成熟视网膜神经节细胞三维培养_cropped

成熟视网膜神经节细胞三维培养_cropped 成熟视网膜神经节细胞三维培养 1 1 1 1 2 张小猛,徐春玲, 庞利民,张晓光, 高野雅彦()1. 吉林大学第二医院眼科, 吉林 长春130041; 2. 日本北里大学眼科, 日本22828555 目的: 建立成熟视网膜神经节细胞的三维培养模型。方法: 将边长500 的方形网膜片神经纤维层向[ 摘 要 ] Λm 下浸入12孔培养板的胶原溶液层中, 胶原溶液凝固后, 培养孔内加入无血清M EM 培养液。相差显微镜观察生长情 视网膜神经节细胞突起在凝胶中呈 况。应用羊抗鼠 22111单克隆抗体鉴定培养的神经节细胞突起。结果: F ITC T h y 螺旋迂曲生长, 可存活2周以上。免疫组化荧光显色神经节细胞突起呈阳性反应。结论: 应用凝胶做支持物对成熟视 网膜神经节细胞进行三维原代培养, 是一种成功的、 可广泛应用的培养方法。 视网膜神经节细胞; 组织培养ƒ方法; 三维培养 [ 关键词 ] 2332; 813111 [ 中图分类号 ] [ 文献标识码 ] A R Q Establ ishm en t of n ew cul ture system f or ret ina l gan gl ion cel l s 1 1 1 1 22, 2, 2, 2, ZHA N G X iaom engXU C h unlingPA N G L im inZHA N G X iao guangM A SA H IKO T ak ano (1. , , , 130041, ;D ep a r tm en t of O p h th a lm o logySecond H o sp ita lJ ilin U n ive r sityC h angch un C h ina 2. ), , , 22828555D ep a r tm en t of O p h th a lm o logyK ita sa to U n ive r sitySchoo l of M ed icineJ ap an (): . A bstra c tO b je c tive To e stab lish a new cu ltu re sy stem fo r re t ina l gang lion ce lls R GC sM e thods Fou r m a le W ista r 10 , , . ra t s aged w eek sre t ina w a s iso la ted f rom th e cho ro idth e p igm en t ep ith e lium and adh e ren t v it reou sT h e re t ina l ()2×0. 5 . 16 0. 5 exp lan t s f rom m idp e r ip h e ra l re t ina s w e re d issected in to p iece s app rox im a te ly mm mm squa reFou r .p iece s of re t ina l t issue s w e re em bedded in th e typ e I co llagen ge l w ith th e ne rve f ibe r laye r dow nw a rd on p la st ic d ish - 1 222210 r. E ach d ish w a s p recoa ted w ith m gL po lyL ly sineT h e exp lan t s w e re cu ltu red in se rum f ree M EM and 37? ƒ95% . 5% m a in ta ined a t in an incuba to r unde r a CO 2 a ir a tm o sp h e reT h e num be r of ou tg row ing neu ra l . , p ro tube rance s w a s coun ted unde r p h a se con t ra st op t ics u sing inve r ted m icro scop eImm unoh istoch em ica l m a rk e r s 111 m onoclona l an t ibod ie s aga in st neu rof ilam en t and T h y w e re u sed to iden t ify th e na tu re of th e ou tg row ing . 2, p roce sse sRe s ults U sing th e th reed im en siona l cu ltu reth e re t ina l exp lan t s w e re stab ly em bedded ju st be low th e , 2 . su rface of th e ge land th ey cou ld be cu ltu red fo r w eek s o r m o reT h e ou tg row ing neu ra l p ro tube rance s cou ld 22.e longa te m o re f ree ly in to ge l in th e th reed im en siona l cu ltu re th an in th e tw o d im en siona l one C onc lus ion R GC s can 2.be cu ltu red sucece ssfu lly in th e th reed im en siona l cu ltu re Key words: re t ina l gang lion ce lls; t issue cu ltu rem e thod s; ƒ2th reed im en siona l cu ltu re 许多疾病可造成视网膜神经节细胞的损伤和死 R GC s 损伤的机制, 促使 R GC s 再生是挽救 病导致 亡, 导致永久性失明, 如青光眼、 视网膜变性、 糖 视功能的关键。