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第七节 离子交换色谱.doc

第七节 离子交换色谱

释放堕落的那些年华
2017-10-06 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《第七节 离子交换色谱doc》,可适用于活动策划领域

第七节离子交换色谱第七节离子交换色谱离子交换色谱(ionexchangechromatographyIEC)是发展最早的色谱技术之一。世纪年代人工合成离子交换树脂的出现对于离子交换技术的发展具有重要意义基于苯乙烯二乙烯苯的离子交换树脂至今仍是最广泛使用的一类离子交换树脂。但它并不十分适合对生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等的分离因为:树脂交联度太大而颗粒内网孔较小蛋白质分子无法进颗粒内部只能吸附在表面造成有效交换容量很小树脂表面电荷密度过大使蛋白质在其上吸附得过于牢固必须用较极端的条件才能洗脱而这样的条件往往易造成蛋白质变性树脂的骨架具疏水性一旦与蛋白质之间发生疏水相互作用也容易造成蛋白质变性失活。世纪年代中期Sober和Peterson合成了羧甲基(CM)纤维素和二乙氨乙基(DEAE)纤维素这是两种亲水性和大孔型离子交换剂。其亲水性减少了离子交换剂与蛋白质之间静电作用以外的作用力而大孔型结构使蛋白质能进人网孔内部从而大大提高了有效交换容量而纤维素上较少的离子基团有利于蛋白质的洗脱因此这两种离子交换剂得到了极为广泛的应用。此后多种色谱介质特别是颗粒型介质被开发和合成包括交联葡聚糖凝胶、交联琼脂糖、聚丙烯酞胺以及一些人工合成的亲水性聚合物等以这些介质为骨架结合上带电基团衍生而成的离子交换剂也层出不穷极大地推动了离子交换技术在生化分离中的发展和应用。一、离子交换色谱相关理论(一)基本原理离子交换色谱分离生物分子的基础是待分离物质在特定条件下与离子交换剂带相反电荷因而能够与之竞争结合而不同的分子在此条件下带电荷的种类、数量及电荷的分布不同表现出与离子交换剂在结合强度上的差异在离子交换色谱时按结合力由弱到强的顺序被洗脱下来而得以分离。离子交换色谱的原理和一般步骤如图所示。图离子交换色谱原理起始缓冲液中的离子梯度缓冲液中的离子极限缓冲液中的离子待分离的目标分子需除去的杂质上样阶段此时离子交换剂与平衡离子结合吸附阶段混合样品中的分子与离子交换剂结合开始解吸阶段杂质分子与离子交换剂之间结合较弱而先被洗脱目标分子仍处于吸附状态完全解吸阶段目标分子被洗脱再生阶段用起始缓冲液重新平衡色谱柱以备下次使用蛋白质、多肽、核酸、聚核苷酸、多糖和其他带电生物分子正是如此通过离子交换剂得到了分离纯化即带负电荷的溶质可被阴离子交换剂交换带正电荷的溶质可被阳离子交换剂交换。(二)基本理论离子交换作用离粒度比SOURCE系列更小仅为µm并且粒径分布非常均匀误差仅为µmMonoBeads的名称就由此而来。高硬度、单分散性的特点使该色谱介质能够在很高的流速下使用并且不会造成背景压力过高小而精细的粒度赋予该色谱介质极高的效率所有预装的MonoBeads色谱柱每米的理论塔板数都在左右由于没有非特异性的吸附作用该色谱介质对蛋白质总量和活性的回收率都很高。MonoBeads系列离子交换剂主要包括MonoQ和MonoS两种类型它们都已制成预装柱出售。高效离子交换剂的种类还有很多比如TosoHaas公司的DEAESW和CMSW它们采用的基质是二氧化硅外面覆盖带有功能基团的亲水层BioRad公司的DEAEPW和CWPW采用基质为合成高分子有机聚合物等。尽管适用于中高压色谱的高效离子交换剂种类众多但实验表明有着相同功能基团、孔结构和颗粒尺寸的交换剂的色谱行为是非常相似的。与常规离子交换色谱介质相比高效色谱介质的分辨率有很大的提高能够取得令人满意的纯化效果其缺点是色谱介质的成本更高处理样品的数量较小不适合于大规模的制备。事实上高效色谱介质一般不用于对粗提取物进行分离纯化因为其容量十分有限并且粗提取物中大量的杂质容易污染高效色谱介质口在对粗提取物进行了初步的纯化操作去除了大部分杂质后高效色谱介质由于其高分辨率在进一步纯化和最后的精制阶段是十分有用的。非孔型离子交换剂在离子交换剂的研制过程中人们为了获得高的有效交换容量趋向于开发大孔型的色谱介质然而在高效液相色谱中现在又开发出一些非孔型离子交换剂用这类色谱介质进行色谱分离时所有的结合都发生在颗粒的表面由于蛋白质在流动相和固定相间的扩散距离很小分离过程可以很快完成又由于该色谱介质的粒度非常小因此分辨率非常高。实际上这类色谱介质是在牺牲了容量的前提下可以在比网孔型介质分离速度快~倍的基础上获得比后者更高的分辨率。所以这类色谱介质适合于在纯化阶段的后期进行分析型或微量制备型的分离纯化。Pharmacia公司的MiniBeads系列离子交换剂就属于这类色谱介质其基质为非孔型亲水性聚合物颗粒直径很小仅为µmMiniBeads的名称也由此而来并且颗粒非常均匀具有单分散性的特点这使得色谱介质在高流速下仍能保持较低的背景压力。MiniBeads系列的交换剂有两种:MiniQ和MiniSPharmacia公司将其制成预装柱MiniQPC和MiniSPC后出售。其他离子交换剂TosoHaas公司的Toyopearl系列离子交换剂是以聚乙烯醇Toyopearl凝胶作为基质连接上不同功能基团后形成的目前商品化的仅有DEAEToyopearl和CMToyopearl两种。Toyopearl为多孔型三维网状结构含有丰富的羟基骨架表现为高度亲水性衍生而成的离子交换剂结构牢固稳定性较好pH和离子强度对体积影响不大。Parath等人制备了兼性离子交换剂在基质上连接如β丙氨酸、对氨基苯磺酸、精氨酸等偶极离子由于在兼性离子周围电场电压下降快于单位电荷所以蛋白质从这类色谱介质上解吸更为容易。蛋白质也以兼性离子形式存在其所带正负电荷都能与交换剂结合而缓冲液中的阴离了、阳离子也都能与蛋白质竞争结合位点。