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克隆载体与表达载体.doc

克隆载体与表达载体

男生的用心也不输给女人
2017-11-11 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《克隆载体与表达载体doc》,可适用于娱乐时尚领域

克隆载体与表达载体一部分:概念解析二部分:问题解答克隆载体:大多是高拷贝的载体一般是原核细菌将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接再导入原核细菌内质粒会在原核细菌内大量复制形成大量的基因克隆被克隆的基因不一定会表达但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。克隆载体(Cloningvector):携带插入外源片段的质粒或噬菌体从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。)其中为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。是否含有表达系统元件即启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。表达载体:有的是高拷贝的有的是低拷贝的各有各的用处是一些用于工程生产的细菌被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达生产出我们需要的产物导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率一般因为具有强的启动子。表达载体(Expressionvectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中有一个杂合tac强启动子和终止子在启动子下游有RBS位点(如果利用这个位点要求与ATG之间间隔bp)其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。,RBS位点:年Shine和Dalgarno首先发现原核生物在mRNA上有核糖体的结合位点它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游,bp处的由bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸刚好与SrRNA末端的富含嘧啶的序列互补是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字命名为ShineDalgarno序列简称SD序列。由于它正好与S小亚基中的srRNA’端一部分序列互补因此SD序列也叫做核糖体结合序列。真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列其在翻译的起始中有重要作用。加Kozarksequence(GCCACC),Kozaksequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境避免ribosome出现leakyscan,克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒所以常带有较强的自我复制元件如复制起始位点等往往在菌体内存在多拷贝所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成为的是控制目标蛋白的表达如各种启动子(T)调节子(LacZ)等而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的防止渗漏表达。克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了不管读码框什么的但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面而且要表达蛋白所以就要求你的读码框不能乱了否则就不能得到你想到的表达产物。载体即要把一个有用的基因(目的基因研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞)需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞这种运载工具就叫做载体(vector)。载体的分类按功能分成:()克隆载体:都有一个松弛的复制子能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段(基因)的载体。()表达载体:具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs等)还具有转录翻译所必需的DNA顺序的载体。按进入受体细胞类型分:()原核载体()真核载体()穿梭载体(sbuttlevector)指在两种宿主生物体内复制的载体分子因而可以运载目的基因(穿梭往返两种生物之间)克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便,其重点在于质粒的复制问题:基因工程中有克隆载体和表达载体克隆载体可以在受体菌中大量复制表达载体用于表达目的蛋白那么实际应用中我们的最终目的是要得到目的蛋白克隆载体不能完成表达有何用呢,还是说利用克隆载体实现目的基因的大量复制后再将其转移到表达载体中实现表达,它是否有何缺陷不能整合克隆载体的功能,构建兼有克隆和表达双重功能的载体有何困难,回答:克隆的目的比较单一就是将你感兴趣的DNA片段重组进入载体然后于宿主细胞中大量繁殖主要用于各种文库的建立比如人类基因组计划,同时由于载体所能容纳的目的片段的长度是有限的而克隆载体没有表达所需的各种片段所以可以容纳更长的目的片段即可以克隆足够长的基因效率更高。重组DNA需要使用限制性内切酶因此待克隆的目的片段两端必需有其识别位点现在的TA克隆载体可以直接克隆PCR产物省去了两端加装识别位点的设计PCR效率就更高。表达载体的目的是多样化的为了实现实际工作中的需要不同的目的就要设计不同的载体用表达载体克隆基因不是不可以实际工作中要考虑更多因此更复杂。细菌摄取能量的能力是一定的如果用来合成大量蛋白质合成核酸就会少。细菌承受的工作负荷也是有限的给它的工作太多效率必然低下这和我们日常生活是一个道理。原因很简单不是不能是完全可以但是效率会低很多。所以我们一般的策略是将目的片段克隆于非常简单的克隆载体上按照需要再亚克隆于可以满足各种要求的表达载体上。回答的不是很系统如有问题可以继续来信讨论希望对你有所帮助。)您好,您博文里得“TA克隆载体可以直接克隆PCR产物省去了两端加装识别位点的设计PCR效率就更高。”是什么意思,博主回复:::TA克隆载体是PUC载体的线性化后两端加了T而Taq酶有在PCR产物后随机加A的特性所以PCR产物直接可以接入T载体。而经典的克隆PCR产物需要限制性内切酶切割后接入载体所以在设计PCR引物时两端要加酶的识别位点而加装的序列与模板不配对因此PCR效率会低很多。)老师您好,您的意思是说克隆载体只是为了得到大量的目的基因而现在多用PCR就可以达到这个目的。那这个目的基因的主要用途是什么,只用来测序吗,表达载体应该兼有克隆与表达的功能的吧,博主回复:::嗯基本是这个意思。就测序不克隆也可以进行克隆到载体的CMS中就在基因两端有了可供你选择的很多限制性酶切位点方便亚克隆到各种表达载体上。当然表达载体可以克隆但是效率低于克隆载体。一是因为表达载体不能直接克隆PCR产物必须加装限制性酶切识别序列上面已经讲过。二是表达载体的选择相对克隆载体是更加严谨型的质粒就是每个细菌里的拷贝数较低能量守恒细菌摄取能量的能力是一定的用来合成蛋白质核酸的合成必然受一定得限制。)老师您好我要构建一个基因的载体我可以将目的基因,kb左右,和表达载体分别作酶切后连接吗,这几天将目的基因做了一个T载体连接可是不知道下一步怎么利用,设计引物的时候用了sac和hind做pcr的时候可以用pfu酶吗,pfu酶是必须的吗,我选择的表达载体上sac和hind的酶切位点只是相差两个碱基做双酶切的时候能切开吗,回复:如果你的目的基因已经在T载体上当然可以分别酶切后连接但是要注意方向。如果是T载体连接PCR的引物可以不设计酶切位点。T载体可以直接连接PCR产物源于其末端错加的A所以不能使用高保真的PFU。但是你的扩增片段较长如果用一般的TAQ酶合成中可能会出错用PFU准确度高需要设计酶切位点。如果PCR产物设计了酶切位点就可以直接克隆进需要的载体不必借助T载体。文献上有报道按:的比例混合使用PFU和TAQ效果更好。应该能切开因为设计引物时保护碱基也就到个但是最好稍微距离远一点。

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