 Kromasil、德国的 Nuclesil 等均采用该方法制备。 2. 2 聚合诱导胶体聚集法 图 1 PICA 法制得硅胶微球扫描电镜图 Fig． 1 SEM images of silica particles prepared by PICA method，particle size: (a)5. 0μm; (b)2. 0μm 聚合诱导胶体聚集法，又称堆积硅珠法，是通过 在硅溶胶分散体系中的聚合反应，将纳米级硅溶胶 包结成有机-无机复合微球，烧结除去有机物后得到 全多孔硅胶微球［16，17］，该法可以得到粒度均匀微 球，以该法生产的典型代表是美国 Agilent 公司生产 的 Zorbax 硅胶。由于受原料硅溶胶影响，该法制得 硅胶微球金属杂质含量较高，总金属含量一般在 1 000ppm 以上。张庆合［18］以 TEOS 为硅源，将溶 胶-凝胶法与 PICA 法相结合，首先在碱性条件下使 TEOS 水解缩聚得到硅溶胶，再经聚合诱导反应得 到硅胶微球，金属杂质含量约为 150ppm。但该反应 过程复杂，反应条件不易控制，尤其是 TEOS 水解缩 聚程度极易受外界条件影响，且成本较高，不利于工 业化生产。作者所在实验室长期致力于超纯硅胶微 球的制备研究，目前已掌握 PICA 制备硅胶微球的 核心技术，采用不同粒度的硅溶胶可制得比表面积 10—300m2 / g，孔径 5—30nm 的硅胶微球，图 1 为实 验室自制全多孔硅胶微球的扫描电镜图。 2. 3 一次催化溶胶-凝胶法 溶胶-凝胶法是制备硅胶微球的常用方法，通常 在酸性或碱性条件下使硅源水解缩聚得到硅胶微 球。酸性条件下，硅源水解速率大于其缩聚速率，易 形成多孔性结构;而在 pH = 7—9 条件下，硅源缩聚 速率大于其水解速率，易形成无孔的凝胶状结构。 传统的 Stber 法很难制备出微米级硅胶微球。在一 步反应溶胶-凝胶法基础上，种子生长法先制得小粒 径硅胶晶核，再向晶核中缓慢滴加硅源溶液和氨水 的醇溶液，使晶核缓慢生长，可制得微米级单分散硅 胶微球，该法的关键在于控制二次成核［19］。通常， 采用较高初始浓度的硅源溶液以形成较多数量的初 始晶核，或采用极低的硅源滴加速率以降低晶核的 生长速率可有效防止二次成核的发生，但很难制备 出较大粒径的硅胶微球［20，21］。由于晶核的孔在后 续生长过程中逐渐闭合，该法制得的硅胶微球完全 无孔。作者所在实验室采用低温成核的种子生长 法，先在较低温度下制得晶核，再在常温条件下使晶 核缓慢生长，制得 1. 0—4. 7μm 的单分散性硅胶微 球，图 2 为实验室自制无孔硅胶微球的扫描电镜 图［22］。 图 2 一次催化溶胶-凝胶法制得硅胶微球扫描电镜 图［22］ Fig． 2 SEM images of silica particles prepared by one-step catalytic sol-gel method，particle size: (a)4. 7μm; (b) 2. 0μm［22］ 第 1 期 赵贝贝等 硅胶基质高效液相色谱填料研究进展 ·125· 2. 4 二次催化溶胶-凝胶法 二次催化的溶胶-凝胶法，先在酸性条件下将 TEOS 催化水解得到一定分子量的交联溶胶，再在 碱性条件下将溶胶凝胶、老化，得到粒度范围较宽的 多孔性硅胶微球。催化过程中反应物浓度、温度、 pH 值，以及硅源种类等条件对硅胶粒度、结构的影 响已得到详细探讨［23，24］。在二次催化水解过程中 加入模板物质，有助于调控硅胶孔结构，制得粒度均 匀、孔结构均一的硅胶微球。Choi 等［25］以正硅酸甲 酯(TMOS)为硅源，以聚环氧乙烷、聚环氧丙烷为模 板物质，制得孔结构规整的硅胶。