西藏牦牛大肠埃希氏菌生物学特性的研究

西藏牦牛大肠埃希氏菌生物学特性的研究 西藏牦牛大肠埃希氏菌生物学特性的研究 畜牧兽医《西藏科技))2009年11期(总第200期) 西藏牦牛大肠埃希氏茵生物学特性的研究 鲁志平曾群辉 (西藏大学农牧学院动物科学技术学院,西藏林芝860000) 摘要:作者对牦牛大肠埃希氏菌进行培养特性,形态染色,鞭毛检查,血凝性,生化试验,血清型鉴定, 抗原性,致病性等生物学特性研究,同时用大肠埃希氏菌标准菌种C83907作对照试验.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,牦 牛大肠埃希氏菌培养后,在普通琼脂平板上形成光滑型和粗糙型两种类型的茵落;在5%绵羊鲜血琼脂 平板上无溶血现象;形态染色为G一杆菌;具有运动性;对家兔红细胞表现出强凝集,而对牦牛,绵羊, 马,鸡,猪,鸭的红细胞不凝集;能发酵大多数糖类;其O抗原血清型为026,O142,0148和O158混合 型;用牦牛大肠埃希氏菌油乳剂疫苗两次免疫家兔14d后检测抗体效价,抗体效价?28;将牦牛大肠埃 希氏菌的培养物,肌肉注射家兔具有致病性. 关键词:西藏牦牛大肠埃希氏菌生物学特性研究 中图分类号:$823.85 牦牛是西藏畜牧业发展的主要畜种之一,是西藏 牧民衣食住行的主要来源.牦牛大肠埃希氏菌病威胁 着牦牛的健康,制约着西藏畜牧业经济的健康,快速发 展.大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)简称大肠杆菌,是 肠杆菌属细菌的模式种.根据0抗原,K抗原,H抗 原的不同,可将本菌分成不同的血清型. 牦牛大肠埃希氏菌主要能引起牦牛高热,寒颤,精 神不振,食欲废绝,呼吸困难,喘气,呻吟,腹泻,病程较 长的牦牛可见神经症状,首先表现为不安,兴奋,后来 沉郁,昏迷,最后死亡.其中患病牦牛最典型的特征是 下痢,部分有水样粪便,有的为带泡沫的血色粪便.尤 其因犊白痢死亡的犊牛约占牦牛死亡数的67.5%,是 影响犊牛成活率的重要疾病.本试验对西藏地区牦牛 致病性大肠埃希氏菌(西藏一9903)的某些生物学特 性进行了探讨,同时用大肠埃希氏菌标准菌种 (C83907)作对照试验,目的揭示在西藏高原这样一个 特殊的地理,气候环境,在长期的缺氧,高寒,强紫外线 等高原环境条件下西藏一9903与C83907在生物学特 性上存在的异同,确定西藏地区牦牛致病性大肠埃希 氏菌病的病原及其毒力特点,揭示牦牛大肠埃希氏菌 病的致病机制,为本病的监测,预防和控制提供科学依 据,它将具有重要的社会效益和经济效益. l材料 1.1菌株 从西藏那曲自然病死成年牦牛体内分离得到的致 病性大肠埃希氏菌(西藏一9903),暂由西藏大学农牧 学院西藏动物疫病研究中心保管;大肠埃希氏菌标准 54 菌种(C83907)从中国兽医药品监察所提供. 1.2标准大肠杆菌0多价血清,单因子血清均由中 国兽医药品监察所提供 1.3试验动物 试验家兔购自西藏农牧学院牧医系教学实习牧 场.1.8,2.1Kg的健康家兔19只. 1.4主要试剂 琼脂粉,蛋白胨,L一赖氨酸,葡萄糖,蔗糖,麦芽 糖,树胶醛糖,木糖,果糖,甘露醇,半乳糖,肌醇,乳糖, 蕈糖,山梨醇,氯化钠,磷酸氢二钠,磷酸氢二钾,西蒙 氏柠檬酸钠,三糖铁琼脂,ss琼脂,脲琼脂,麦康凯琼 脂,伊红美兰琼脂等. 