与通常的交换剂相比蛋白质在兼性离子交换剂上结合时将有着一定的定向形式这与蛋白质分子表面的电荷分布又是直接相关的。因此用通常的离子交换剂不能得到很好的分离效果时采用兼性离子交换剂有时能取得意外的良好效果。离子交换剂是离子交换技术的关键所在其本身的研制和开发仍在不断进行之中它们是推动生化分离技术不断进步的一个重要方面。三、离子交换色谱实验技术(一)离子交换色谱条件的确定离子交换色谱条件的选择主要包括离于交换剂的选择、色谱柱的尺寸、起始缓冲液的种类、pH和离子强度、洗脱缓冲液的pH和离子强度等。离子交换剂的选择离子交换剂的种类很多没有一种离子交换剂能够适合各种不同的分离要求必须根据分离的实际情况选择适合的离子交换剂这中间包含了选择适合的基质和功能基团。选择离子交换剂主要的依据包括分离的规模、分离的模式、目标蛋白质分子人小、等电点和化学稳定性等性质。对于分析型分离和实验室小规模制备型分离一般采用常规的柱色谱技术而对于大规模工业化分离有柱色谱、膨胀床吸附、分批分离等多种模式可供选择。在大规模分离中采用柱色谱一般在分离的中后期此时大多数杂质已经被除去选用柱色谱可获得良好的分离效果因此色谱介质的流速特性和交换容量应当作为重要参数。为了能满足快速分离的要求所选择的色谱介质应当能够在承受高的流速的前提下有着较低的背景压力。由于样品的数量大高的有效交换容量是必需的因此色谱介质应当具有大孔型的结构和较高的取代程度。此外该色谱介质还必须能够满足原位清洗(CIP)的要求对于大规模的色谱柱每次分离后将色谱介质倒出清洗和再生然后重新装柱将是难以想象的。在这类分离中基于交联琼脂糖的离子交换剂是比较合适的。其次是这步离子交换在整个目标分子的纯化所处的阶段及所要求的分辨率。在预处理和初分级阶段离子交换的目的是提取和浓缩目标分子而在细分级和最后精制阶段离子交换的目的应当是除去样品中混有的杂质获得单一组分。一般来说考察色谱操作优劣的指标包括分辨率、速度、容量和回收率但在优化其中的某个指标时其他指标往往会发生不利的变化尽善尽美是达不到的人们所追求的目标就是根据分离所处的阶段对其中一到两个指标进行优化其余的指标是次要的只作一定的参考。接着应考虑目的物的分子大小和离子交换剂的有效交换容量。离子交换剂的取代程度决定了其总交换容量而对于某种分子的有效交换容量还取决于这种分子是否能够达到功能基团的表面并发生结合在此过程中基质网孔的孔径起着决定性的作用。如果目标分子不能进入离子交换剂的网孔结构而只是与基质颗粒表面的功能基团结合将会大大降低有效交换容量。因此在分离分子量较大的目标分子时需要采用孔径尺寸较大的基质在各种离子交换剂中基于纤维素和琼脂糖的交换剂所形成的孔径是最大的一般目的物分子量通常都低于它们的排阻极限。在分离分子量较小的目的物时网孔较小的色谱介质具有一定的优势基于交联葡聚糖的交换剂属于此类。以上考虑主要针对离子交换剂基质的选择而在确定所选用的基质后选择何种功能基团是另一个关键所在这主要取决于目标分子的电性质和pH稳定性。以蛋白质为例在最理想的状态下待分离样品中目标蛋白和主要杂质蛋白的等电点pI及电荷随pH的变化情况已经有所了解(可通过绘制蛋自质滴定曲线来实现)则功能基团很容易确定。如图所示假定图中实线代表目标蛋白的滴定曲线虚线代表样品中主要杂蛋白的滴定曲线那么可以获得如下信息:目标蛋自的pI=pH<将带净的正电荷而pH>将带净的负电荷主要杂蛋白pI=pH<将带净的正电荷而pH>将带净的负电荷图中两条曲线在pH时纵坐标(两种蛋白质的电荷)差异最大当然pH进一步增大这种差异还可能进一步增大但随pH的增大蛋白质的稳定性会迅速下降导致活性的回收率下降而道南效应会进一步增强蛋白质的变性所以在蛋白质的离子交换色谱中很少使用高于的pH。图根据滴定曲线确定起始pH事实上当pH大于以后两种蛋白质的电荷差异已经能够满足分离的要求但pH距离目标蛋白的pI较近目标蛋白所带净电荷较少为了确保目标蛋白具备充足的电荷与离子交换剂结合选择~的pH是比较合适的此时目标蛋白带负电荷所以应选择一种碱性功能基团也就是选择阴离子交换剂。多数情况下人们对样品的了解程度并没有达到上述要求此时离子交换剂功能基团的选择依赖于对目的物的等电点和pH稳定性的了解。如分离蛋白质当对目标蛋白的pI和电性质一无所知时鉴于大多数的蛋白质pI小于可以优先考虑选用阴离子交换剂色谱分离时采用的pH可通过试管小样法确定。在选择好使用阳离子交换剂或是阴离子交换剂以及色谱的起始pH后还必须在强型或弱型离子交换基团中选择一种。强、弱离子交换剂之间最大的差异在于适用的pH范围不同强离子交换剂在较宽的pH范围内能保持带电荷状态而弱离子交换剂只能在较窄的pH范围内使用。如果在较为极端的pH下才能获得最好的分辨率而目标蛋白在此pH下又能保持稳定那么毫无疑问应当选择强离子交换剂。多数蛋白质的pI在中性或略偏酸性的范围内进行分离时采用的pH也往往靠近中性(pH~)此时无论选用强离子交换剂还是弱离子交换剂都能实现分离习惯上人们较多地采用弱型的离子交换剂。还有一种离子交换方法虽然使用相对较少但有时也能获得令人满意的效果那就是使目标蛋白在起始条件下不发生吸附而直接从色谱柱中流出形成穿透峰而多数杂蛋白在此条件下都被吸附在色谱柱上从而达到分离的目的该过程也被称为起始相洗脱。色谱柱的尺寸柱的尺寸通常用内径(mm)×高度(mm)来表示据此可计算出另外两个常用指标:柱体积(mL)和高径比。同其他高选择性的吸附技术一样离了交换色谱通常选用短的色谱柱即高径比小的色谱柱典型的离子交换柱高度在cm高径比一般小于。在大规模的分离过程中当分离参数确定后可以通过简单的增加色谱柱的直径来达到扩大分离规模的目的。但同溶剂洗脱是例外从上样到目标蛋白洗脱始终使用同一种缓冲液此时需要高径比大的色谱柱因为多种蛋白质在柱不同时发生迁移色谱柱越长风带间的距离拉得越大分辨率就越高。缓冲液的选择一般的原则是进行阳离子交换时选用缓冲离子为阴离子的缓冲物质进行阴离子交换时选用缓冲离子为阳离子的缓冲物质。当然这并不绝对但是当选用的缓冲离子与功能基团带相反电荷时应特别注意在上样前确保色谱系统与起始缓冲液之间在pH和离子强度上都达到平衡。