[doc] 五倍子水提取物对牙龈卟啉菌膜泡抑制牙周膜成纤维细胞生物活性的影响

[doc] 五倍子水提取物对牙龈卟啉菌膜泡抑制牙周膜成纤维细胞生物活性的影响 五倍子水提取物对牙龈卟啉菌膜泡抑制牙 周膜成纤维细胞生物活性的影响 牙体牙髓牙周病学杂志(ChinJConservDent)2007,17(12) 五倍子水提取物对牙龈卟啉菌膜泡抑制牙周膜 成纤维细胞生物活性的影响 张良,唐荣银,倪龙兴 (1.北京军区总医院第二门诊部,北京100026;2.第四军医大学口腔医学院,陕西西安710032) [摘要]目的:探讨五倍子水提取物对牙龈卟啉菌 (Porphyromonasgingivalis%)膜泡(extracellular vesiclesECV)抑制牙周膜成纤维细胞生物活性的影响.方法:采用体外培养的人牙周膜成纤维细胞,用H— TdR掺入方法,检测ECV对人牙周膜成纤维细胞DNA合成的影响,以及中药五倍子提取物对ECV这一生物活 性的阻断作用.结果:细胞培养物中加入50g/mLECV时,人牙周膜成纤维细胞DNA的合成受到明显抑制, 与空白对照组相比P<0.01.当同时加入各浓度五倍子水提取物时其DNA合成量明显增加,与ECV组相比均 (P<0.05),且随五倍子水提取物浓度升高,DNA的合成量也随之增高,并呈一定浓度依赖性.结论:适宜浓度 的五倍子提取物可有效地阻断ECV的这种生物活性作用,从而可推 测其对牙周病的发生,发展能起到一定的 阻断作用. [关键词]五倍子;牙龈卟啉菌;膜泡;牙周膜成纤维细胞 [中图分类号]R780.2[文献标识码]A[文章编 号]1005—2593(2007)12—0695—03 [牙体牙髓牙周病学杂志,2007,17(12):695] Effectofchinesenutgallextractonbiologicalactivityofhuman periodontalligamentfibroblastsinhibitedbyPorphyromonas gingivalismembraneextracellularvesicles ZHANGLiang,TANGRong—yin,NI【Jong—xin (SecondoutPatientaepa.-ment,GeneralHospitalofBeijingMilitaryRegion,Beo’ing100026,China) [Abstract]AIM:Tostudytheeffectofchinesenutgallextractonbiologicalactivityofhumanperiodontalliga— mentfibroblastsinhibitedbyPorphyromonasgingivalismembraneextracellularvesicles(ECV).METHODS:H—TdR incorporationmethodwasusedtoexaminethesynthesisofDNAinculturedhumanperiodontalligamentfibroblastsstimu— latedbyECVandblockingroleofchinesenutgallextractonECV.RESULTS:Comparedwithcontrolgroup,thesynthe— sisofDNAofculturedhumanperiodontalligamentfibroblastswasinhibiteds ignificantlywhen50g/mLofECVWas added(P<0.01);ComparedwithECVgroup,thesynthesisofDNAofculturedhumanperiodontalligamentfibroblasts WasincreasedsignificantlywhenchinesenutgallextractWasadded(P<0.01)anditsbiologicaleffectseemedconcentra? tion—dependentmanner.CONCLUSION:Chinesenutgallextractofappropriateconcentrationmayblockeffectivelybio- logicalabilityofECV.ThusspeculatedthatChinesenutgallextractmayblockdevelopmentofperiodontaldieases. [Keywords]chinesenutgall;porphyromonasgingivalis;extraccellularvesicles;periodontalligamentfibroblasts 『ChineseJournalofConservativeDentistry,2007,17(12):695] 牙龈卟啉菌(porphyromonasgingivaline,Pg)是 目前公认的牙周炎主要病原菌之一,其胞外膜泡 (extsacellulasvesicles,ECV)是细菌外膜向外膨出 收稿日期:2o07—09—05 作者简介:张良(1973一),男,汉族,山西河曲人.