水稻品种SSR基因型PCR-银染检测试剂盒

水稻品种SSR基因型PCR-银染检测试剂盒水稻品种SSR基因型PCR-银染检测试剂盒欢迎光临fangsheke66豆丁文档水稻品种SSR基因型PCR-银染检测试剂盒使用说明书一、简介在十二对水稻染色体DNA中有很多是串联重复序列，称为卫星DNA。按重复单位的长短，又可分为大卫星、中卫星、小卫星和微卫星。其中重复单位仅由2-7 mer组成的叫微卫星，又称它为简单序列重复(Simple Seqence Repeat. SSR)。不同品种的染色体卫星DNA重复单位的数目是可变的，因此，形成了极其复杂的等位基因片段长度多态性。根据这一规律...

水稻品种SSR基因型PCR-银染检测试剂盒欢迎光临fangsheke66豆丁文档水稻品种SSR基因型PCR-银染检测试剂盒使用说明书一、简介在十二对水稻染色体DNA中有很多是串联重复序列，称为卫星DNA。按重复单位的长短，又可分为大卫星、中卫星、小卫星和微卫星。其中重复单位仅由2-7 mer组成的叫微卫星，又称它为简单序列重复(Simple Seqence Repeat. SSR)。不同品种的染色体卫星DNA重复单位的数目是可变的，因此，形成了极其复杂的等位基因片段长度多态性。根据这一规律，应用SSR基因分型技术就可将不同品种进行区别，并可进行品种间的遗传学分析，从而进行水稻品种的真实性、不同品种的基因分型和品种间的亲缘鉴定。本试剂盒是从众多的水稻SSR基因座中筛选出七个基因座，组成两组复合扩增体系，对100多个主要水稻品进行分型鉴定。此方法简单、快速，可在一天之内得到准确的鉴定结果。二、试剂盒组成(可检测50份样品) 1. 5×反应混合物 0.82ml×1支 (4-8?保存) 2. DNA提取液 (室温保存) A液 1.6ml×4支 B液 1.6ml×14 3. HS-Taq (5U/μl) 50μl×1支 (-20?保存) 4. 11×上样缓冲液 600μl×1支 (室温保存) 5. 10×引物混合物 (4-8?保存) A组:RM286，RM324，OSR17 110μl×1支 B组:RM55，RM152，RM72，RM227 110μl×1支 6( Ladder (室温保存) A组:RM286，RM324，OSR17 200μl×1支 B组:RM55，RM152，RM72，RM227 200μl×1支 7. 阳性模板 100μl×1支 (4?保存) 三、DNA的提取 1. 取水稻种子一粒，去皮后用纸包好，用硬物击碎(越碎越好)，然后装入0.5mL离心管中。 2. 加入DNA提取液A 100ul，充分混匀后，室温放置30min 以上(最好过夜)。 3. 加入等体积的DNA提取液B，充分混匀后，再加入100ul氯仿，混匀，后，12000rpm离心 5min。 4. 将上清全部转到另一0.5ml的离心管中，加入2.5倍的无水乙醇，混匀后，12000rpm离心5min。 5. 弃掉上清，加入75%乙醇500ul悬浮沉淀物，再用12000rpm离心5min。 6. 弃掉上清，加入50ul TE(或 H2O) 溶解沉淀物，然后打开管盖用85?保温5min去掉残留的乙醇，再用12000rpm离心5min，上清液为提取的DNA。四、PCR扩增: 取一支离心管，加(反应管数 + 1)×,(HS-Taq 0.2μl + 5×反应混合物 4μ1 + 10×引物混合物 2μ1 + 超纯水11.8μl),，混匀后，每个反应管分装18μl，然后每个反应管再分别加提取的DNA 2μl和一滴石蜡油(若模板DNA浓度太低,可适当增加其体积, 但同时要减少超纯水体积,以保持总反应体积为20μl),稍离心后按下列条件进行扩增: 94?