在此前提下选用何种类型的缓冲物质取决于色谱分离时的pH条件后者又与目的物的等电点有关。确定了起始pH以后根据缓冲物质的pKa值选用pKa与起始pH很接近的物质作为缓冲成分。例如某蛋白pI=,选用DEAESephadexC作为色谱介质起始缓冲液pH定为则可以选择Tris缓冲液(pKa=)该成分在此pH下有着很好的缓冲能力。至于起始缓冲液的浓度一般情况下低一些比较合适过高的浓度将会带来额外的溶液离子强度的增加可能对目的物的吸附产生影响。当然为了获得最好的效果起始缓冲液的离子强度可以采用能使目的物发生吸附的最高离子强度而洗脱则采用使目的物解吸所需的最低离子强度至于这些离子强度分别为多少可以通过试管小试法确定。以上确定缓冲液的方法是建立在目的物的等电点已知的基础上的但在更多情况下人们对目的物的性质未必清楚此时缓冲液及起始pH的确定可以通过试管小试法确定具体操作如下:准备支mL试管每管加入g基于交联葡聚糖的离子交换剂或mL基于琼脂糖或纤维素的离子交换剂配制一系列浓度为molL的不同pH的缓冲液相邻两种缓冲液的pH相差个单位如果使用阴离子交换剂这个系列的缓冲液pH分布在~如果使用阳离了交换剂这个系列的缓冲液pH分布在~注意随着pH的不同可能需要选择不同的缓冲物质因为任何一种缓冲物质都很难在如此广的pH范围内保持良好的缓冲能力各取rnL上述不同pH的缓冲液分别加人支试管中用以平衡交换剂混合一段时间后弃去上清液再分别加人rnL新鲜缓冲液反复次后可以使试管内的交换剂在pH上完全与缓冲液达到平衡(之所以采用高浓度的缓冲液是为了使离子交换剂能迅速在pH方面达到平衡此过程通常远远慢于离子强度方面达到平衡)再用rnL低浓度(交联葡聚糖交换剂可采用molL的浓度琼脂糖和纤维素交换剂可采用molL的浓度)的同一pH的缓冲液洗涤各试管中的交换剂反复次可确保试管内的交换剂在离子强度方面与起始缓冲液保持一致各支试管中加人相同数量的样品混合放置~min使离子交换剂沉降分析上清液中目的物含量结果如图(a)所示。从图(a)中可以看出图试管法确定起始pH和离子强度(a)确定起始pH为(b)确定起始盐浓度为molL洗脱盐浓度为molL当起始缓冲液pH大于时目的物可以完全吸附在离了交换剂上因此选择pH~作为起始pH。在此pH范围内如果进行阳离子交换色谱可选择磷酸盐缓冲液或羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)缓冲液等如果采用阴离子交换色谱可选择Tris缓冲液或三乙醇胺。如果在离子交换色谱过程中在完成吸附后采用改变pH的方法来洗脱目的物那么从图可以看出选择pH的洗脱缓冲液可以达到目的。在离子交换色谱中确定起始缓冲液的离子强度时多数情况下人们直接采用由缓冲物质提供离子强度的方法即不额外往缓冲液中添加非缓冲盐缓冲物质的浓度(一般为~molL)决定了离子强度只要起始pH选择合适在此离子强度下目的物完全能够与交换剂结合。但有些蛋白质在这种低的离子强度下可能会与交换剂结合过于牢固而难以洗脱甚至导致结构破坏此时在吸附阶段就应当往起始缓冲液中额外添加非缓冲盐来提供较高的离子强度减弱蛋白质与交换剂之间的作用力具体非缓冲盐的浓度应当是多少可以通过试管小试法确定。另外多数情况下在完成吸附后人们通过增加洗脱液离子强度的方式将目标蛋白从色谱柱上洗脱下来洗脱缓冲液就是由起始缓冲液添加特定浓度的非缓冲盐组成的而非缓冲盐所需的浓度同样可以通过试管小试法确定。试管法确定起始和洗脱缓冲液所需离子强度的具体操作类似于起始pH的确定只是支试管中分别用相同pH而不同浓度非缓冲盐的缓冲液分别平衡相邻两管非缓冲盐的浓度相差molL然后加入等量样品充分混合后也对上清液目的物含量进行分析结果见图(b)。由图可以看出molL是使目的物能够吸附的最高非缓冲盐浓度而molL是使目的物发生解吸的最低非缓冲盐浓度由此确定起始缓冲液中应添加非缓冲盐使其终浓度为molL而洗脱缓冲液中非缓冲盐浓度增加到molL而这两种缓冲液的缓冲物质组成、浓度及pH均应相同。选择缓冲液时除了考虑缓冲物质成分、pH和离子强度外有时还需要注意其他一些问题。如前所述当离子交换后的洗脱组分需要进行冷冻于燥时应考虑选用挥发性的缓冲物质以尽可能少地将杂质成分带入最终产品中。在有些情况下离子交换的缓冲液中还会添加一些其他的化合物其作用主要有增加目的物的溶解度、提高色谱分辨率、保护待分离物质等。如膜蛋白存在于生物膜中其表面是疏水区与生物膜中疏水性的脂质成分以疏水相互作用结合这类蛋白在水中是不溶的或溶解度很低。往溶液中添加非离子型或兼性离子型去污剂可以使膜蛋白溶解并分散在水溶液中便于色谱的进行。某些情况下添加特定的物质还能提高色谱时的分辨率。例如在分离一些蛋白质时添加甜菜碱或牛磺酸能减少蛋白聚集体的形成及与交换剂的结合从而提高了分辨率。有的中性聚合物如聚乙二醇(PEG)能与蛋白质竞争溶液中的水分子这将增加蛋白质与离子交换剂的相互作用而提高分辨率。近来有研究表明(PEG)也有类似于分户伴侣的作用而有助于蛋白质的折叠复性过去(PEG)对蛋白质的稳定机理一直被认为是在蛋白质分了表面形成一个保护层近年来的研究表明作为共溶剂的(PEG)对蛋白质的保护作用机制实际上是共溶剂的加入改变了溶液热力学性质使得天然蛋白质在溶液中的稳定性得到增强。另外分离过程中有时还需添加酶抑制剂。如在蛋白质分离过程中样品体系中有蛋白酶存在会造成目标蛋白被水解使回收率下降添加蛋白酶抑制剂能够有效保护目标蛋自不被降解。丝氨酸蛋白酶常用的抑制剂是苯甲磺酰氯巯基蛋白酶常用的抑制剂是碘乙酰胺金属蛋白酶可采用金属螯合剂作为抑制剂。以上是离子交换色谱前对交换剂、缓冲液、起始条件等进行选择的一般原则而在实际的实验研究中任何一套实验方案最终是要通过实践来检验并不断优化的。(二)离子交换剂的准备选择好离子交换剂后进行色谱分离前必须先将离子交换剂准备好这包括离子交换剂的预溶胀和清洗、装柱以及用起始缓冲液平衡色谱柱直至流出液在pH和离子强度方面与起始缓冲液一致。