Hohenesche 等［26］ 以硅酸乙酯 40(TES40)为硅源、N，N-二甲基甲酰胺 (DMF)为模板物质，两步水解缩聚制得平均粒径为 6μm 的硅胶微球，并用作液相色谱填料。该法制得 多孔性硅胶微球孔结构均一，孔径分布窄，但粒度分 布范围宽，作为液相色谱填料分级必不可少。作者 所在实验室采用二次催化溶胶-凝胶法制得多孔性 硅胶微球，并研究了微量电解质对微球粒径的影 响［27］。结果表明，乳状液中分散液滴大小随电解质 浓度的增加而增大，从而硅胶微球粒径也增大。图 3(a)为二次催化溶胶-凝胶法制得硅胶微球扫描电 镜图。硅胶制备过程的监控以及重现性的实现方面 鲜有报道。Hohenesche 等［26］ 通过对聚硅酸乙酯 (PES)黏度大小的控制实现硅胶微球制备的重现 性。杨新立［28］以基质辅助激光解吸电离飞行时间 质谱法(MALDI-TOF MS)法测定 PES 分子量，指出 PES 平均分子量在 610—3 000范围内可制得多孔硅 胶微球。作者所在实验室采用凝胶渗透色谱法，通 过对原料 TES40、中间产物 PES 分子量的在线测定， 实现了对反应过程的监控，如图 3(b)所示［29］。 2. 5 模板法 模板法是在传统溶胶凝胶体系中引入模板物 质，在溶剂存在的条件下使模板剂对硅源进行引导， 从而生成具有纳米有序结构的介孔性硅胶。其主要 优点是可通过模板物质对硅胶孔结构进行调控，且 制得 硅 胶 微 球 比 表 面 积 大，一 般 为 500— 1 500m2 / g;主要缺点是成本较高，不利于工业化生 产，且制得硅胶微球孔径较小，一般为 2—5nm，制备 较大孔径硅胶需经水热法扩孔。应用于 HPLC 填料 的介孔性硅胶主要有 MCM-41、MCM-48、FSM-16、 APMS、SBA-15 等类型，经有机改性可应用于体积排 阻、正相、反相、手性等多种分离模式［30—33］。Unger 等［7］以十二烷基胺、十六烷基胺为模板物质，制备 出亚 2μm 多孔硅胶微球，用作微型色谱柱填料，分 图 3 (a)二次催化溶胶-凝胶法制得硅胶微球扫描电镜 图［27］; (b)PES 平均分子量与硅胶微球粒径重现性［29］ Fig． 3 (a)SEM images of silica particles prepared by two- step catalytic sol-gel method［27］; (b) Reproducibility of average molecular weight of PES and diameter of silica microspheres［29］ 离小分子有机物，分离速度快、分离效果好。Hao 等［34］以 P123 为模板，十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)为助表面活性剂，乙醇为溶剂制得 SBA-15 型硅胶，比表面积 700m2 / g，可用作液相色谱填料。 Wan 等［35］以 P123 为模板，1，3，5-三甲苯为助表面 活性剂，在体系中加入 KCl，制得孔径 10—20nm、粒 径 2—5μm 的 SBA-15 型硅胶，用于分离小分子物质 以及蛋白质等大分子物质效果均较好。Liu 等［36］和 Ai 等［37］制备出粒径亚 1μm 的 SBA-15 型硅胶，并将 其应用于超高效液相色谱系统(UPLC) ，可实现高 速、高灵敏度的分离。Yang 等［38，39］以 F127 为模板 物质，PEG 为助表面活性剂，经两步 pH 诱导胶体凝 聚反应制得孔结构均匀的微米级硅胶微球，并应用 于 HPLC 填料。 2. 6 特殊结构硅胶微球的制备 应用于 HPLC 填料的硅胶微球主要有全多孔型 和无孔型两种类型硅胶微球。