1.5主要仪器 净化工作台,手提式高压蒸汽灭菌锅,隔水式电热 恒温培养箱,空气浴培养箱,电子天平,微波炉,显微 镜,干燥箱,旋涡混合器,离心机,试管,烧杯,三角 瓶等. 1.6培养基的制备 1.6.1牦牛肉水.将牦牛后腿肉除去脂肪,筋膜,切 成小块,在绞肉机中绞碎,称重并按碎肉500g,蒸馏水 1000mL的比例混合搅拌均匀,4?浸泡过夜.次日取 出煮沸30min,再用4层纱布过滤出肉渣,置4?沉淀 过夜,取出上清液经滤纸过滤,滤液即为牦牛肉水.将 其分装后经116?灭菌30min,4?贮存备用. 1.6.22%蛋白胨牦牛肉汤.按蛋白胨20g,氯化钠 5g,牦牛肉汤1000mL的比例加入3000mL的大烧杯 中,加热溶解,调整pH为7.4,7.6,并继续煮沸 《西藏科技))2009年11期(总第200期)畜牧兽医 10min,补足失去水分,滤纸过滤后分装,经116'12灭菌 30rain,作无菌检验和4?贮存备用. 1.6.3普通琼脂培养基.在制备2%蛋白胨牦牛肉 汤的基础上加入1.5%的琼脂,其它 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 同1.6.2,分 装试管.灭菌后倒琼脂平板;试管装的琼脂摆成试管 斜面,待凝固后,置37?培养24h做无菌检验. 1.6.4鲜血琼脂培养基.将1.6.3制备好的普通琼 脂培养基冷却至50~C左右,加入5%无菌脱纤绵羊鲜 血,制成鲜血琼脂平板,待凝固后,置37?培养24h做 无菌检验. 1.6.5其它培养基.麦康凯琼脂培养基,sS琼脂培 养基,伊红美兰琼脂培养基按其 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 进行配置.生 化反应培养基等均按房海介绍的方法制备. 2方法 2.1培养特性 取牦牛大肠埃希氏菌(西藏一9903)真空冷冻干 燥菌株和大肠埃希氏菌标准菌种(C83907)各1支,用 灭菌1mL注射器吸取0.6mL2%蛋白胨牦牛肉汤将西 藏一9903与C83907融化,分别在2%蛋白胨牦牛肉汤 中接种0.3mL,置37cI=培养18h.分别取西藏一9903 与C83907液体培养物各划线2副普通琼脂平板,置 37~C培养20h.分别在2副琼脂平板上用肉眼选择圆 形,光滑,边缘整齐,大小适中的单个菌落各10个;置 低倍显微镜下,再进一步观察所选择的菌落是否为圆 形,光滑,隆起,边缘整齐的菌落.将选择好的西藏一 9903与C83907的菌落分别接种10支琼脂斜面和鲜 血琼脂平板上,置37~C培养20h后进行革兰氏染色镜 检,备用. 2.2形态及染色特性 分别取西藏一9903与C83907琼脂斜面纯培养物 和鲜血琼脂培养物,按常规方法做涂片,干燥,固定和 革兰氏染色液染色,光学显微镜检查. 2.3鞭毛的检查 2.3.1压滴检查法.取西藏一9903及C83907的纯 培养物,分别接种于2%蛋白胨牦牛肉汤,37%培养 10h,分别用接种环取肉汤培养物滴入洁净的载玻片中 央,取洁净的盖玻片轻轻盖在液滴上,注意避免产生气 泡,然后镜检观察. 2.3.2平板挖沟培养法.取普通琼脂平板培养基,在 无菌操作条件下,用灭菌手术刀分别在中央部位挖去 1条经过平板中心的1cm宽的琼脂条,使平板中间形 成1条小沟,与小沟相垂直放置1条4cm0.5cm的无 菌滤纸.分别在平板滤纸条的一端接种西藏一9903 及C83907纯培养物,置37'I3培养数日,每日观察培养 结果. 2.4红细胞凝集试验 按照常规方法,使用灭菌生理盐水,制备3%(V/ V)的绵羊,家兔,鸡,鸭,猪,牦牛,马红细胞悬液.