离子交换剂的预处理各种不同的离子交换剂在使用前所需进行的预处理程序是不同的。SOURCE系列、MonoBeads系列和MiniBeads系列等细颗粒介质通常产品供应商已经将其制成预装柱出售使用前无需预处理直接用起始缓冲液平衡后即可加样。基于琼脂糖的Sepharose系列和BioGelA系列离子交换剂以及DEAESephacel交换剂是以液态湿胶形式出售的一般也无需预处理使用前倾去上清液按湿胶缓冲液(体积比)=:的比例添加起始缓冲液搅匀后即可装柱。基于Sephadex的离子交换剂以固态干胶形式出售使用前需要进行溶胀。溶胀是色谱介质颗粒吸水膨胀的过程膨胀度与基质种类、交联度、带电基团种类、溶液的pH和离子强度等有关。溶胀过程通常应将交换剂放置在起始缓冲液中进行完全溶胀在常温下需~天在沸水浴中需h左右而且在高温下溶胀还能起到脱气的作用。在溶胀过程中应避免强烈搅拌例如用磁力搅拌器搅拌可能导致凝胶颗粒破裂。另外Sephadex类干胶进行溶胀时不能使用蒸馏水因为在溶液离子强度很低的情况下交换剂内部功能基团之间的静电斥力会变得很大容易将凝胶颗粒胀破。基于纤维素的离子交换剂也是以干态形式出售的使用前需要进行溶胀。纤维素的微晶结构是不会被静电斥力破坏的故可以用蒸馏水进行溶胀沸水浴加热能够加快此过程。离子交换纤维素在加工制造过程中会产生一些细的颗粒它们的存在会对流速特性产生影响应当将其除去具体方法是将纤维素在水中搅匀后进行自然沉降一段时间过后将上清液中的漂浮物倾去然后再加入一定体积的水混合反复数次即可。有些纤维素产品制造完成后未经处理其中含有很多杂质成分使用前必须进行洗涤。洗涤的方法是先用。molL的NaOH浸泡半小时倾去碱液用蒸馏水将交换剂洗至中性再用molL的HCl浸泡半小时再洗至中性又用molL的NaOH浸泡半小时最后又洗至中性即可C酸碱洗涤顺序也可反过来用酸碱酸的顺序洗涤。酸碱处理的顺序决定了最终离子交换剂上平衡离子的类型对于阴离子交换纤维素一般用碱酸碱的顺序洗涤最终平衡离子是OH对于阳离子交换纤维素一般用酸碱酸的顺序洗涤最终平衡离子为H。洗涤完以后必须用酸或碱将离子交换纤维素的pH调节到起始pH以后才能装往使用。离子交换树脂有的以固态颗粒形式出售有的以液态形式出售使用前的处理方法类似于离子交换纤维素也需要先倾灌除去细的颗粒然后用酸碱轮流洗涤洗涤时所使用的酸碱浓度大于纤维素交换剂一般可molL的NaOH和HCl进行处理。装柱装柱是色谱技术的一个重要环节装柱质量的好坏直接关系到分离效果一根填充得不好的色谱柱会导致柱床内液体不均匀地流动造成区带扩散大大影响分辨率。装柱之前首先用缓冲液将色谱柱底部死空间内的空气排空具体操作可通过将柱下端接口连接恒流泵将缓冲液泵人色谱柱下端直至柱中可以看到少量液体为止。将预处理好的离子交换剂放置在烧杯中倾去过多的液体大致使得交换剂:上清液(体积比)=:轻微搅拌混匀利用玻棒引流尽可能一次性将色谱介质倾人色谱柱。注意液体应沿着柱内壁流下防止有气泡产生当色谱介质沉降后发现需要再往柱内补加交换剂时应当将沉降表面轻轻搅起然后再次倾入防止两次倾注时产生界面。平衡平衡过程的目的是为了确保离子交换剂上的功能基团与起始缓冲液中的平衡离子间达到吸附平衡。判断色谱柱是否已经达到平衡是通过检验柱下端流出的洗脱液与起始缓冲液在pH、电导和离子强度方面是否达到一致由于在这几个指标中通常pH最难达到平衡所以往往检测洗脱液的pH即可。对于一些弱型离子交换剂由于本身具有一定的缓冲能力直接用起始缓冲液是很难将其平衡至起始pH的此类交换剂在装柱前就应当用酸或碱将其pH先调节至起始pH装柱后再用起始缓冲液进行平衡。有时为了加快离子交换剂达到平衡的速度先选择与起始缓冲液有着相同pH但是浓度更大(如molL)的缓冲液平衡色谱柱由于其缓冲能力更大较短时间内交换剂在pH方面就达到了平衡再换用起始缓冲液进行平衡最终使洗脱液在离子强度方面也与起始缓冲液一致。样品的准备在任何形式的色谱中想要获得好的分辨率及延长色谱柱的使用寿命样品中必须无颗粒状物质存在。通常颗粒状物质主要出现在粗样品中其成分多为细胞碎片、不溶性蛋白质聚合物、脂质污染物等而色谱后获得的样品中都不会含有颗粒物。因此混浊的样品在上柱前必须通过过滤或离心除去颗粒状物质。一般来说所使用的分离介质颗粒越小对样品溶液的澄清度要求越高。在使用平均粒度在μm以上的分离介质时使用孔径为μm的滤膜进行过滤就能够达到要求在使用平均粒度小于μm的分离介质时应使用孔径为μm的滤膜进行过滤需要无菌过滤或澄清度特别高的样品时可使用孔径为μm的滤膜进行过滤。当样品体积非常小或滤膜对目的物有吸附作用时为了减少样品的损失选择g离心min也能达到除去颗粒物的目的。样品的黏度是影响上样量和分离效果的一个重要方面高黏性的样品会造成色谱过程中区带不稳定及不规则的流型。因此样品相对于洗脱剂的黏度有一定的限制通常样品钻度最大不超过×Pas对应的目的物浓度不超过。在离子交换色谱上样前必须确保样品溶液在pH和离子强度方面与起始缓冲液一致这样才能保证在起始条件下目的物能吸附在离子交换剂上(在起始相洗脱中保证目的物不被吸附而杂质发生吸附)。对于固体样品将其溶于起始缓冲液并校对pH即可实现对于蛋白质溶液可以按一定的比例与浓缩形式的起始缓冲液(pH相同而浓度为起始缓冲液的倍)混合具体比例根据缓冲液浓度及样品体积进行计算使混合液的离子强度与起始缓冲液达到一致。要想使样品溶液的离子成分与起始缓冲液完全相同最好的方法是进行缓冲液交换或透析操作。缓冲液交换一般是通过SephadexG凝胶过滤色谱来实现的将样品加到已经用起始缓冲液平衡好的凝胶柱上蛋白质等大分子从外水空间流出而样品溶液中的小分子进入凝胶颗粒内部由此大小分子间实现了组别分离当蛋白质从凝胶柱下方流出时己经溶于起始缓冲液体系中了。采用透析法时将样品置于透析袋内放置在盛有起始缓冲液的大烧杯中不停搅拌使透析袋内外离子达到平衡往烧杯内更换新的起始缓冲液反复数次可使样品溶液与起始缓冲液在pH和离子强度方面达到一致。当样品的体积很大时无法采用凝胶过滤色谱或透析法此时可以通过稀释样品的方法使其离子强度与起始缓冲液一致再用酸碱调节pH至起始pH同样能够确保目的物发生吸附。