微小毛霉凝乳酶的分泌表达、产物纯化及鉴定

微小毛霉凝乳酶的分泌表达、产物纯化及鉴定 微小毛霉凝乳酶的分泌表达、产物纯化及鉴 定 吉林农业大学2011,33(4):395,398,417 JournalofJilinAgriculturalUniversity E—mail:flndxb@.sina.com 微小毛霉凝乳酶的分泌表达,产物纯化及鉴定 王景会一,李玉秋,郑丽,李倬琳,高岩,杨贞耐 1.吉林省农业科学院农产品加工研究中心,长春130033;2.吉林农业大学食品科学与工程学 院,长春130118;3.吉林大学农业与生物工程学院,长春130024 摘要:采用基因工程的方法对微小毛霉(Mucorpusillus)凝乳酶进行分子改造,获得适于乳品工业生产用的 凝乳酶,克隆到了微小毛霉凝乳酶基因,构建了酵母表达质粒pPIC9K/M.线性化后电击转入毕赤酵母GSI15, 在甲醇诱导下进行凝乳酶的初步发酵试验,通过pH反应及酶抑制反应试验证明,重组凝乳酶获得了分泌表 达.SDS—PAGE分析表明重组凝乳酶的分子量约为46kD,与理论值(45.3kD)基本相符,培养基上清液中凝 乳酶的活性为311.8U/mL,纯化的总回收率为51.89%,纯度达到92%. 关键词:凝乳酶;分泌表达;毕赤酵母 中图分类号:TS201.3文献标识码:A文章编 号:1000—5684(2011)04—0395—04 DOI:CNKI:22一ll00/S.20110511.1646.001 网络出版地 址: 引文格式:王景会,李玉秋,郑丽,等.微小毛霉凝乳酶的分泌表达,产物 纯化及鉴定[J].吉林农业大学, 2011,33(4):395—398,417. SecretoryExpression,PurificationandIdentificationofRennetfromMu- corpusillus WANGJinghui’,,LIYu—qiu’,ZHENGLi.,LIZhuo—lin’,GAOYan,YANGZhen—nai’ 1.ResearchCenterofAgro—ProductProcessing,JilinAcademyofAgricultu ralSciences,Changchun 130033,China;2.CollegeofFoodScienceandEngineering,JilinAgriculturalUniversity,Changchun 130118,China;3.CollegeofAgricultureandBiologicalEngineering,JilinUniversity,Changchun, 130024.ina Abstract:TherennetfromMucorpusillusisoneofthemajorsourcesofmicrobialrennet,butithassome defectscomparedwiththebovinechymosin.Asparticproteinasesfromfungiareusuallymoreheatresis— tant.Whentheseenzymesareusedforcheesemaking,theresidueofenzymaticactivityafterheattreat- ment(55?)followingmilkcoagulationmaystillexistandcauseproteolysisduringcheesestorage,bitter taste,softnessandloweryieldofthecheeseproducts.Inordertodeveloparennetproductwithsuitable milkclottingproperties,thegeneofrennetwasclonedfromMucorpusillus,andtheexpressionvector DPIC9K/Mwasconstructed.TheplasmidsofpPIC9K/MwaslineafizedwithSac工,andtransformedin— toPichiapastorisGS115competentcells.TherennetwassecretoryexpressedinPichiapastorissuccess- fully,andastrongbandatabout46kDwasshownbySDS—PAGE.Activitytes