预变性5分钟，然后94?变性1分钟，57?退火1分钟;72?延伸1分钟，循环30 次。最后72?保温20分钟。五、电泳:电泳及银染操作见附表 1。六、结果分析: 附表一、聚丙烯酰胺凝胶核酸电泳及银染试剂盒使用说明书【电泳槽型号】本公司生产的STR-PCR银染专用电泳槽【试剂盒组成】可配制10块7%的胶,18×15×0.1cm, ,1, 42% PAG 60ml ,2, 5×TBE 120ml×2 ,3, 10% AP 1瓶 ,4, TEMED 1瓶 ,5, AgNO 1支,2克, ,6, 上样缓冲液 1支 3 ,7, 粘胶剂 1支,3μl, 【自备试剂】 (1) 固定液:0.5%乙酸-10%乙醇 ,2, 0.75M NaOH (3)甲醛 ,4, 粘胶剂稀释液:95%乙醇-0.5%乙酸【操作步骤】 1.玻璃板的反硅化处理:用95%乙醇-0.5%乙酸溶液将粘胶剂稀释2000倍～然后用脱脂棉将其涂在干净的玻璃板上～室温下风于后便可用于制胶。特别应注意的是:稀释的粘胶剂以刚好涂湿玻璃板为宜～更不宜留下水珠～否则过量的粘胶剂也可同时把胶粘到另一块玻璃板上～电泳结束后取胶时容易将胶拉坏～影响对电泳结果的观察。 2.将两个边条分别放在两块玻璃之间的两边～玻璃和边条均在下缘对齐～各用两个长尾夹将边条固定在玻璃板之间～夹子的着力点正好在边条之上.以防玻璃变形～然后将长玻璃朝下～并水平放在一个支架上～准备灌胶。 3.加3滴TEMED及6滴10%AP到装有7%PAG小烧杯中,临用前取5 ml 42%PAG、3ml 5×TBE和ddH2O 22ml,～边加边摇,不能太用力～以免产生气泡,～混匀后灌入夹层玻璃中～并尽快放好梳子。梳子插入胶中0.5cm 左右即可。 4.待胶凝固一小时后～先松开四个长尾夹～并在短玻璃上缘两边各放一条塑料泡沫以填充短玻璃板比长玻璃板短的那一部分～然后用四个长尾夹将它们固定在电泳槽上,短玻璃朝内～长玻璃朝外,。然后用300V预电泳20分钟。 5.上样前慢慢取下梳子～并用电泳液冲洗电泳道。取4μl 6×上样缓冲液到20μl扩增产物中～充分混匀后～每道上样3μl,每种Ladder也各上3μl。打开Ladder管后～可一直放在电泳仪旁边～不需放回低温保存～更不要与其它STR试剂同放在一处～否则容易造成污染。 6. 上样后600V电泳1小时左右～即蓝色指示剂跑到胶的下缘时～即可银染色。 7.取下带胶的玻璃板到固定液中摇10分钟～倒掉固定液～用ddH2O漂洗两遍～再加染色液,用前将2克AgNO3 溶于1000ml ddH2O中～放室温避光保存备用,摇15分钟后～在10秒内用ddH2O漂洗一遍～再用0.75M 的 NaOH漂洗一遍～然后立即加显色液,在100 ml0.75M 的NaOH 中加入甲醛800μl～现配现用,摇至核酸带清楚为止,约15分钟左右,。倒掉显色液～用自来水充分漂洗后晾干～并观察结果。 8.玻璃板上胶的去除:带胶的玻璃板若需将胶去除后再用～可将胶浸入水中～并用洗餐具的钢丝球直接擦洗去除～或者将带胶的玻璃板浸在用过的显色液中过夜或更长时间～胶就会自行从玻璃板上脱落下来。【注意事项】 1.放梳子时在胶面和梳子之间一定不能有气泡。 2.电泳缓冲液可反复使用2-3次。 3.电泳及染色的所有器具和溶液严禁与自来水接触。

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