(三)加样当色谱柱和样品都准备好以后接下来就是将样品加到色谱柱上端使样品溶液进入柱床目的物完成吸附并用起始缓冲液将不发生吸附的杂质洗去。加样量虽然在实验方案设计时应当考虑根据所需分离样品的量来确定色谱柱的规格和离子交换剂的用量但在很多情况下。往往刚好相反人们需要根据已有实验条件即色谱柱和离子交换剂的规格来确定色谱时的最大加样量。理论上将所使用的离子交换剂的有效交换容量乘上色谱柱柱床的体积就可以计算出最大加样量。但事实上有效交换容量并不是常数它随目的物种类的不同而有不同的取值样品溶液中的杂质组分往往也能与离子交换剂结合它们的种类和数量会影响到目的物的实际交换容量因此在离子交换色谱中为了获得理想的分离效果建议加样时样品中目的物的含量不应超过其有效交换容量的~。以上是通过理论计算的方法来确定加样量实践中有时目的物的含量是未知的样品中杂质成分对有效交换容量的影响可能也比较复杂此时可以通过试管小试法来确定最大加样量。具体的操作类似于用试管小试法确定起始pH和离子强度在支试管中分别加入相同数量的离子交换剂用起始缓冲液充分洗涤、平衡然后往支试管中分别加人数量递增的样品溶液相邻两支试管间加样量的差值是恒定的充分混合完成吸附分析上清液中目的物的含量上清液中不含目的物而加样最多的试管对应的加样量即为试管条件下的最大加样量根据试管内以及色谱柱床离子交换剂的体积可以计算出色谱条件下的最大加样量。考虑到色谱分离时随流速增加动态交换容量会下降实际的加样量必须低于最大加样童。加样方法加样是将一定体积的样品溶液添加至柱床的床面依靠重力或泵提供的压力样品进入床面的过程。在加样过程中样品溶液应尽可能均匀地添加至床面这样在柱床的横截面上样品能够均匀进入另外要防止液流破坏床面的平整性否则会造成区带形状变差洗脱峰变宽。加样的方法有多种如果采用的是成套液相色谱系统一般都提供标准的加样方法如通过进样器或注射器等最终利用泵将样品溶液加入柱床。加样时的流速会影响到样品的吸附一般来说如果起始条件下目标蛋白能够较为牢固地吸附在交换剂上则加样的流速可以取较大的值而如果起始条件与目标蛋白解吸条件相距不远流速应当慢一些保证目的物有充足的时间发生吸附对于黏度相对较大的样品加样时流速也不能太大。对于预装柱柱的上端一般带有液流分配器能保证样品加入时平均分布在床面上并均匀进入柱床。对于自装柱常见的加样方法有排干法和液面下加样法。排干法是最常用的所需设备最少但对操作的要求较高。加样前先将色谱柱上口拧开让床面之上的液体靠重力作用自然排干当床面刚好暴露时将色谱柱下端阀门关闭此时柱内液体不能继续流出用吸管将样品加到床面上但一定要注意不能破坏床面的平整以免造成区带的扭曲和倾斜然后打开柱下端阀门受重力作用样品溶液进入床面必要时用少量起始缓冲液洗涤色谱柱上端打开阀门使洗涤液也进入床面最后用起始缓冲液充满色谱柱内床面上端空间拧紧色谱柱上口即可以用恒流泵泵入起始缓冲液完成吸附过程并洗去不吸附物质。而液面下加样法则是将色谱柱上口拧开不排干床面之上的液体而是利用带有长的针尖的注射器将样品溶液轻轻注人液面下使其平铺在床面上注意采用此方法时样品溶液的密度必须大于起始缓冲液这可以通过往样品溶液中添加葡萄糖来实现。打开柱下端阀门后同样依靠重力样品会进入床面。然后拧紧柱上口用起始缓冲液进行洗涤。采用这两种方法加样时不存在流速过快的问题。样品进入柱床后接着就是用起始缓冲液洗涤柱床将起始条件下不能被吸附的物质从柱中洗去在色谱图谱上形成穿透峰。通常在色谱柱下端连接一个紫外检测器根据测定出的nm处吸光度来指示出峰情况洗涤过程一般需进行到出峰后紫外吸收重新回到初始值附近为止一般来说洗涤所需起始缓冲液的量不会超过两倍柱体积在理想状态下甚至一个柱体积的起始缓冲液即可完成洗涤过程流速对清洗过程不会产生大的影响因此必要时特别是大规模的分离时可以适当提高洗涤流速来缩短分离时问。如果色谱的起始条件是预先摸索过的目的物此时不会出现在穿透峰中因此洗涤时柱下端流出的洗脱液无需进行收集。而如果采用的是起始相洗脱目的物在起始条件下不发生吸附而其他杂质成分被吸附在色谱柱上那么应当对洗脱液进行分部收集洗涤完毕将穿透峰对应的分部合并可得到经过纯化的目的物溶液。(四)洗脱多数情况下在完成了加样吸附和洗涤过程后大部分的杂质已经从色谱柱中被洗去形成穿透峰即样品已实现部分分离。然后需要改变洗脱条件使起始条件下发生吸附的目的物从离子交换剂上解吸而洗脱如果控制洗脱条件变化的程度还可以实现不同的组分在不同时间发生解吸从而对吸附在柱上的杂质进一步分离。洗脱机制洗脱前可用至几个柱体积(当不考虑骨架体积时VVV)洗去不吸it附的物质。Sephadex系列在第一个柱体积中往往还存在分子筛效应。所以洗脱前实际上也进行了一定的分离。被结合和吸附的物质不改变条件是否能从柱上洗脱下来应该说这和溶质与离子交换剂结合的强弱有很大的关系溶质在柱上吸附或交换的量的多少可用吸附平衡常数或称为分布系数σ来表示其定义可用数学式表示为:σ=被吸附的某溶质量某溶质总量=固定相(流动相固定相)吸附平衡常数σ的取值在~不同σ值下溶质的吸附强度不同被洗脱的难易程度也会出现变化。若σ=溶质没被吸附可能不带电或带相同电荷在一个柱体积被洗脱Ve=VV=V若σ=或接近目的物可被完全吸附或几乎完全it,,吸附Ve=V若σ=溶质被吸附Ve=Vt=Vt一t,,,,不同σ值时如不改变初始条件溶质所需的洗脱体积见表。表不同吸附平衡系数σ下溶质所需的洗脱体积讨论σ的影响因素:pH影响到电性与电量可使σ发生变化离子强度增大可使σ下降减弱溶质的吸附溶质的电荷分布、离了交换剂的电荷分布及位阻效应对溶质的σ都有影响溶质浓度与σ呈反比关系。根据上述讨沦的洗脱机制要使蛋白质从离子交换剂上解吸而被洗脱采取的方法如下。改变洗脱剂的pH会导致蛋白质分子带电荷情况发生变化当pH接近蛋白质等电点时蛋白质分子失去净电荷从交换剂上解吸并被洗脱下来。对于阴离子交换剂为了使蛋白质解吸应当降低洗脱剂的pH使目标蛋白带负电荷减少对于阳离子交换剂洗脱时应当升高洗脱剂的pH使目标蛋白带正电荷减少从而被洗脱下来。