葡聚糖凝胶层析法分离纯化纤维素酶的研究

葡聚糖凝胶层析法分离纯化纤维素酶的研究 () 西 北 师 范 大 学 学 报 自然科学版第 34 卷 1998 年第 4 期 ( )70 Journal of Nort hwest Normal U niversity Nat ural Science Vol134 1998 No14 3 葡聚糖凝胶层析法分离纯化纤维素酶的研究 3333 曾家豫 冯克宽王渭霞张振霞 () 西北师范大学生物系 兰州 730070 第一作者简介 曾家豫 , 男 , 34 岁. 西北师范大学生物系讲师. 主要研究方向为生物化学及分子生 物学. 中图法分类号 Q 936 ( ) 摘 要 用绿色木霉 T richoder m a v i ri de高产变异菌株 4131 产生的纤维素酶粗酶分别过 sep hadex G225 、sep hadex G250 、sep hadex G275 、sep hadex G2100 和 sep hadex G2150 柱层析. 结果表明 : sep hadex G275 对纤维素酶的分离效果最佳 , 并获得了一个 CMC 酶组份 , 其比活力提高到原来的 419 倍 , 回收 率为 4116 %. 关键词 葡聚糖凝胶 分离纯化 纤维素酶 近年来 , 纤维素酶已被广泛地应用于食品 、饲料 、医药和纺织等领域中 , 取得了一定的经济效益. 纤维素酶的分离纯化及其性质研究逐渐引起了人们的关注. 笔者在本文中报道利 用葡聚糖凝胶分离纤维素酶的研究结果. 1 材料和方法 111 材料 〔1 〕( ) 11111 粗酶液 将经过 3 000 r/ min 离心的绿色木霉 T richode r m a v i ri de4131发酵液 ( ) 上清液 , 加入 20 %饱和度 N HSO盐析 , 充分沉淀后 , 3 000 r/ min 离心 , 取上清液加入 4 2 4 ( ) 6 %饱和度 N HSO盐析 , 3 000 r/ min 离心 , 所得沉淀经透析 、冷冻 、干燥 , 得粗酶粉. 4 2 4 用时 , 加入 p H 610 的 011 mol/ L 柠檬酸2柠檬酸钠缓冲液至原发酵液体积 , 3 000 r/ min 离 心 , 即得粗酶液. 11112 sep hadex G225 、sep hadex G250 、sep hadex G275 、sep hadex G2100 、 层 析 用 凝 胶 sep hadex G2150 均为华美生物工程公司产品. 11113 仪器 层析用仪器为瑞典 L KB 2137 型柱层析系统. 112 方法 11211 分离纯化 粗酶液用 p H 610 的 011 mol/ L 柠檬酸2柠檬酸钠缓冲液透析 24 h , 然后上 L KB 2137 型柱层析系统. 凝胶柱 216 cm ×120 cm , 洗脱液为 p H 610 的 011 mol/ L 柠檬酸2柠檬酸钠缓冲液 , 洗脱速度为 12 mL / h , 每管收集量为 214 mL , 核酸/ 蛋白检测仪检测 280 nm 处光吸收. 11212 纤维素酶活性测定 见文献 2 . 〔3 〕 11213 可溶性蛋白测定 据 Folin2酚法测定. 3 甘肃省教委科研资助课题 33 西北师范大学生物系九六届毕业生 收稿日期 : 1998203225 修改稿收到日期 : 1998206205 1998 年第 4 期曾家豫等 : 葡聚糖凝胶层析法分离纯化纤维素酶的研究 71 The isolate and p urificatio n of cellulase by chro matograp hy column of dext ran gel 1998 No14 2 结果 取粗酶液各 2 mL , 分别上 sep hadex G225 、sep hadex G250 、sep hadex G275 、sep hadex G2 100 、sep hadex G2150 凝胶柱层析 , 结果如图 1 所示. 图 1 葡聚糖凝胶层析图谱 结果表明 , 5 种葡聚糖凝胶 中 , sep hadex G275 能将纤维素 酶粗酶分离为 4 个较清晰的蛋白 ( ( ) ) 峰 图 1 a. 测酶活 , 4 个蛋 白峰中 , 峰 ?具有明显的 CMC () 酶活 图 2 . 其余 4 种凝胶对 纤 维 素 酶 的 分 离 效 果 均 较 sep hadex G275 差. 因 此 , 笔 者 选择 sep hadex G275 分离纤维素 酶 , 分离结果见表 1 . 