tsshowedthattherennet activityintheculturesupernatantwas311.8U/mL.Thepurityofrecombinantrennetreached92%with a51.89%activityrecovery. *基金项目:国家”863” 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目(2006AA10Z306),现代农业产业技术 体系建设专项[农科教发(200714)号] 作者简介:王景会,女,博士研究生,副研究员,研究方向:食品生物技术. 收稿日期:2010.07.16网络出版时间:2011-05一l116:46 通讯作者 396吉林农业大学2011年8月 Keywords:rennet;secretoryexpression;Pichiapastoris 凝乳酶(EC3.4.23.4)是一种酸性蛋白酶,在 食品,纺织,医药等行业都有广泛的应用,尤其是 干酪生产过程中的必需酶,产量约占全世界酶制 剂总量的15%,为第二大酶制剂L1J.我国目前干 酪生产所用凝乳酶主要依赖进口,凝乳酶匮缺已 成为制约我国干酪生产的重要因素.凝乳酶来源 较为广泛,可以从多种动物,植物,微生物中得 到_2J.微生物凝乳酶主要存在于微小毛霉(Mucor pusillus)和米黑毛霉(MucorMiehei)等接合真菌中, 具有牛奶促凝活力高,价格低廉等优点,但也存在 蛋白水解能力较强,热稳定性高等缺陷[3-5],这导 致成品干酪出现苦味,甚至出现质地松软,产率低 等问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 .自20世纪90年代以来,国外研究者开 始对真菌凝乳酶的分子三维结构等进行了研 究[6-8],证明了通过分子改造的方法,可以大幅降 低酶的蛋白水解能力及热稳定性等,使其更适合 于干酪生产.本研究采用毕赤酵母表达系统获得 了重组微小毛霉凝乳酶,为采用基因工程的方法 进行分子改造,获得适于干酪加工用的凝乳酶奠 定了基础. 1材料与方法 1.1菌株和质粒 微小毛霉(Mucorpusillus)菌株AS3.3445购 自中国普通微生物保藏管理中心.大肠杆菌 E.coliJM109,巴斯德毕赤酵母Pichiapustori GS115,表达质粒pPIC9K均由吉林省农业科学院 食品生物技术实验室保存. 1.2工具酶和试剂 内切酶,PfuTaq酶,TdDNA连接酶,dNTP mixture和DNA片段回收纯化试剂盒购自MBI公 司,pMD18.T载体购自联星生物公司,抗生素 G418购自浩然生物技术有限公司,DNAMarker DL2000,DL15000及蛋白分子量标准购自天根生 化科技有限公司,DEAE一52和SephadexG一75购 自Sigma公司,其他试剂均为国产分析纯.PCR 引物合成及序列测定由上海生工公司完成. 1.3培养基 LLB,YPD,MD,MM,BMGY,BMMY培养基的 组成和配制参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手 册. 1.4微小毛霉凝乳酶基因的克隆 参照文献[9],取微小毛霉基因组DNA作为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 .根据GenBank上已公布的微小毛霉凝乳酶 基因序列(NM—X06219)设计引物,进行PCR扩 增,引物中设计合适的酶切位点:上游引物QMA— GAF5.GCCGAATrCATGCTCTYCTYCAAC.3,下游 引物QMAGAR5一ACTGCGGCCGC1TrAGTTGTrC TCGTAT.3,下划线部分分别为EcoRI和Not工的 酶切位点. 将扩增的凝乳酶基因片段连接到pMD18.T 载体上,将酶切及测序证实正确的质粒命名为 pMD18-T/M. 1.5酵母表达载体pPIC9K/M的构建 将表达载体pPIC9K及pMD18一T/M分别用 EcoRI,NotI双酶切后连接,转化大肠杆菌 JM109,提取质粒后进行酶切鉴定,重组表达载体 命名为pPIC9K/M. 1.6电转化毕赤酵母GS115及高拷贝转化子的 筛选 用Sac工酶切重组质粒pPIC9K/M使其线性 化.