增加洗脱剂的离子强度此时蛋白质与交换剂的带电状态均未改变。但离子与蛋白质竞争结合交换剂降低了蛋白质与交换剂之间的相互作用而导致洗脱常用NaC与KC。往洗脱剂中添加特定离子某种特定的蛋白质能与该离子发生特异性相互作用而被置换下来这种洗脱方式称为亲和洗脱。往洗脱剂中添加一种置换剂它能置换离子交换剂上所有蛋白质蛋白质先于置换剂从柱中流出这种色谱方式称为置换色谱。阶段洗脱阶段洗脱分为pH阶段洗脱和离子强度阶段洗脱。pH阶段洗脱是用一系列具有不同pH的缓冲液进行洗脱pH的改变造成目的物带电状态的改变会在某一特pH的缓冲液中被洗脱而与在其他阶段被洗脱的杂质之问实现分离。此方法再现性较好不同pH的缓冲液也易于配制但注意目的物被洗脱时的pH往往靠近其等电点须防止目的物在色谱柱中发生等电点沉淀所以分离前有必要测试在使用的pH和离子强度条件下样品组分的溶解度。离了强度阶段洗脱是使用其有相同pH而离子强度不同的同一种缓冲液进行洗脱不同的离子强度通常通过添加不同比例的非缓冲盐来实现最常用的非缓冲盐是NaC也可通过添加乙酸铵等挥发性盐的方法来增加离子强度或一直接增加缓冲液中缓冲物质的浓度来增加离子强度例如起始缓冲液采用pHmolL磷酸盐缓冲液而洗脱缓冲液采用pH,molL磷酸盐缓冲液。增加离子强度后减弱了可交换分子与离子交换剂之间的静电作用力首先使一些带净电荷较少吸附得不太牢固的物质解吸而被洗脱下来再次增加离子强度使结合得更为牢固的一些物质被洗脱目的物将在特定离了强度的缓冲液中被洗脱而与在其他离子强度下被洗脱的杂质实现分离。阶段洗脱技术简单易于操作对于一些色谱条件已经清楚的蛋白质往往有较高的分辨率图为用离子强度的梯度洗脱和阶段洗脱分离牛血清蛋白效果的比较可以看出阶段洗脱要优于梯度洗脱。但阶段洗脱有时效果并不理想图显示了用离子强度阶段洗脱和线性梯度洗脱某混合物的分离效果。显然阶段洗脱效果较差峰和峰在线性梯度洗脱时又分出儿个组分而峰和峰实际上是同一组分在阶段洗脱时却被分成两个洗脱峰因此采用阶段洗脱时设计各阶段的洗脱条件和解释分析结果时必须十分谨慎若相邻两个阶段间pH或离子强度条件变化过大会使得吸附强弱较为接近的不同组分在同一阶段被洗脱此时典型的洗脱峰具有陡峭的前沿和拖尾的后沿。而两个阶段间洗脱条件变化过小则可能会因为洗脱剂的洗脱能力太弱而形成宽而拖尾的洗脱峰。另外如果某阶段未完全将解吸蛋白洗下就过早更换洗脱剂拖尾现象会造成错误洗脱峰的出现。因此在初次分离目标蛋白时人们往往先采用连续梯度洗脱待确定了样品的特性和洗条件后再考虑采用阶段洗脱来优化分离效果缩短操作时间。图离子强度线性梯度洗脱和阶段洗脱分离牛血清蛋白图谱色谱柱尺寸为cm×cm离子交换剂为QAESephadex样品为mL冻干牛血清洗脱缓冲液为pHmolLTrisHCl流速为mLmin图离子强度阶段洗脱和线性梯度洗脱效果对比梯度洗脱梯度洗脱与阶段洗脱原理上是相同的但由于洗脱剂的洗脱能力是连续增加的洗脱峰的峰宽一般会小于阶段洗脱拖尾现象也会得到明显的改善甚至完全消除并且不会造成同一组分被分离成几个峰的现象常常能获得较高的分辨率。梯度洗脱也分为pH梯度洗脱和离子强度梯度洗脱。获得连续线性pH梯度比较幽难它无法通过按线性体积比混合两种不同pH的缓冲液来实现因为缓冲能力和pH具有相关性并且pH的改变往往会使得离子强度同步发生变化因此pH梯度洗脱很少被使用。离子强度梯度洗脱即盐浓度梯度洗脱是离子交换色谱中最常用的洗脱技术它再现性好而且易于产生只需将两种不同离子强度的缓冲液(起始缓冲液和极限缓冲液)按比例混合即可得到需要的离子强度梯度此过程中缓冲液的pH始终不变。起始缓冲液是根据实验确定的起始条件而选择的由浓度很低的缓冲物质组成的特定pH的缓冲液通常缓冲物质浓度在~molL。极限缓冲液是往起始缓冲液中添加了非缓冲盐如NaC后得到的也可以是缓冲物质和pH与起始缓冲液相同但缓冲物质浓度较高的缓冲液其中前一种方法使用较多。例如某离子交换色谱的起始缓冲液为pHmolL的TrisHC缓冲液极限缓冲液为含molLNaC的pHmolL的TrisHC缓冲液将两种缓冲液按一定的比例混合可以得到NaC浓度在~molL连续变化的离子强度梯度。在色谱过程中梯度缓冲液可以通过梯度混合器来获得。最简单的梯度混合器由通过一根导管连接的两个烧杯组成图为市售梯度混合器它们都是根据连通器原理来产生连续变化的梯度。容器A中首先放置的是起始缓冲液容器B中放置极限缓冲液容器A和容器B通过管路相通容器A内置搅拌装置(常用磁力搅拌器)并巨底部有管路导出。开始时装入容器A内的起始缓冲液和装入容器B内的极限缓冲液的液面高度应保持相同这样打开A、B间的管路当容器A中液体作为洗脱缓冲液流出时其液面下降根据连通器原理容器B中的极限缓冲液会通过管路流到A中使容器A和B的液面高度始终保持一致此过程中容器A中的洗脱缓冲液离户强度在不断增加到两个容器中液休都用完的时刻容器A中的洗脱缓冲液等价于极限缓冲液。在洗脱过程中的某一时刻梯度混合器中流出的梯度缓冲液中的盐浓度(如NaCl浓度)可以根据以下公式计算得出:AAC=C(CC)(vV)()式中C容器A中流出洗脱剂体积为v时洗脱缓冲液的盐浓度molLC一起始缓冲液中的盐浓度一般为C极限缓冲液中的盐浓度v一已经从梯度混合器中流出的洗脱剂的体积L或rnLVo梯度洗脱剂的总体积是起始缓冲液和极限缓冲液体积的总和A一容器A的横截面积crnlA容器B的横截面积。图梯度混合器装置盐浓度梯度曲线可以有不同的形状当A=A时即盛放起始缓冲液和极限缓冲液的容器横截面积相同时产生的是线性梯度当A,A时即盛放起始缓冲液的容器横截面积小一于盛放极限缓冲液的容器时产生的是凸形梯度当A,A时即盛放起始缓冲液的容器横截面积大于盛放极限缓冲液的容器时产生的是凹形梯度(图)。如果色谱采用的是成套液相色谱系统仪器内都含有梯度产生装置无需额外的梯度混合器通过两个泵或者一个泵联一个转换阀可以任意地由起始和极限缓冲液产生线性、凸形、凹形以及更为复杂的混合型梯度并几这种梯度的产生可以通过计算机程序进行控制操作时只需配制好两种缓冲液即可在计算机中用软件对所需梯度进行设置色谱分离时系统会自动调节泵的流速来产生所需的梯度缓冲液。