硕士,主治医师 并逐渐形成独立成分后游离入周围微环境的一种 外膜芽生体…,有完整外膜,在毒理学和免疫学上 与产生它的菌体相似,然而它体积小,可到达深层 组织造成”远层破坏”?2J,有报道其对L929成纤维 细胞具有明显的毒性作用J.本研究采用体外培 养的人牙周膜成纤维细胞,用H—TdR掺入方法, ? 696?牙体牙髓牙周病学杂志(ChinJConservDent)2007,17(12) 检测ECV对人牙周膜成纤维细胞DNA合成的影 响,以及中药五倍子提取物对ECV这一生物活性 的阻断作用,为五倍子提取物用于预防牙周病提供 实验室依据. 1材料和方法 1.1细菌和培养基 egATCC33277(华西医科大学口腔微生物教 研室提供),改良GAM血液琼脂培养基(北京新明 生物技术研究所). 1.2试剂和仪器设备 DMEM细胞培养液,胎牛血清(FCS,浙江金华 清湖犊牛利用研究所),2.5mg/L胰蛋白酶(上海 生化制剂厂),H—TdR(上海核物理研究所),厌 氧罐,37~C恒温箱,YJ一874超净工作台(苏州净化 设备厂),低温超速离心机,低温冻干机,CO孵箱 (Hereaus,Germany),倒置相差显微镜(Olympus, 日本),ZT一?型多孔细胞样品收集器,Beckman KS一6500液闪计数仪(美国). 1.3五倍子水提取物的制备 取一定量五倍子原药材(产于陕南,1998年秋 季采摘),敲开后除去虫垢及杂质,冲洗清洁,干 燥,粉碎后过28目筛,称取50g,加去离子水100 mL,室温下浸泡24h,过滤离心,取上清液,共两 次.上清液进行浓缩并冷冻干燥,所得干粉视为五 倍子水提取物纯品应用. 1.4细菌培养 将菌种接种于改良GAM血液琼脂培养基,置 厌氧罐(800mL/LN2,100mL/LH2,100mL/L CO)中37~C复苏培养48h.菌株活化鉴定后,分 别接种于CDC厌养血琼脂平皿上,置厌氧罐中, 37?下培养72h,用棉签将细菌移人生理盐水,洗 涤2次(3000r/min,离心10min),弃去上清液,细 菌沉淀备用. 1.5ECV提取 采用超速离心法对3d的细菌培养物离心 (1000g,20min,4~C)分出沉淀物(细菌)和上清液 (含ECV);上清在Minitan超滤系统中浓缩50倍 (截留分子量为5000);浓缩后的上清离心(10000 g,20min,4~C),去除残留细菌;再离心(75000g, 30min,4~C),弃上清收集沉淀,在沉淀中加入双 蒸水,混匀后再离心(75000g,30min,4~C)2次, 收集沉淀,冻干称重,并分装保存(一20~C). 1.6细胞培养J 取因正畸新鲜拔除的无龋,无牙周病的前磨 牙,无菌条件下刮取牙根中1/3的牙周组织进行培 养,培养至长出牙周膜成纤维细胞,用胰酶消化法 进行传代.取第5,7代细胞用于实验. 1.7实验方法 取生长良好的第6代细胞,2.5mg/L胰酶消 化,吹打后做细胞计数,调整细胞数为2×10/mL, 接种于96孔培养板,每孔100IxL,培养24h后, 弃孔内液体及未贴壁的细胞,随机分为空白对照 组和膜泡(50g/mL)组,五倍子(10,5,2.5 tLg/mL)+膜泡(50g/mL)组,每孔液量100L, 每个药物浓度4个复孔.继续培养36h后,每孔 加入0.5IxCi的H—TdR,再培养12h后吸去孔 内液体,2.5mg/L胰酶消化细胞,用zT一?型多 孔细胞样品收集器收集细胞于999型纤维膜上,红 外线烤干加闪烁液,于BeckmanLS一6500液闪计 数仪上计数,测定每孔cpm值. 数据采用SPSS11.0统计软件包进行统计学 处理 2结果 2.1eg的形态 Pg进行复苏,纯培养后,经菌落形态,菌体染 色及生化反应鉴定J,结果均符合VPI厌氧菌手 册鉴定特性71. 2.2五倍子水提取物对ECV抑制人牙周膜成纤 维细胞活性的影响 细胞培养物中加入500~g/mLECV时,人牙周 膜成纤维细胞DNA的合成受到明显抑制,与空白 对照组相比P<0.01.当同时加入各浓度五倍子 水提取物时其DNA合成量明显增加,与ECV组相 比均P<0.05,且随五倍子水提取物浓度升高, DNA的合成量也随之增高,呈一定浓度依赖性 ( 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1). 表1五倍子水提取物对ECV抑制人牙周膜 成纤维细胞活性的影响(cpm) 药物分组 空白对照组 膜泡组 膜泡+2.5g/mL五倍子水提取物 膜泡+5g/mL五倍子水提取物 膜泡+1Og/mL五倍子水提取物 4207.20?481.42 967.50?125.85 2388.27?554.76 29l7.28?897.16 3159.03?699.42 {与空白对照组比较P<0.0l,{{与{比较P<0.05 牙体牙髓牙周病学杂志(ChinjConservDent)2007,17(12) 3讨论 %是G一,专性厌氧的产黑色素杆菌,是目前 公认的牙周炎主要病原菌之一.