通过电击法将线性化的质粒转化到毕赤酵母 GS115中,涂布于MD平板上,然后将在MD平板 上生长的转化子分别点接在含0.25,0.50,1.00, 2.00mg/mLG418的YPD平板上,30?培养7d, 可筛选出耐受G418的高拷贝转化子.本试验获 得24个重组阳性克隆和2个高拷贝菌株. 1.7重组酵母的诱导表达 将筛选得到的重组酵母GS115/pPIC9KM接 种于BMGY培养基中,3O?,280r/min培养l6, 18h,至OD600达到1.0,2.0.离心收集菌体,用 诱导培养基BMMY重悬菌体,使OD6oo约为1.0, 于30oC,280r/min进行诱导表达.每24h向培 养基中添加100%甲醇至终浓度为1.0%,同时取 样检测菌液0D鲫,菌液上清凝乳酶活力及进行 SDS—PAGE分析,确定最佳的诱导表达时间... 1.8重组凝乳酶的分离纯化 甲醇诱导表达的酵母培养液离心后取上清, 经80%饱和度硫酸铵沉淀过夜后离心,沉淀溶于 磷酸钠缓冲液中即为粗酶液,同时SephadexG一 75柱用磷酸钠缓冲液平衡后,取粗酶液上柱,用 同样的缓冲液洗脱(12mL/h),收集合并洗脱峰, JournalofJilinAgriculturalUniversity2011,August 王景会等:微小毛霉凝乳酶的分泌表达,产物纯化及鉴定397 继续采用离子交换柱DEAE一52分离纯化蛋白, 以含有不同浓度NaCI(0.1,0.2,0.3,0.5mol/L)的 磷酸钠缓冲液(pH5.8)进行梯度洗脱,收集活性 峰,真空冷冻干燥浓缩后溶于磷酸缓冲液中. 1.9重组凝乳酶蛋白活性检测 将40min凝结1mL10%脱脂乳的酶量定义 为一个Soxhlet单位(U)u. 凝乳酶活力=(试验用乳量/凝乳酶量)X (40/t),t为凝乳时间(s). 2结果与分析 2.1微小毛霉凝乳酶基因的克隆 以微小毛霉凝乳酶基因组为模板,QMAGAF 和QMAGAR为引物进行扩增,得到与理论值 (1283bp)大小基本一致的凝乳酶基因片段(图 1).将目的基因连接到克隆载体pMD18一T上,测 序结果与X06219核苷酸序列比对,同源性达到 98%以上,说明克隆得到的序列是凝乳酶基因. 可继续进行以下的表达载体构建,诱导表达等试 验. 20kb 10kb 750bp 500bp 250bp M.DL2000DNAMarker;1.凝乳酶基因扩增产物PCRproduct oftheMucorrenningene 图1目的基因的PCR扩增 Fig.1.PCRproductoftherennetgenefr0mMucor pusillus 2.2重组表达载体的鉴定 对表达载体pPIC9K/M进行PCR及0RI, NotI的双酶切鉴定,分别获得了1283bp的目的 片段(图1),及9300bp的表达载体和1283bp的 目的基因(图2),其大小与预期值一致. 2.3重组蛋白的诱导表达 重组毕赤酵母GS115/pPIC9KM的生长曲线 及活力曲线见图3.重组毕赤酵母GS115/ pPIC9KM在24h内进入对数生长期,48h以后进 吉林农业大学JournalofJilinAgriculturalUniversity 人稳定生长期,菌液OD600约为3.0.产酶曲线滞 后于生长曲线,在96h后,产酶有明显上升的趋 势,192h酶活达到最高,为311.8U/mL. l2M l50kb 50kb 25kb 10kb M.DLI5000DNAMarker;1.重组表达载体pPIC9K/M中凝乳 酶基因的PCR扩增PCRproductofMucorrenningenefrom pPIC9K/Mrecombinantplasmid;2.重组质粒的双酶切鉴定Di— gestionproductofrecombinantplasmid 图2表达载体pPIC9K/M的PCR和双酶切鉴定 Fig.2.IdentificationofrecombinantplasmidpPIC9/M byPCRanddigestedwithEcoRIandNotI 3.O 2.6 量 82.2 1.8 1.4 200 1oo 0 6 喜 髓皇 t,h -- g--OD6oo;+酶活Enzymeactivity 图3重组毕赤酵母GS115/pPIC9KM的生长曲线及 活力曲线 Fig.3.Gro~handactivitycurvesoftherecombinant GS115/pPIC9KM 2.4重组凝乳酶的分离纯化及SDS—PAGE分 析 分离纯化结果见表1,以1L的发酵液开始, 重组凝乳酶从发酵液到最后纯化产物,酶的比活 力由最初的855.34U/mg到纯化后的 1707.84U/mg,提高了近2倍,回收率为 51.89%,共得到纯化产物12.36mg.