在选择梯度的形状时如果是对目的物首次进行离子交换分离强烈建议采用线性梯度多数情况下NaCl的浓度范围可选择在~molL变化线性梯度洗脱的结果可以作为进一步优化分离过程的依据通过改变梯度的形状和斜率来提高分辨率也可以根据目的物被洗脱时的盐浓度确定进行阶段洗脱的条件。凸形梯度有利于改善梯度末尾部分的分辨率凹形梯度有利于改善梯度起始阶段的分辨率。混合型梯度可以在组分吸附能力相近需要改善分辨率的位点提供足够的分辨率而在对分辨率不作要求的位点采用陡峭的梯度缩短时间从而实现分辨率和分离速度的最佳结合但混介型梯度形状的确定绝不是随意的而是根据线性梯度洗脱结果进行优化而来的。图梯度的形状及产生装置图梯度斜率对分辨率的影响色谱柱为MonoQHR样品为部分纯化的强啡肽转化酶起始缓冲液为pHmmolLTris缓冲液极限缓冲液为含lmolLNaC的pHmmolLTris缓冲液流速为rnLmin除了梯度的形状外梯度的高度和斜率也影响着分离的速度和效果。梯度的高度是指起始缓冲液与洗脱终止时梯度缓冲液中盐浓度的差值梯度的斜率是指梯度的高度与完成此梯度时所用洗脱剂体积(或时间)的比值。通常较低的斜率有利于改善吸附能力相近组分之间的分辨率但会导致洗脱峰峰宽加入和分离时间的延长相反较大的斜率可以实现快速分离得到尖锐的洗脱峰但不同组分之间的分离度差异会减小。图显示了不同斜率的梯度洗脱在分离效果上的差异从图中可以看出斜率降低后分辨率得到改善。在洗脱过程中流速会影响到待分离物质的分辨率。在分离低分子量物质时。由于分子在固定相和流动相之间扩散速率快能迅速达到平衡色谱时的流速仅受到介质机械强度、系统压力等的限制。但蛋白质等大分子物质由于扩散速率慢达到吸附和解吸平衡需要一定的时间这将限制加样和洗脱过程中的流速。多数情况下适当地降低洗脱过程的流速可以提高色谱的分辨率但会延长分离所需的时间因此在第一次分离时可以选择一种适中的流速根据色谱结果是否达到分辨率的要求再对流速进行优化。亲和洗脱亲和洗脱是往洗脱剂中添加能与目的物发生特异性相互作用的离子而将目的物从离子交换剂上置换下来的洗脱方式在亲和洗脱中解吸是特异性的。亲和洗脱经常用于酶的离子交换分离使用离子状态的底物作为洗脱物质底物和离子交换剂带同种电荷利用酶和底物之间的专一性结合可以使酶蛋白解吸这种洗脱方式又称底物洗脱。典型的例子是以,二磷酸果糖作为洗脱剂从CM一纤维素色谱柱上洗脱果糖,二磷酸酶底物分子完全解离时带个负电荷而果糖二磷酸酶由个亚基组成每个亚基都能结合一个底物分子。因此该酶与底物结合后其净电荷的变化达到个单位这足以将其从阳离子交换剂上洗脱下来。置换色谱在置换色谱中采用特殊的置换物质来进行洗脱置换剂与离子交换剂之间具有很强的亲和性因此包括目的物在内的所有物质都从色谱柱上被置换下来以相同的速率先于置换剂从柱下端流出形成一系列矩形的洗脱峰。在置换洗脱时不存在一个目的物被洗脱而其他杂质仍被吸附的条件被洗脱的不同组分之间也不存在取代吸附关系。常见的置换剂是一些多聚离子它们带大量与交换剂上功能基团相反的电荷因此与交换剂之间有着非常高的亲和力。在离子交换中置换色谱较少被使用一般很难找到合适的置换剂能够将不同组分进行较好的分离。不过也有成功应用的报道Peterson和Liao等研究了用置换色谱的方法分离β乳球蛋白将mgβ乳球蛋白样品加样至mLTSKDEAE色谱柱后。用pH的磷酸钠缓冲液完成吸附并洗去穿透组分然后用羧甲基葡聚糖和硫酸软骨素作为置换剂洗脱得到两个矩形洗脱峰该法的优势是其容量为普通离子交换色潜的两倍。(五)样品的收集和处理通常色谱柱的下端连接一个紫外检测器用于检测蛋白质、核酸类组分的洗脱过程而紫外检测器后又连着分部收集器用以收集柱下端流出的洗脱液。人们通过测定洗脱液在nrn处的吸光度可以判断组分何时被洗脱以及各洗脱峰分别分部收集在哪几支试管中分部收集后则需要通过测定目的物的活性或其他性质来判定目标分子。有时会出现目标蛋白与其他组分未能完全分开的情况这时需要选择方法对收集到的目的物分部进行进一步分离比较棘手的是目的物组分在色谱时被分离成多个洗脱峰导致这种现象的原因是多方面的可能是加样量过大造成的也可能是起始条件过分远离解吸条件目的物结合过于牢固而造成部分变性引起的目的物如果是多亚基的蛋白质亚基之间发生解聚也会导致多洗脱峰的出现。遇到这种现象时应对其产生原因进行分析通过改变色谱条件予以排除。采用冷冻干燥的方法可以对收集的分部进行浓缩或得到固体样品粉末如果色谱时使用了挥发性缓冲物质作为洗脱剂此过程将比较方便并且在固体中没有缓冲物质残留。乙酸铵是常用的挥发性缓冲物质由于氨比乙酸更易挥发在冻干过程中pH会下降从乙酸中冻干会使一些蛋白质发生聚集为避免这种情况应将pH调节至~。要注意的是冻干可能会使蛋白质的结构产生可逆的改变。(六)离子交换剂再生、清洗、消毒和储存每次色谱分离后往往还有一些结合比较牢固的物质残留在离子交换剂上如变性蛋白、脂类等它们的残留会干扰正常的吸附并可能对样品造成污染甚至堵塞色谱柱。因此每次使用后应彻底清洗掉柱中的结合物质恢复色谱介质的原始功能。再生过程根据介质的稳定性和功能基团不同有着不同的方法通常离子交换剂的制造商会提供色谱介质再生和清洗的方法。一般情况下人们采用最终浓度达到molL的盐溶液清洗色谱柱可以除去任何以离子键与交换剂结合的物质选择盐的种类时应使其含有离子交换剂的平衡离子以使得再次使用前的平衡过程更容易进行NaCl是最常规的选择其中的Na是大多数阳离子交换剂的平衡离了而C是大多数阴离子交换剂的平衡离子。当色谱柱上结合了以非离子键吸附的污染物后用盐溶液无法将其除去此时应选择更为严格的清洗方案碱和酸是良好的清洗剂但使用时应注意离子交换剂的pH稳定性。通常基于琼脂糖的离子交换剂可以用盐溶液和moL的NaOH进行清洗基于纤维素的离子交换剂用盐溶液和moL的NaOH进行清洗基于葡聚糖和琼脂糖的交换剂应避免pH小于的酸性环境它们可以用lmoL的乙酸钠(用强酸调节pH至)和mnL的NaOH交替清洗。