此外，还有核 /壳型、 大孔型、双孔径等结构类型的硅胶微球［40］。 Kirkland 等［41］将实心硅胶微球引入到聚合诱 导胶体凝聚体系中，此时实心硅胶微球起到了凝结 ·126· 化 学 进 展 第 24 卷 核的作用，脲 /醛树脂包结硅溶胶包覆在实心硅胶表 面，再经热处理去除有机物得到核 /壳型硅胶微球。 2010 年，美国 Advanced Materials Technology 公司推 出一种新型 Halo 色谱柱，2. 7μm 粒径的硅胶微球由 1. 7μm 的无孔核和 0. 5μm 的多孔壳组成，微球比表 面积 150m2 / g，平均孔径 9nm。Faria 等［42］采用 LBL- SA (layer-by-layer self-assembly)技术，制得以多孔 硅胶微球为核，以纳米锆溶胶为壳的硅胶表面自组 装多层纳米氧化锆微球。硅胶核提供规整球形、高 比表面积、优异的机械强度，硅胶表面活性基团提供 核 /壳共聚位点;锆溶胶、钛溶胶等隋性材料的壳层 遮盖了硅胶表面，克服了硅胶基质固定相 pH 值适 用范围窄、残余硅羟基影响分离的缺点［43，44］。Liang 等［45］采用该技术制得了硅胶表面自组装多层碳钠 米管微球，表面未经键合以 π-π 电子作用分离有 机物。 Tanaka 等［46］发展了一种相分离的溶胶-凝胶 法，高聚物存在的条件下，TMOS 发生溶胶-凝胶反 应伴随着相分离现象，从而生成具有大孔结构的硅 胶微球，再经溶剂交换作用，在不影响大孔结构的情 况下生成中孔结构的内联孔。大孔有利于溶质的快 速传质，内联孔为液相分离提供了大的比表面积。 因此该硅胶经表面改性用作 HPLC 填料柱压相对较 低，增大流速可在较低压力下实现 HPLC 的快速分 离。Wei 等［47］以 TEOS 为硅源，以聚环氧乙烷为表 面活性剂，通过乳液法制得同时具有大孔结构和中 孔结构的硅胶微球。 2. 7 杂化硅胶的制备 与超纯硅胶微球的制备方法相似，无孔杂化硅 胶微球的制备采用一次催化溶胶-凝胶法，多孔性杂 化硅胶微球的制备采用二次催化溶胶-凝胶法和模 板法。超纯硅胶微球的制备常以 TEOS 为硅源，而 杂化硅胶微球的制备则以 TEOS 和有机硅氧烷为混 合硅源，以引入有机杂化基团［48］。美国 Waters 公 司以二次催化溶胶-凝胶法制备出甲基、乙基、桥联 乙基、乙烯基、苯基等多种类型杂化硅胶微球，并实 现其商品化;该法的主要缺点是制得硅胶微球粒度 分布范围宽，用作 HPLC 填料需经粒度分级［49］。 Guo 等［50］以四甲氧基硅烷、巯基丙基三甲氧基硅烷 为硅源，以 P123 为表面活性剂，CTAB 为助表面活 性剂，通过模板法制得巯基杂化 SBA-15 型介孔硅 胶微球，比表面积达 718m2 / g。Li 等［51］以 TEOS 和 乙烯基三乙基硅烷(VTEOS)为混合硅源，通过一次 催化溶胶-凝胶法制得无孔乙烯杂化硅胶微球，再以 硅胶表面乙烯基为偶联剂，在其表面包覆聚苯乙烯- 二乙烯苯(PS-DVB) ，可用作毛细管电色谱(CEC)固 定相。 3 硅胶的改性与评价 3. 1 硅胶的改性 硅胶经表面改性可制得适用于不同分离模式的 色谱填料，这种改性与修饰一般通过三种方法实现: 表面的化学修饰、整体修饰和聚合物包覆［52］。 表面的化学修饰是通过化学反应将不同的有机 基团键合到硅胶表面的游离硅羟基上对硅胶进行改 性，是目前应用最为广泛的改性方法。但由于空间 位阻效应，硅胶表面硅羟基不可能全部与硅烷化试 剂反应，在分离一些易离解化合物和碱性化合物时， 残余硅羟基严重影响了色谱分离效果，导致色谱峰 拖尾，柱效降低。此外，硅胶在 pH ＞ 8 条件下易溶 解，硅胶键合相在 pH ＜ 2 条件下易脱落。