实验三蔗糖酶的葡聚糖凝胶层析法脱盐
实验三 蔗糖酶的葡聚糖凝胶层析法脱盐
一、目的要求 了解蔗糖酶在葡聚糖凝胶柱上的脱盐原理;学习其基本的操作技术。 二、实验原理
分子筛指的是一些多孔介质。当含有大小不同的分子的混合物流经这一介质时，小分子能进入介质的孔隙，而大分子则被阻在介质之外，从而达到分离的目的，这种作用被称为分子筛效应。具有这种效应的物质很多，其中效果较好的有葡聚糖凝胶(Sephadex)，琼脂糖凝胶(Sepharose)，聚丙烯酰胺凝胶等。
经盐析分级沉淀得到的蔗糖酶溶液含有大量的硫酸铵，铵盐的存在对蔗糖酶的进一步分离纯化产生影响，因此必须除去。葡聚糖凝胶柱脱盐的原理是，当蔗糖酶液流经凝胶柱时，酶被排阻在凝胶外面先流出来，而小分子量的盐类则扩散到凝胶网孔内部后，经较长路径再流出，由于大小分子向下运动的速度不同，最终将盐和大分子的酶分离。这种方法脱盐的速度不仅比透析法脱盐快，而且大分子物质不变性。
三、试剂和仪器
(一)试剂
1、葡聚糖凝胶G-50。
2、洗脱液:适宜pH值的50mmol/L磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液。
3、奈氏试剂:5g kI溶于5mL水中，加入饱和HgCl，搅拌至朱红色沉淀不再溶解时，加2
入40mL 50%NaOH，稀释至100mL，静置过夜，取上清液备用。
(二) 仪器
1、由1.6×30cm凝胶柱、恒流泵、分部收集器组成的脱盐装置。
2、紫外分光光度计。
四、操作方法
1、实验用凝胶的预处理根据盐析柱的体积和干凝胶的膨胀度进行，可按下式计算所需干凝胶的用量:
2，，rh,干凝胶用量(g),，110~120% ,,膨胀度(床体积/g干胶)，，
称取一定量的葡聚糖凝胶，按
说明书
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中要求用纯水充分浸发凝胶干粉，然后用倾泻法除去表面悬浮的小颗粒，重复3–4次。
1、装柱
将一定体积的洗脱液加入已溶胀的凝胶中，混匀。尽量沿柱壁一次徐徐灌入柱中，以免出现不均匀的凝胶带。凝胶浆过稀易出现不均匀的裂纹;过于粘稠，会吸留气泡。
新装的柱用适当的缓冲液平衡后，将带色的蓝色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。均匀下降说明柱层床无裂纹或气泡，否则必须重装。 (三) 加样和洗脱
打开柱的上盖，让缓冲液流出，直至液面与凝胶床面相平。将一定量的酶液(加样量自定)小心加到凝胶床的表面。待样品恰好通过层床后，用少量洗脱液冲洗凝胶表面，待少量洗脱液流进层床后，补加缓冲液至合适的高度，旋紧柱上盖，开启恒流泵，以一定量的洗脱缓冲液按0.5~1.0mL/min速度洗脱，每3~5mL收集一管。
(四) 收集液的检测
在280nm波长下，测定各收集管中溶液的蛋白质含量及脱盐情况。 五、结果及讨论
1、以A为纵坐标，收集管数为横坐标，绘制酶脱盐洗脱曲线。收集经脱盐的酶液(即280nm
有酶活力的洗脱液)。
2、 蔗糖酶凝胶脱盐效果比较
洗脱速度洗脱液体积酶液脱盐效果(用奈氏试剂实验序号 蔗糖酶上样量(mg)
(mL/min) (mL) 定性)检验
1
2 六、问题讨论
1、凝胶溶胀过程中，应避免剧烈搅拌，以防止破坏胶联结构。凝胶只能用水溶胀，有机溶剂较多的水溶液会使其收缩，改变孔隙，或降低其分离能力。
2、 加样量应在不影响分离的前提下增大，但为了获得较好的脱盐效果，可减少加量，
此时分离效果逐渐加强。一般加样量不超过凝胶床体积的10%。
3、 凝胶柱的流速取决于柱长，凝胶颗粒的大小等多种因素。一般说来，洗脱流速慢， 分离效果好，但是太慢也会因扩散加剧而降低分离效果。
4、 凝胶的洗涤及保存
先用2-3倍层床体积的蒸馏水通过凝胶柱，再将凝胶倒入杯中，用蒸馏水充分漂洗，用布氏漏斗抽洗，以除去盐分或其它杂质。
然后向凝胶浆中加入0.02%的硫抑汞或叠氮化钠，可保存几个月。下次使用前重新洗柱除去防腐剂。
七、思考题
1、比较透析法和凝胶法脱盐的优缺点。
利用凝胶法脱盐，要达到较好的分离效果，与什么因素有关,
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