脂类或脂蛋白污染物可以用非离子型去污剂或乙醇来清洗。高效离子交换色谱介质和预装柱通常都是原位清洗(CIP)将清洗剂直接通过泵加入色谱柱污染物从柱下端被洗出清洗后柱效率几乎不受影响。对于自装柱既可以进行原位清洗但清洗剂的使用往往会使柱床的体积发生很大的变化也可以将交换剂从色谱柱中取出后进行清洗。细胞和微生物的生长不仅会严重污染样品还会影响离子交换柱的色谱特性并可能堵塞色谱柱因此在离子交换剂使用前和储存前都应进行消毒操作。在色谱前最常用的消毒方法是以NaOH溶液清洗色谱柱NaOH同时具有清洗和消毒的效果。如果离子交换剂需长期储存应将其浸泡在防腐剂中阴离子交换剂可浸泡在含乙醇的molL乙酸中阳离子交换剂可浸泡在含乙醇的molL的NaOH中有时也可使用叠氮钠等其他防腐剂。对从未使用过的色谱介质应放置在密闭容器中在~保存。对已使用过的色谱介质在彻底清洗后浸泡在含防腐剂的溶液中于~保存。(七)离子交换剂的规模化离子交换因其具有很高的样品吸附容量不但在实验室分离中被广泛使用而且适合于规模化地纯化蛋白质并且离子交换剂具有从稀溶液中浓缩蛋白质的能力也适合于从大体积的样品如发酵液中纯化所需蛋白质。一般对于实验室小规模的制备一根体积为mL的色谱柱能够基本满足需要而在工业化应用中色谱柱的体积可以被放大到~L。离子交换放大过程中的规则是保持色谱时上样、吸附和洗脱的条件不变这里包括样品的组成、离子交换剂的种类、样品介质比、起始和洗脱缓冲液的组成、pH和离子强度等在此基础上根据样品量放大柱体积、洗脱剂的体积、流速等参数。其中柱体积是随样品体积的增大而线性增大的并且柱体积的增大主要通过选用内径大的色谱柱来实现柱高一般不宜有太大的增加否则会造成分离时间的增加和样品峰宽的加大。至于洗脱剂的体积无论采用哪种洗脱方法也都是随样品体积增加而增加的。色谱时的流速有两种常用的表示方法即线性流速(cmh)和体积流速(mLmin)一般在讨沦离子交换剂的流速特性和动力学时采用的是线性流速而在实际操作过程中通过泵直接调节控制的是体积流速它们之间的换算关系为:体积流速(mLmin)=线性流速(cmh)×色谱柱截面积(mm)×。在放大过程中应保持线性流速不变而增加体积流速将随色谱柱截面积的增大而增加。大量样品的分离中使用的离子交换剂应当具有良好的物理和化学稳定性基质颗粒通常不宜太小因为基质粒度的大小与色谱柱内的背景压力直接相关相同的粒度情况下颗粒直径分布均匀有利于保持相对较低的背景压力。另外由于大规模分离时交换剂用量很大色谱介质的价格也是必须考虑的。在大规模分离中为保证液流均匀进入柱床还必须在柱床的上方设计一个液流分配器这种分配器往往采用多口注入方式。最后还要注意的是在常规离子交换色谱时上样前必须保证样品溶液和起始缓冲液在pH和离子强度方面保持完全一致这可以通过缓冲液交换或者透析等手段来实现。但体积巨大的样品显然无法进行上述操作此时可以对样品进行稀释直至其与起始缓冲液离子强度一致然后再用酸碱调节样品溶液pH使其与起始pH一致这样虽然样品溶液在缓冲物质和盐的组成上与起始缓冲液并不相同但由于pH和离子强度方面的一致性也能确保目标蛋白吸附在色谱柱上。四、离子交换色谱的应用离子交换色谱技术已广泛用于各学科领域。上要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质也可用于分离核酸、核苷酸等及其他带电荷的生物分子。(一)混合物的分离基于离子交换色谱技术的分离原理待分离的混合物只要有带电荷的物质就能采用该技术。如果目的物本身带电荷可通过选择合适的离子交换剂类型、控制起始条件来使其混合物中其他分子产生带电荷差异吸附程度不同从而可通过优化洗脱条件得到较好的分离如果目的物本身不带电荷该步则可以通过控制条件设计让尽可能多的杂质被吸附在柱上往往同样可达较好的分离效果。不同规模应用离子交换色谱时在填料及分离条件相同的情况下往往能达到相似的分离效果。例如TIshihara等开展了蛋白质快速规模化离子交换色谱与研究规模的分离效果比较(图)电泳结果表明最后的分离效果基本相似。图蛋白质快速规模化离子交换色谱图(a)及不同规模分离样品的电泳图谱(b)条件:V=L流速cmminSPSepharoseHP色谱柱流动相pH样品负荷t分子量标准~mLVt规模的色谱分离样品lmg蛋白质mL树脂和离子交换色谱在蛋白质类物质的分离上仍然是最经典的且不断与时俱进。而目前的研究趋势体现在不断强化理论分析拓宽应用角度提高应用效率上。例如LXu等开展了以蛋白质的三维结构为基础预测蛋白质在离子交换色谱上的保留时间的研究TBrucha等以不同的保留模型研究蛋白质表面修饰后对色谱保留行为的影响TArakawa等研究精氨酸对蛋白质疏水作用色谱、离子交换色谱吸附和洗脱的影响发现添加适量精氨酸在两种色谱中都能减小蛋白质聚集的趋势从而可大大提高目的蛋白的回收率。PCHavugimana等研究蛋白质组学中采用双重高效离子交换色谱对样品进行预处理可达更好的蛋白质组学分析结果。离子交换色谱在其他生物活性类物质的分离上研究实例多且不局限于规模分离前期甚至不以装柱的形式应用。例如:AToribo等开展强阴离子离心分部色谱的方法快速规模化地分离一种白芥子硫苷化合物的研究取得了较好的分离效果。(二)蛋白质的复性蛋白质的离了交换色谱复性方法一般采用种缓冲液体系:变性缓冲液溶解蛋白质并使伸展的变性蛋白质吸附到离子交换色谱介质表面用复性缓冲液向色谱柱梯度进液以取代柱中的变性缓冲液有利于蛋白质在色谱柱上自发地折叠用高浓度盐离子的洗脱缓冲液把折叠后的蛋白质洗脱出来。显然离子交换色谱同样可有效分隔蛋白质分子抑制分子间的聚集作用并可通过条件变化帮助变性蛋白重新折叠复性最终达复性与分离的双重效果。为提高色谱复性的效果近年来的研究倾向于色谱与其他复性方法联合使用例如QMZhang等研究一种离子交换色谱与人工分子伴侣相结合的新型蛋白质复性方法可使蛋白质的复性率得到较大的提高
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