为解决硅 胶化学稳定性差、pH 值适用范围窄的问题，色谱工 作者做了一系列的尝试工作，如多层键合固定相、立 体保护固定相、封尾、双配位固定相、包埋极性固定 相等［53，54］。Chice 等［55］在孔径为 6nm 的多孔硅胶 内表面结合 C8 疏水基团，外表面结合烷基二醇基 亲水基团，制得大分子蛋白质限进填料，该填料能够 阻止大分子蛋白的吸附，实现小分子目标物质的分 离。He 等［56］将南极假丝酵母脂肪酶 B (Candida antarctica lipase B)键合至多孔硅胶表面，制得一种 新型手性固定相(CSP) ，用于芳香醇、烯唑醇对映体 的分离。此外，近年来最新兴起的点击化学法、原子 转移自由基聚合法、电荷转移法键合硅胶固定相逐 渐吸引了人们的注意，佟巍等［14］详细介绍了其研究 进展。这些方法尚不能取代目前最为常用的 C18 固定相，原理也不十分明确，但作为一种新兴科技， 不仅在特定的领域有着突出贡献，同时也推动了化 学键合固定相的发展。 聚合物包覆硅胶固定相兼具无机基质材料和聚 合物型填料的优点，作为基质的无机材料可提供规 整而均匀的球形，较好的机械强度，可控的孔结构及 较大的比表面积，其表面丰富的硅羟基也为聚合物 提供了足够多的位点;聚合物包覆层可以完全遮盖 硅胶表面，以屏蔽硅胶表面残余硅羟基，且减少碱性 条件下硅胶的溶解。早期包覆型填料的制备主要采 用物理包覆法，目前更常用的是化学键合或复合型 包覆法，常见的包覆聚合物类型有聚苯乙烯、聚(苯 乙烯-二乙烯苯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)等多种类 第 1 期 赵贝贝等 硅胶基质高效液相色谱填料研究进展 ·127· 型［57，58］。Burdukova 等［59］ 和 Kanazawa 等［60］ 将 聚 (N-异丙基丙烯酰胺)键合于硅胶表面得到具有温 敏特性的聚合物包覆固定相，可分别在不同温度下 分离亲水性物质、疏水性物质。Mallik 等［61］以原子 转移自由基聚合法制得高密度的十八烷基丙烯酸包 覆硅胶基质固定相，高温条件下色谱性能优异。此 外，将聚氧乙烯键合在反相色谱填料外表面，形成一 种半渗透的亲水层，即为半渗透表面填料，该填料能 有效阻止蛋白大分子进入内层疏水固定相，同时实 现小分子目标物质的分离［62］。包覆型填料的主要 问题在于其制备重现性、稳定性较差，有关聚合物包 覆硅胶填料重复性的数据尚缺乏。 3. 2 硅胶基质填料的评价 保留机理决定了色谱柱的选择性，因此确定固 定相的结构与性能，从而确定保留机理极为重要。 色谱柱的质量依赖于很多因素，最重要的就是色谱 柱装填的均一性和化学键合固定相在吸收剂表面分 布的均一性，这些因素决定了色谱数据的重现性。 体现这些因素的参数有多种类型，因此色谱柱评价 方法也具有多样性［63］。色谱柱评价方法分为两大 类:色谱法和非色谱法。非色谱法常采用红外、核磁 等波谱分析法或元素分析仪、氮气或氦气吸附、扫描 电子显微镜(SEM)、热重力分析等物理分析方法来 反映色谱填料的键合量、键合方式、是否封尾、比表 面积以及填料疏水性等［64］。Krupczynska 等［63］详细 介绍了氮气吸附、X 射线荧光、傅里叶红外、核磁等 物理化学方法表征色谱填料性能的基本原理，以及 比表面积、表面覆盖密度等参数的计算方法。Xiong 等［65］采用频率扫描四极离子阱质谱法同时评价了 填料比表面积、粒度分布及碳载量。 Buszewski 等［66］以乙腈吸附等温线法评价了反相色谱固定相 表面键合密度及碳载量。 色谱法是利用色谱手段对色谱填料及色谱柱性 能进行表征，其优点是不需破坏色谱柱，无需使用其 他仪器，在不影响色谱性能的基础上做评价，而且能 更直观反映不同色谱柱的性能差异。