图 2 sep hadex G275 图谱 表 1 sep ha de x G275 纯化纤维素酶结果 - 1 纯化倍数 总酶活/ u总蛋白/ mg回收率/ %比活力/ u?mg 粗酶液466 0128 110 1 675 10010 sep hadex G275 194 1136 419 142 4116 3 讨论 ) 15 种葡聚糖凝胶中 , sep hadex G275 对纤维素酶分离效果最佳. 通过 sep hadex G275 柱层 析 , 笔者获得了纤维素酶的 CMC 酶组分 , 其比活力提高到原来的 419 倍 , 回收率为 4116 %. ) ( ) 2葡聚糖凝胶柱层析获得的 CMC 酶组分 , 还可通过其它方法 如离子交换层析等 进一步分离纯化 , 得到纯度更高的纤维素酶组分. 〔4 〕) ( 3纤维素酶主要有 3 类. 笔者通过 sep hadex G275 柱层析获得了 CMC 酶 内切β) 21 ,42葡聚糖苷酶组分. 葡聚糖凝胶对于纤维素酶其余组分的分离效果尚待进一步研究. () 西 北 师 范 大 学 学 报 自然科学版第 34 卷 ( )72 Journal of Nort hwest Normal U niversity Nat ural Science Vol134 参 考 文 献 () ( ) 1 冯克宽. 产纤维素的木霉高产变异菌株 4131 的选育. 西北师范大学学报 自然科学版, 1989 , 1: 58 ,62 2 〔德〕施特尔 ?马赫 B 著. 酶的测定方法. 钱嘉渊译. 北京 : 中国轻工业出版社 , 1992 . 102,1073 Lowry O H. Protein measurement wit h t he Folin p henol reagent . J B iol Chem , 1951 , 193 : 265 4 吴东儒主编. 糖类的生物化学 . 北京 : 高等教育出版社 , 1987 . 348 The isolate and p urificatio n of cellulase by chro matograp hy column of dext ran gel Zeng J iayu Feng Kekuan Wang Weixia Zhang Zhenxia ()Depart ment of Biology , Nort hwest Normal U niversity 730070 L anzhou PRC Abstract A cellulase f ro m T richode r m a v i ri devariet y st rain 4131 was p urified by chro maograp hy column of sep hadex G225 、sep hadex G250 、sep hadex G275 、sep hadex G2100 and sep hadex G2150 . Analysis showed t hat t he p urified p roteinase was CMC , and w hen it was p urified by sep hadex G275 , t he effect was t he best . The specific activit y of CMC was increased by 3192fold wit h an activit y recovery of 4116 %. Key words dext ran gel p urificatio n cellulase () 责任编辑王峰 我国选定的作为法定单位的非 SI 的单位 量的名称单位名称单位符号换算关系和说明 分min 1 min = 60 s 〔小〕时 时间h 1 h = 60 min = 3 600 s )(日 , 天 d 1 d = 24 h = 86 400 s 〔角〕秒 π() ″= / 648 000rad 1 ″〔角〕分 ′ π() 1′= 60″= / 10 800rad 〔平面〕角度 转? π() 1?= 60′= / 180rad 每分 - 1r/ min () 1 r/ min = 1/ 60s 旋转速度 海里长度 ) (n mile 1 n mile = 1 852 m 只用于航程吨 原子质量3 t 1 t = 10kg 单位 升 质量- 27 u 1 u?11660 540 ×10 kg电子伏 分 3 - 3 3() L , l1 L = 1 dm= 10 m 贝 特〔克体积- 19 eV dB 能 级 1 eV?11602 177 ×10 J斯〕 公顷 差 线tex 节2密度 - 6 hm 1 tex = 10 kg/ m = 1 g/ km 面积 2 2kn 1 hm= 10 000 m 速度 ) () (1 kn = 1 n mile/ h = 1 852/ 3 600m/ s只用于航行