取 西藏一9903与C83907琼脂斜面纯培养物,用含1%D 一 甘露糖的生理盐水分别洗下菌苔,制成适当浓度的 菌悬液,按Allan方法进行HA试验.同时用3%红细 胞悬液作阴性对照. 2.5细菌的生化试验 取西藏一9903与C83907琼脂斜面纯培养物分别 接种于麦康凯,伊红美兰,SS,葡萄糖,岩藻糖,半乳 糖,果糖,木糖,鼠李糖,麦芽糖,蕈糖,蔗糖,树胶醛糖, 乳糖,棉籽糖,三糖铁琼脂,山梨醇,甘露醇,肌醇,柠檬 酸盐,明胶,8一半乳糖苷,葡萄糖铵,紫乳培养基上; 同时分别进行硫化氢,M—R,V—P,吲哚,硝酸盐,尿 素酶,接触酶,苯丙氨酸脱氨酶,氨基酸脱羧酶,胆汁溶 解和淀粉水解试验;每项试验重复3次.每种培养基 均设有空白对照.将上述接种后的生化培养基置 37~C培养箱中培养数日,每El观察并记录生化反应 结果. 2.6血清型鉴定 取西藏一9903菌株的纯培养物,用0.5%石碳酸 生理盐水洗下,置121oC,103.42kPa的条件下作用 2h,制成高压抗原.该菌株高压抗原与标准大肠杆菌 0多价血清,单因子血清进行平板凝集试验,再进一步 用试管凝集试验确定其血清型.每次试验同时作高压 抗原,阳性和阴性血清对照试验. 2.7抗原性试验 取西藏一9903纯培养物接种于2%蛋白胨牦牛肉 汤若干瓶,37?震荡(140,160rpm/min)培养22h,加 入甲醛溶液,使培养物中甲醛溶液为4%,进行灭活 后,按4%的量加人事先灭菌好的吐温一80,称之为水 相.水相与适量矿物油佐剂混合和乳化,制备成油乳 剂灭活疫苗. 选1.8,2.1Kg的健康家兔l0只随机分2组,每 组5只.1组为试验组,2组为对照组.在第1组家兔 的左侧颈部皮下接种油乳剂灭活疫苗,每只家兔初次 接种剂量为0.5mL,第14d,在右侧颈部皮下再次接种 疫苗1mL;第2组家兔注射肉汤,剂量和方法同试验 组.家兔接种疫苗前和再次接种疫苗后第14d分别在 试验和对照家兔耳静脉采血检测抗体效价. 2.8致病性试验 取西藏一9903与C83907的纯培养物分别接种 2%蛋白胨牦牛肉汤,37cc培养18h,经检查纯粹后,分 别肌肉接种成年家兔各3只,5mL/只.以相同培养 基,剂量和方法接种成年家兔3只作为对照,接种后隔 离饲养观察.家兔死亡后及时剖检,观察病死兔病变, 并从肝,脾,肾,肺,t2,血和淋巴结中分离细菌. 3结果 3.1培养特性 西藏一9903和C83907在普通琼脂平板上均能形 成光滑型(S型)菌落和粗糙型(R型)两种类型的菌 55 畜牧兽医《西藏科技))2009年11期(总第200期) 落.西藏一9903在5%绵羊鲜血琼脂平板上无溶血现 象;C83907呈B溶血. 3.2染色特性及形态特征 西藏一9903琼脂斜面纯培养物和鲜血琼脂培养 物,镜检可见革兰氏阴性短小杆菌,菌体两端着色较 深,多单个排列,个别形成短链状排列;C83907纯培养 物镜检可见革兰氏阴性,平直,两端钝圆的小杆菌. 3.3鞭毛检查 取西藏一9903与C83907的肉汤培养物压片镜 检,有运动性.平板挖沟培养法,观察至3d后,西藏一 9903与C83907在滤纸条上和滤纸条的另一端(未接 种端)均有细菌生长,形成菌苔.分别取细菌检查为 革兰氏阴性,两端钝圆的短小杆菌和杆菌,这与接种细 菌染色镜检结果相同,说明西藏一9903与C83907均 具有运动性. 