因此，色谱法 应用广泛，一直是科学研究的热点之一。色谱法可 分为三类:第一类是在专门应用条件针对某些实际 样品的分析提出柱效、分辨率和峰对称性要求;第 二类是由生产厂家提供的评价方法，多选择实验室 常规测试物，色谱柱评价 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 一般给出色谱柱的基 本参数，如柱长、内径、死体积、柱效、不对称度、柱压 降、填料的种类、粒度等;第三类是通过评价色谱柱 的色谱性能来表征填料的性质，如疏水性、硅羟基活 性、离子交换性能、金属残留量、化学稳定性等。 Tanaka 提出用 6 个参数来评价反相固定相的 特性，并根据参数对不同方法制备的反相键合固定 相进行分类，首次将定性的色谱填料评价量化，对以 后该领域的研究产生了深远影响。Dehouck 等［67］ 以聚苯乙烯的保留评价孔体积，以大分子物质聚甲 基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯保留的差异评价硅羟基残 余活性，或以聚环氧乙烯、聚乙烯吡啶等强极性大分 子物质的保留特性评价硅羟基残余活性。美国国家 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 局(National Institute of Standard ＆ Technology) 也制定了反相色谱柱评价的相关标准，如:Standard Reference Material 869a［68］(SRM869a)和 Standard Reference Material 870a［69］(SRM870a)。SRM869a 法以一组多环芳烃化合物(苯并芘、四苯并菲、菲酚 并菲)的出峰顺序表征色谱柱填料为非交联型或交 联型;SRM870a 法以阿米替林不对称度评价填料残 余硅羟基活性，以 1，4-二羟基蒽醌评价填料金属杂 质含量，这些标准对色谱柱的选择具有一定指导意 义。Visky 等［70］以一组小分子物质评价色谱柱孔径 大小、是否碱脱活、是否封尾、是否极性封尾，并根据 评价参数将 69 种反相色谱柱分类，最后以阿司匹林 的分离为例，根据评价结果选择合适的色谱柱。填 料的化学稳定性包括不同 pH 值条件下的稳定性和 不同温度条件下的稳定性，由连续分离样品的保留 时间 和 柱 效 随 时 间 的 变 化 来 衡 量。 Ye［71］ 和 Claessens 等［72］比较了双配位固定相、聚合物包覆固 定相、包埋极性固定相等多种类型硅胶基质固定相 在不同 pH 值、不同柱温条件下的稳定性，为色谱柱 选择提供了理论依据。Liu 等［73］考察了桥式乙烷 / 硅胶杂化 C18 固定相在柱温 150—200℃条件下使 用纯水作流动相的稳定性，结果表明其化学稳定性 优于甲基 /硅胶杂化固定相。Neue［74］评述了近年来 色谱法评价的最新研究进展，并提出温度是色谱填 料评价的一项重要内容。 4 硅胶基质填料的应用 4. 1 不同结构硅胶基质填料的应用 目前分析型液相色谱最常用的填料为 3—5μm 全多孔性硅胶基质填料，而工业制备型液相色谱则 多采用 5—10μm 的较大粒径硅胶基质填料。一般 情况下，为减小传质阻力、达到有效分离，填料的平 均孔径需比分析样品的水力粒径大 4 倍。平均孔径 10—12nm 的填料，其比表面积约为 300m2 / g，主要 应用于低分子质量样品的分离和制药领域;孔径 ·128· 化 学 进 展 第 24 卷 30nm 的填料主要用于分子质量20 000—50 000 Da 高分子物质的分离;而孔径大于 50nm，比表面积低 于 50m2 / g 的大孔填料，则常用于聚合物和生物大分 子物质的分离。 