其胞外膜泡是细 菌外膜向外膨出并逐渐形成独立成分后,游离人周 围微环境的一种外膜芽生体…,它有完整外膜,在 毒理学和免疫学上与产生它的菌体相似,而且体积 小,能透过细菌本身不能透过的解剖屏障,到达深 层组织造成”远层破坏”,在其表面,许多生物活 性成分高度浓缩,比菌体本身更具组织破坏性.在 牙周病中尤其与牙周膜附着丧失,结合上皮回复到 原附着点的可逆性小,牙周袋非手术治愈率低等有 非常密切的关系. 近年来在牙周病防治方面,除采用常规的牙周 基础治疗外,全身或局部运用抗菌药物取得了较好 的疗效.但是随着抗生素的广泛应用,造成了耐药 性菌株的大量产生,导致用药后疗效不佳.五倍子 中主要含五倍子鞣酸(占60%,70%).现代药理 研究表明:五倍子具有抗菌,解毒,收敛等作用J. 朱秀丽报道3.75%五倍子水提取液可有效抑制 牙周可疑致病菌牙龈卟啉单胞菌,中间普氏菌,伴 放线放线杆菌,具核梭杆菌. 本研究显示:ECV在5Og/mL时对牙周膜成 纤维细胞H—TdR掺人有明显的抑制作用,实验 中未观察到细胞明显死亡现象,说明ECV对牙周 膜成纤维细胞H—TdR的掺人抑制不是由于细胞 死亡所致,而是由于细胞本身DNA合成下降,细胞 分裂被抑制所致;而将各浓度五倍子提取物分别与 ECV同时加入细胞培养物中,可见各浓度五倍子 提取物均能明显阻断ECV这一抑制作用,呈一定 浓度依赖性. 本研究提示:?临床上某些顽固性感染性牙周 病灶中不能分离出细菌可能与细菌处于分解代谢 期,其产生的ECV等有形成分,毒性产物以及酶 等,仍对宿主组织有破坏作用有关l.?适宜浓 度的五倍子提取物可有效地阻断ECV的这种生物 活性作用,从而可推测其对牙周病的发生,发展能 起到一定的阻断作用. 参考文献: [1]MayrandD,GrenierD.Biologicalactivitiesofoutermembrane vesicles[J].CanJMicrobiol,1989,35(6):607—613 [2]ShahHN,GharbiaSE,Progulske—FoxA,ela1.Evidencefor independentmolecularidentityandfunctionalinteractionofthe haemagglutininandcysteineproteinase(gingivain)ofPorphy— romonasgingivalis[J].JMedMicrobiol,1992,36(4):239—244 [3]倪龙兴,史俊南,陈晓玲.成人唾液对牙龈卟啉菌及其提取 物毒理学作用的影响[J].中华微生物学和免疫学杂志, 1997,17(1):21 [4]SmalleyJW,BirssAJ.Trypsin—likeenzymeactivityoftheex— traeellularmembranevesiclesofBacteroidesgingivalisW50 [J].JGenMicrobiol,1987,133(Ptl0):2883—2894 [5]司徒镇强,吴军正.细胞培养[M].西安:世界图书出版公 司,1996.68 [6]李德懿.牙周病微生物学新探[J].国外医学口腔分册, 1986,13(3):147—154 [7]HoldemanLV.AnaerobeLaboratorymanua1.AnaerobeLabora— tory,VirginiaPolytechnicInstituteandStateUniversity[M]. 4thed.USA:PrintedbySou~ernPrintingCoBlacksburg.Vir— ginia.1977 [8]江苏新医学院.中药大辞典(上)[M].上海人民出版社, 1997.39l [9]朱秀丽,陈强,唐荣银,等.五倍子对5种常见牙周细菌抑 制作用的体外研究[J].牙牙髓牙周病学杂志,2002,12 (5):255—257 [10]ShahHN,GharbiaSE,OTooleCM.Assessmentoftherelative cytotoxicityofPorphyromonasgingivaliscells,products,and componentsonhumanepithelialcelllines[J].JPeriodontol, 51 1992,63(1):44— 下颌前牙外伤性半脱位复位1例 李含薇 (职工医科大学,吉林吉林市132011) 病人男,2l岁,学生,2007—05从宿舍上铺跌落,撞击 到墙上,10min内就诊.检查:右下颌中切牙水平性半脱 位,牙长轴与牙弓垂直,右下颌侧切牙与左下颌中切牙有轻 度松动,上唇轻度水肿,内侧黏膜擦伤.X线片示:下颌前 牙均无根折,无牙槽骨骨折和吸收,未见异物和病变. 复位经过:局部用30mL/L过氧化氢液清洗牙周,一 次性将牙齿复位到正常位置,有少量血液从牙槽窝内被挤 出.酸蚀右下颌侧切牙和尖牙,左下颌中,侧切牙唇面,冲 洗干燥,黏结正畸托槽.用0.5mm不锈钢片段唇弓和0.2 mm结扎丝固定下前牙.嘱勿用前牙咬物,进软食2周. 复查:术后l周,右下颌前牙无疼痛,叩诊稍感不适.6 周后复查,拆除固定物,牙无松动,无变色,外观满意.X线 片示无异常. (收稿日期:2007—08—09)