本文作者应用三维视网膜神经节细 尿病视网膜病变、脱髓鞘性疾病、肿瘤、视神经病、 胞培养方法观察成熟视网膜神经节细胞的再生及其 1 ( 缺 血和外伤等。建立视网膜神经节细胞 生长周期, 为今后体外研究视网膜神经节细胞的生 ret ina l ) 理学及药理学奠定基础。 , 体外培养体系, 探索各种疾gang lion cellsR GC s 2003209212 [ 收稿日期 ] ()长春市科技发展 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目 012112536 [ 基金项目 ] () 张小猛 1973- , 男, 吉林省长春市人, 在读医学博士, 主要从事眼底病研究。 [ 作者简介 ] - 1 - 1 , 317 的 , 316 的 rrN a2 SeO 3 gL N aH CO 3 gL 1 材料与方法 H ep es。用相差显微镜观察生长情况。111 大鼠培养网膜的获得 10周龄的系大 W ista r 113 免疫组织化学染色 取培养3、 6、 9 d 后的网 鼠4只, 乙醚麻醉后摘出完整眼球, 在显微镜下依次 , 膜片行抗大鼠 2111单克隆抗体免疫细胞学检 T h y 除去角膜、巩膜和脉络膜, 再除去晶体和玻璃体, 分 查, 同时设立阴性对照组。方法: 在培养孔中加入2% 离网膜。上述操作要求动作轻巧快速准确, 分离网膜 () 多聚甲醛 , 714固定30 。冲洗3次PB SpH m inPB S 时, 要把玻璃体完全清除干净。切除周边网膜, 取距 () 后, 实验组加入 11 单克隆抗体 1? 100, 阴性 1T h y 视盘110, 115 处网膜, 切成边长500 的方形 mm Λm 对照组加入含1% 小牛血清白蛋白的 PB S, 4?振荡 网膜片16片。上述操作要求在培养液内完成, 无菌操 ( 过夜。3 次冲洗后加 2标记的羊抗鼠抗体 1 ?F ITC ) 作, 避免细菌污染。30, 4?振荡过夜。荧光显微镜观察结果。 原112 网膜片的培养 在0?环境下, 将配置好的胶 - 1 2 结 果 溶液滴于用10 多聚赖氨酸包被的培养孔 中rm gL 央, 形成直径15 的胶原溶液层。胶原溶液由 以mm O lym p u s 倒置显微镜下观察, 可见视网膜片在 下成分组成: ?用 溶液稀释的013% ICH 3COO H () 培养24 内出现短而小的再生神经突起 见图1,h B () 310; ?10倍浓度的 从大鼠尾巴提取型胶原 pH 48, 72 后再生突起数目逐渐增多, 长度逐渐伸 h 培 养 液; ? 每 100 含 2120 和 () M EM mL N aH CO 3 g 长, 形成典型的神经突起形态 见图1, 前端有其 C - 1 ( )177 的0105 r。?? ?? ?= 8?生 长 的 特 征 性 的 伞 状 生 长 圆 锥 结 构 见 图 1。4H ep es g m o lL N aO HD () 1 ? 1。将网膜片的神经纤维层向下浸入胶原溶液层第7天左右 见图1, 再生突起数目达到顶峰, 以 E 中, , 第15天仍能观察到再生的神经突起。神 后逐渐回落每孔4片。37?水浴5 m in。液态胶原凝固成盘状 经突起在凝胶中盘旋迂曲生长, 逐渐伸长, 最长可 (), 网膜片固定在其中 凝胶图1。培养孔中加入培 A 超 过 3 。少 数 突 起 之 间 相 互 连 接。用 抗 大 鼠 mm 养液, 置于5% CO 2、37?恒温箱中。隔日换培养液。 22111 单克隆抗体对培养物进行免疫细胞 F ITC T h y- 1 培养液成分如下: 不含血清的17 的 , 2rM EM gL 化学染色, 生长的突起呈阳性反应, 证明其来源于 大- 1 - 1 葡萄糖, 5 的胰岛素, 1611 的肉毒rrm gL m gL 鼠神经节细胞。 - 1 - 1 , 碱792 的小牛血清白蛋白, 512 的 rrm gL ΛgL F ig. 1 R e su lt s of ob se rva t ion unde r inve r ted m icro scop e ( ) : 2× 40; : 224 A R e t ina l t issue w a s f ixed in to th reed im en siona l co llagen ge l B P h a secon t ra st m icrog rap h of cu ltu red re t ina a t (() ) ×200; : 23 ×200; : hou r s in v itro CP h a secon t ra st m icrog rap h of cu ltu red re t ina a t day s in v itro D A regene ra t ing neu r ite ()(2×200 ) : 7 ×400; EP h a secon t ra st m icrog rap h of cu ltu red re t ina a t day s in v itro w ith a sp read g row th cone 2采用完全消化法于体外成功地培 自 等 R aff 3 讨 论 养了生后2, 3 d 大鼠 R GC s 以来, 许多学者曾先后 3, 4 传统观点认为哺乳动物的中枢神经系统的轴突 对其进行过研究。目前采用的体外培养方法有纯 , 视 在受损伤后是不能再生的。但近年来的研究表明化培养和体外混合培养。