凝胶扫描结 果表明经过3步纯化后的蛋白质纯度达到92%, 取发酵液上清及不同阶段的纯化产物行SDS— PAGE电泳,结果见图4(2个箭头标记). 398吉林农业大学2011年8月 表1重组凝乳酶的纯化 Table1.PurificationofrecombinantMucorrennin 1160kD 662kD 45.0kD 350kD M.蛋白markProteinmarker;1.租酶掖Supernatantofcrudeen— zymeextract;2.80%硫酸铵沉淀Precipitateof80%ammonium sulfatefraetionation;3.葡聚糖G一75层析Activitycomponentin SephadexG一75chromalography;4.离子交换DEAE一52层析 ActivitycomponentinDEAE一52chromalography 图4重组微小毛霉凝乳酶纯化结果的SDS—PAGE 分析 Fig.4.SDS—PAGEanalysisoftherecombinantMu- corpusNusrennetpurification 2.5重组凝乳酶的酶学反应鉴定 2.5.1pH反应试验在碱性条件下,凝乳酶蛋 白会由于构象变化造成活性迅速消失_l,将重组 微小毛霉蛋白溶液调pH值至10.0,反应30min 后,凝乳活性全部丧失(图5). 2.5.2酶抑制反应试验微小毛霉属于天冬氨 酸蛋白酶,胃蛋白酶抑制剂PepstatinA可以专一 地抑制此类蛋白酶的活性l.在重组微小毛霉 凝乳酶蛋白溶液中加入PepstatinA至终浓度为 5mmol/L,反应20min后,凝乳活性完全丧失(图 5). 重组凝乳酶的酶抑制剂反应结果表明(图 5),商品凝乳酶和重组凝乳酶出现明显凝乳反 应.重组凝乳酶经过碱及蛋白酶抑制剂处理后其 生物活性消失,均未出现凝乳反应.这充分证明 了上清液的活性来源于重组微小毛霉凝乳酶. 1.pH对于重组凝乳酶的影响EffectofpHontheactivityofre. combinantrennet;2.抑制剂对于重组凝乳酶的影响Effectof inhibitorontheactivityofrecombinantrennet;3.乳中加入商品 凝乳酶Commercialchymosin;4.乳中加入重组凝乳酶Recom. binantrennet 图5重组凝乳酶活性检测 Fig.5.Milk?clottingtestofrecombinantrennet 3讨论 毕赤酵母表达系统已成为较完善的外源基因 表达系统l1J,具有易于高密度发酵,表达基因 在宿主基因组中稳定整合,能使产物有效分泌并 适当糖基化,培养方便,经济等特点.目前国内外 已有数百种外源蛋白基因在毕赤酵母中表达,证 实该系统高效,实用,简便,能提高表达量并保持 产物生物学活性的外源基因表达系统,而且非常 适宜扩大工业规模.毕赤酵母表达系统在生物工 程领域将发挥越来越重要的作用. 本研究成功构建了食品级的微小毛霉凝乳酶 毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K/M,在毕赤酵 母上清液中表达有活性的重组微小毛霉凝乳酶, 活性达到311.8U/mL,表达量为182mg/L.较大 肠杆菌【J的20mg/L及酿酒酵母【J的150mg/L 表达量都有较大幅度提高.本研究初步获得了重 组凝乳酶,重组菌的诱导发酵条件及凝乳酶的分 子改造都将有待于进一步研究.(下转第417页) JournalofJilinAgriculturalUniversity2011,August [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] 孙海等:不同肥料对栽参土壤中Cr,cu,Pb和zn全量及有效态的影响417 na,2008,7(10):1245-1252. 陈怀满.土壤中化学物质的行为与环境质量[M].北京: 科学出版社,2002:79134. 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