20 世纪 90 年代以来，亚 2μm 的硅胶基质填料 用于 HPLC 的快速分离显示出明显的优越性。依据 Van Deemeter 方程，随着颗粒度的不断降低，相应的 理论塔板高度(HETP)也下降，得到的柱效会更高。 当填料颗粒小于 2μm 时，不仅色谱柱柱效明显提 高，而且随着线速度或流速的增加，分离效率并不降 低，采用高线速度可将分离速度和峰容量扩展到一 个新的极限，但同时柱压也显著升高［75，76］。亚 2μm 无孔硅胶基质填料以正向、反向、离子、疏水色谱等 形式分离生物大分子，分析速度快、效率高［77］。小 粒径填料需要特殊的液相色谱体系相匹配，色谱柱 柱长应相对较短，且有一定多孔性的筛板以阻挡颗 粒流出;色谱柱内径需减小至 2mm 或更小，与之适 应进样量、检测池体积也应相应减小，以减小摩擦 热，降低柱温［78］。2μm 填料柱与质谱检测器联用可 满足当前制药、化学领域高灵敏度、高速分离的需 要［79］。此外，亚微米填料的另一个重要应用领域是 毛细管电色谱柱［80］。 早期的核 /壳型填料包含一个 30—40μm 的实 心核和约 1μm 的多孔壳层，比表面积 1—30m2 / g， 在全多孔硅胶微球应用于 HPLC 之前已被用作色谱 柱填料。与无孔填料相比，其比表面积、样品载样量 均显著增大。目前，此类填料在市场上仍有售，主要 用作预柱填料。Kirkland 等［40］将自制 5μm 核壳型 填料用于蛋白质、核苷酸等生物大分子的快速分离， 与亚 2μm 无孔填料相比，该填料样品载样量大、柱 压低，用于液相分离不需要特殊的仪器与之相配套。 Naeem 等［81］将核壳型填料用于麦谷蛋白亚基的快 速分离，与常规 5μm 填料相比，分离速度快，分离效 果好。美国 Waters 公司的 Halo 色谱柱采用 2. 7μm 的核 /壳型填料，由 1. 7μm 的实心核和 0. 5μm 的多 孔壳组成，涡流扩散项小，适用于快速分离。Gritty 和 Guiochon［82］研究表明，Halo 柱对低分子物质的快 速分离效果好，但由于高流速条件下传质阻力项大， 其对高分子物质的分离效果相对较差。与 Halo 色 谱柱类似，美国 Sigma-Aldrich 公司 2010 年新推出 Ascentis Express 系列 2. 7μm 核 /壳型填料色谱柱， 用于 HPLC 的快速分离［83］。 4. 2 杂化硅胶基质填料的应用 杂化硅胶基质填料显著的优点是机械强度强、 化学稳定性好，与超纯硅胶基质填料相比，其 pH 值 适用范围更宽、在高温条件下稳定性更好。此外，由 于杂化硅胶基质填料表面一部分硅羟基被有机基团 代替，碱性物质拖尾的问题得到了明显改善［13］。20 世纪初，Waters 公司先后推出甲基 /硅胶杂化的第一 代杂化技术(Xterra)和桥式乙基硅氧烷 /硅胶杂化 的第二代杂化技术(BEH)［84，85］。基于亚 2μm 杂化 填料技术，美国 Waters 公司 2004 年推出的超高效 液 相 色 谱 系 统 (ultra performance liquid chromatography，UPLC) ，取得了液相色谱速度、灵敏 度和分离度的显著提升。2010 年，Waters 公司又推 出新型表层带电杂化技术———XSelected 色谱柱，其 pH 使用范围更宽，性能更为优异。 Liu 等［86］将 C18 键合 5μm BEH 色谱柱应用于 超高温液相色谱系统(HTLC) ，当柱温升至 80— 200℃时，流动相黏度可降至常温下的 1 /5 至 1 /10， 流速的增加不会引起柱压的明显升高。因此，HTLC 可在常压条件下实现液相色谱的快速分离。