纯化培养的细胞数少, 胞体 网膜的神经节细胞在轴突受损伤后, 和末梢神经一 , 突起较短, 较小大多只能存活48 h。有人在培养皿 样也具有一定的再生能力。特别是应用 体外 R GC s ( 中加入生长因子 表皮生长因子、 成纤维生长因培养技术, 可以明确的观察到 的轴突再生。R GC s ) 子 或 神 经 营 养 因 子 如 脑 源 性 神 经 营 养 因 子 R GC s 的生理功能。混合培养的 R GC s 存活率高, 但 R GC s 模型研究这些疾病, 因此时 R GC s 尚处于 物 因受其它视网膜细胞的影响, 在不同培养液中的表 幼稚阶段, 不能完全代表成熟或老化时的 R GC s 的 现较复杂, 结果难以解释。 生理及病理状态。应用本方法培养成熟的 R GC s, 得 本实验方法相对简化, 神经突起生长成活率较 出的结论更具有说服力。 高, 存活时间较长。网膜片在凝胶中固定, 以凝胶为 [ 参考文献 ] 支持物, 神经突起呈三维立体生长, 不易移动, 易 于 1 Sha tz CJ , O lea ry DD. R ep a ir and rep lacem en t to resto re sigh t 观察计数, 且不需要昂贵的神经生长因子, 仅用 无血 1993, 111: 4722477. [J . A rch O p h tha lm o l, 清培养液可存活2周以上, 染色方法简便。本方 , . 22, ,2 H akom o r i S Iet a lCelltyp esp ecif ic R aff M C F ield s KL 比单 法把 R GC s 和固有的神经支持细胞一起培养, m a rker s fo r d ist ingu ish ing and study ing neu ron s and the m a jo r 体细胞的单层培养及多种细胞的混合培养更接近于 [. , 1979, 174: 2832cla sses of g lia l cells in cu ltu re J B ra in R es 体内环境, 更适合观察神经突起生长, 培养出的神 308. , , , . 3 L eifer D L ip ton SA B a rn stab le CJ et a lM onoclona l an t ibody 经突起更接近于生理状态。 21 to T hyenhances regenera t ion of p rocesses by ra t ret ina l 21抗原是存在于啮齿类动物许多细胞表面 T h y[. , 1984, 224: 3032306.gang lion cells in cu ltu re J Science 的一种糖蛋白, 2111抗原仅表达在大鼠神经节T h y , . 4 M on tague PR F r ied lander M JE xp ression of an in t r in sic g row th 细胞上, 被广泛应用于鉴定大鼠神经节细胞。本实验[. st ra tegy by m amm a lian ret ina l neu ron s J P roc N a t l A cad Sci 证明 培养生长物 2111单克隆抗体染色呈阳性, T h y86: 722327227. U SA , 1989, 刘 文 文, 徐 萍, 黄 倩 1 胚 胎 与 成 人 视 网 膜 神 经 细 胞 5 培养生长物为大鼠神经节细胞突起。 培养 [] 1 中华眼底病杂志, 2002, 18: 27922821 J 以往的培养方法只能采用刚出生不久的动物, 如果动物年龄稍大, 培养效果就大受影响, 或不能 应用骨折多功能复位固定器治疗胫骨多段骨折 解放军第208医院骨一科 陈伟民 解放军96451部队医院 李旭升 长 春 市 合 心 医 院 张代玉 1996- 2001年本院应用自制骨折多功能复位外固定器治疗胫骨多段骨折32例, 均取得良好效果, 现报道如下。 1 临床资料 本组32例, 男27例, 女5例, 年龄18, 65岁, 平均年龄为39岁。受伤原因: 车祸29例, 砸伤2例, 机器绞伤1例, 其中闭合 性骨折25例, 开放性骨折7例, 均伴有腓骨骨折, 全部骨折均采用自制的骨折多功能复位外固定器固定。 2 方 法 211 外固定器的机械结构及功用 此器械为双架式结构, 由3部分组成: ?孔槽式固定轴8个, 是一种圆柱形结构, 以下方 的圆台 () 为界分为上下两段。上段外有螺纹, 中间有一长孔槽, 供固定针插入固定 用其上的两个螺帽; 下段光滑无螺纹, 供 插入旋转臂的孔内, 通过其下端的螺孔, 用固定螺钉和垫圈固定在旋转臂上, 螺钉放松, 轴可在旋转臂上旋转, 以适应固定 的移动; ?旋转臂8个, 上有空间十字交叉的两孔, 一为固定轴的插孔, 一为调节杆的穿孔, 是孔槽式固定和调节杆的连接装置, 可在调节杆的套管上旋转, 又可沿管滑动, 以适应固定针的位置需要; ?调节杆2个, 由相同长度的左右两个套管和 调整螺杆组成, 连接旋转臂把整个复位固定器组成一体, 通过杆伸缩矫正畸形。 212 手术方法 硬膜外麻醉, 根据小腿皮肤损伤情况可采用胫骨前直切口或前外侧切口, 尽可能保留软组织、 骨膜与大骨 片的连接, 减少骨膜剥离, 一般不作胫骨后的剥离, 碎的大骨块先用螺丝钉互相固定。术中可根据情况, 如两段以上骨折于 骨折上段横穿1枚斯氏针, 再于骨折中段横穿2枚斯氏针, 下段横穿1枚斯氏针, 使4根针对穿内外侧皮肤, 骨折中段也可不穿 针, 将骨折复位后上外固定架, 固定后分别纵向加压, 拧紧各部分, 如骨折段数更多则用特制外固定架。 3 结 果 本组32例经随访1, 115年, 无一例骨折不愈合及骨髓炎形成, 骨折愈合时间为2, 6个月, 拆架时间为3, 11个月, 膝关节 及踝关节功能均恢复正常, 基本全部解剖复位, 其中3例因骨折粉碎严重及骨丢失取髂骨植骨, 伤口均无感染。 () 下转第241页