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细菌基因组DNA的制备.doc

细菌基因组DNA的制备

黄茂行
2017-12-05 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《细菌基因组DNA的制备doc》,可适用于综合领域

细菌基因组DNA的制备第四节细菌基因组DNA的制备一、材料细菌培养物。二、设备移液管,高速冷冻离心机,台式离心机水浴锅。三、试剂、CTABNaCl溶液:gNaCl溶解于mlHO,缓慢加入gCTAB,加水至ml。、其它试剂:氯仿:异戊醇(:)酚:氯仿:异戊醇(::)异丙醇乙醇TESDS蛋白酶K(mgml或粉剂)molLNaCl。四、操作步骤:ml细菌过夜培养液,rpm离心分钟,去上清液。加mlTE悬浮沉淀,并加mlSDS,μlmgml(或mg干粉)蛋白酶K,混匀,保温小时。加mlmolLNaCl,混匀。加mlCTABNaCl溶液,混匀,保温分钟。用等体积酚:氯仿:异戊醇(::)抽提,rpm离心分钟,将上清液移至干净离心管。用等体积氯仿:异戊醇(:)抽提,取上清液移至干净管中。加倍体积异丙醇,颠倒混合,室温下静止分钟沉淀DNA。用玻棒捞出DNA沉淀,乙醇漂洗后,吸干,溶解于mlTE,保存。如DNA沉淀无法捞出,可rpm离心,使DNA沉淀。如要除去其中的RNA,可以按本章第三节中操作步骤处理。第三节从动物组织提取基因组DNA一、材料哺乳动物新鲜组织。二、设备移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。三、试剂、分离缓冲液:mmolLTrisClpH,mmolLNaCl,mmolLEDTA。、其它试剂:SDS蛋白酶K(mgml或粉剂)乙醚酚:氯仿:异戊醇(::)无水乙醇及乙醇molLNaClmolLNaAcTE。四、操作步骤:切取组织g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。倒入液氮,磨成粉末,加ml分离缓冲液。加mlSDS,混匀,此时样品变得很粘稠。加ul或mg蛋白酶K,保温小时,直到组织完全解体。加mlmolLNaCl,混匀,rpm离心数秒钟。取上清液于新离心管用等体积酚:氯仿:异戊醇(::)抽提。待分层后,rpm离心分钟。取上层水相至干净离心管,加倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。移去上层乙醚,保留下层水相。加体积molLNaAc,及倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止分钟DNA沉淀形成白色絮状物。用玻棒钩出DNA沉淀,乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于mlTE中,保存。如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在rpm短暂离心,取上清如要除去其中的RNA,可加μlRNaseA(μgμl),保温分钟,用酚抽提后,按步骤重沉淀DNA。质粒DNA的碱裂解法提取与纯化细菌质粒是一类双链、闭环的DNA大小范围从kb至kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上随着染色体的复制而复制并通过细胞分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法其基本原理为:当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时蛋白质与DNA发生变性当加入中和液后质粒DNA分子能够迅速复性呈溶解状态离心时留在上清中蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状离心时可沉淀下来。纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA经过苯酚、氯仿抽提RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求故在分子生物学实验室中常用。一、试剂准备溶液:mM葡萄糖mMTrisHCl(pH)mMEDTA(pH)。MTrisHCl(pH)mlMEDTA(pH)ml葡萄糖g加ddHO至ml。在lbfin高压灭菌min贮存于。溶液:NNaOHSDS。NNaOHmlSDSml加ddHO至ml。使用前临时配置。溶液:醋酸钾(KAc)缓冲液pH。MKAcml冰醋酸ml加ddHO至ml。保存备用。TE:mMTrisHCl(pH)mMEDTA(pH)。MTrisHCl(pH)mlMEDTA(pH)ml加ddHO至ml。lbfin高压湿热灭菌min保存备用。苯酚氯仿异戊醇(::)乙醇(无水乙醇、乙醇)×TBE:Tris碱g硼酸gEDTANaHOg加ddHO至ml。lbfin高压湿热灭菌min保存备用。(溴化乙锭(EB):mgmlRNaseA(RNA酶A):不含DNA酶(DNasefree)RNaseA的mgmlTE配制沸水加热min分装后贮存于。×loadingbuffer(上样缓冲液):溴酚蓝二甲苯青FF(WV)蔗糖水溶液。琼脂糖凝胶:称取g琼脂糖于三角烧瓶中加ml×TBE微波炉加热至完全溶化冷却至左右加EB母液(mgml)至终浓度μgml(注意:EB为强诱变剂操作时带手套)轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中勿使有气泡静置冷却min以上轻轻拔出梳子放入电泳槽中(电泳缓冲液×TBE)即可上样。二、操作步骤挑取LB固体培养基上生长的单菌落接种于mlLB(含相应抗生素)液体培养基中、g振荡培养过夜(约hr)。取ml培养物入微量离心管中室温离心g×min弃上清将离心管倒置使液体尽可能流尽。将细菌沉淀重悬于μl预冷的溶液中剧烈振荡使菌体分散混匀。加μl新鲜配制的溶液颠倒数次混匀(不要剧烈振荡)并将离心管放置于冰上min使细胞膜裂解(溶液为裂解液故离心管中菌液逐渐变清)。加入μl预冷的溶液将管温和颠倒数次混匀见白色絮状沉淀可在冰上放置min。溶液为中和溶液此时质粒DNA复性染色体和蛋白质不可逆变性形成不可溶复合物同时K使SDS蛋白复合物沉淀。加入μl的苯酚氯仿异戊醇振荡混匀离心g×min。小心移出上清于一新微量离心管中加入倍体积预冷的无水乙醇混匀室温放置min离心g×min。ml预冷的乙醇洗涤沉淀次离心g×min弃上清将沉淀在室温下晾干。沉淀溶于μlTE(含RNaseAμgml)水浴min以降解RNA分子保存备用。三、质粒DNA的电泳检测观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近导致染料与DNA结合并呈现荧光其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收nm处的紫外辐射并传递给染料而被结合的染料本身则在nm和nm有光吸收。这两种情况下被吸收的能量可在可见光谱红橙区的nm处重新发射出来。因此当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。取制备的质粒DNAμl加适当loadingbuffer混匀上样,采用Vcm的电压使DNA分子从负极向正极移动至合适位置取出凝胶置紫外灯下检测摄片。四、注意事项本裂解法小量制备质粒DNA重复性好一般无麻烦。若所提取质粒DNA不能被限制性内切酶切割可通过酚氯仿再次抽提以清除杂质来解决问题

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