此外， 在高温条件下流动相的极性显著降低，HTLC 系统 可采用较低有机溶剂量的流动相，使用纯水作流动 相成为可能。柱温超过 100℃时，高压条件下水分 子不再是一种连续的状态，而变为由许多个水分子 组成的分子簇，且温度越高，分子簇越小，该分子簇 的性质类似于极性有机物，且有机小分子可溶于该 分子簇［87］。实验结果表明，200℃柱温条件下使用 纯水作流动相连续 1 个月，色谱柱稳定性良好。 Nguyen 等［88］将亚 2μm 杂化硅胶基质填料色谱柱应 用于高温色谱，实现了 UPLC 与 HTLC 的结合，与常 温相比，90℃柱温条件下色谱分离速度更快。Lurie 等［89］将亚 2μm 填料色谱柱在 95℃柱温条件下分离 胆固醇类复杂有机物，未见样品分解，分离效果好。 5 结论与展望 随着色谱技术在生物、医药、环境等领域的广泛 应用，人们对硅胶纯度、形貌、粒度及其分布、化学稳 定性、机械稳定性的要求越来越高。因此，超纯硅胶 微球、杂化硅胶微球、特殊结构硅胶微球的制备及色 谱分离机理仍然是研究的热点。尤其是适用于超高 压色谱、高温色谱，化学稳定性好、机械强度高的色 谱填料的制备是色谱工作者需要解决的关键问题。 应用多种合成手段，以消除硅胶基质填料中残余硅 羟基与分离物质的作用，是目前色谱填料的研究方 向之一。此外，针对特殊结构样品、复杂样品的分 离，发展不同结构、不同性能固定相的制备，并研究 第 1 期 赵贝贝等 硅胶基质高效液相色谱填料研究进展 ·129· 色谱分离机理也是硅胶基质填料重要的发展方向。 参 考 文 献 ［1］ Unger K K，Skudas R，Schulte M M． J． Chromatogr． A，2008， 1184:393—415 ［2］ Nawrocki J， Dunlap C， Mccormick A， Carr P W． J． Chromatogr． A，2004，1028:1—30 ［3］ Paek C，McCormick A V，Carr P W． J． Chromatogr． A，2010， 1217:6475—6483 ［4］ Huai Q Y，Wang X L，Zuo Y M． Chromatographia，2002，55: 637—645 ［5］ Kirkland J J，DeStefano J J． J． Chromatogr． A，2006，1126: 50—57 ［6］ Ai F，Li L，Ng S C，Tan T T Y． J． Chromatogr． A，2010， 1217:7502—7506 ［7］ Unger K K，Kumar D，Grun M，Buchel G，Ludtke S，Adam T， Schumacher K，Renker S． J． Chromatogr． A，2000，892: 47—55 ［8］ Uzun L，Yavuz H，Say R． Ind． Eng． Chem． Res． ，2004，43: 6507—6513 ［9］ Haginaka J． J． Chromatogr． B，2008，866:3—13 ［10］ West C，Elfakir C，Lafosse M． J． Chromatogr． A，2010，1217: 3201—3216 ［11］ Davies N H，Euerby M R，McCaller D V． J． Chromatogr． A， 2008，1178:71—78 ［12］ Pelletier S，Lucy C A． J． Chromatogr． A，2006，1125:189— 194 ［13］ 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