3.4红细胞凝集试验 西藏一9903与C83907对几种动物红细胞的血球 凝集试验结果见表1. 表1血球凝集试验结果 菌株兔绵羊鸡鸭牦牛猪马 西藏一9903+一一一一一一 C83907+一++一+一 阴性对照一一一一一一一 注:"+"为凝集红细胞;"一"为不凝集红细胞. 3.5生化试验 西藏一9903与C83907在伊红美兰琼脂培养基上 均形成紫黑色带金属光泽的菌落,其形态及大小均与 普通营养琼脂培养物基本一致;在SS琼脂培养基上, 培养24h后均形成少量孤立散在的湿润,扁平稍带突 起的红色菌落,连续观察至第7日结果均相同.西藏 一 9903在麦康凯琼脂培养基上,培养36h一72h可形 成少量圆整的或不规则的,扁平或突起的红或深红的 湿润菌落;C83907则24h内便形成红色菌苔.其它生 化反应结果如表2所示. 表2生化试验结果 56 注:"o"发酵糖产酸产气;"+"发酵糖产酸或试验阳性; " 一 "不发酵糖或试验阴性. 3.6血清型鉴定 西藏一9903的0抗原血清型鉴定结果见表3. 每次试验的高压抗原,阳性和阴性血清对照均正确. 表3血清型鉴定结果 菌株西藏一9903 血清型00l42,0148,0158 3.7抗原性试验 西藏一9903油乳剂灭活疫苗二次免疫家兔14d 后,测抗体效价,试验组(1组)5只家兔抗体效价? 2,对照组(2组)5只家兔的抗体效价在2.一2之间. 抗体效价测定结果见表4. 表4抗原性试验结果 组别编号免疫后抗体 《西藏科技))2009年11期(总第200期)畜牧兽医 3.8致病性试验 西藏一9903对家兔致死率为100%从死亡家兔 的肝,脾,肾,肺,心血和淋巴结中均能分离回收到与接 种时相同的细菌;C83907致病性试验结果同西藏一 9903;而阴性对照组家兔则全部健活.见表5. 表5致病性试验结果 4 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 与讨论 4.1一定条件下,光滑型菌落可变为粗糙型,这种变 异经常伴随着S型抗原的丧失和病原菌毒力由强变弱 性状的改变,也伴随着致病力的减弱.所以要选择西 藏一9903圆形,光滑,边缘整齐的S型菌落进行试验. 4.2通过革兰氏染色,光学显微镜检查,西藏一9903 与C83907均为革兰氏阴性,两端钝圆的短小杆菌和 小杆菌,但C83907要比西藏一9903在形态上稍粗而 短一些.这是由于西藏一9903已经适应青藏高原这 样一个特殊的地理,气候环境,在长期的缺氧,高寒等 高原环境条件下在形态上的改变. 4.3平板挖沟法检查鞭毛的运动性,应注意接种西藏 一 9903菌株与标准菌种C83907的量相同,接种的部 位也应一致,尽量做到相同的试验条件,结果西藏一 9903比C83907提前到达滤纸的另一端,这是由于在 制备培养基时,选用的西藏牦牛肉制备肉汤及普通琼 脂培养基,这更加接近西藏一9903的营养要求. 4.4在血球凝集试验中,每换一个供试菌株,每换一 种红细胞悬液,均需换一支滴管,从而保证试验的准确 性;感作时间一般为60rain,但有时需延长时间,也有 时可提前观察判定,重要的是以出现明显凝集相作为 指标,本次试验在40min左右出现明显的凝集相. 4.5细菌分解糖的能力与该菌含有分解某种糖的酶 密切相关,是受遗传基因所决定的,大肠杆菌的乳糖及 其他一些糖的操纵子转录需要一定浓度的腺苷一35 一 环化一磷酸(cAMP),而葡萄糖的存在,可以降低细 胞内cAMP浓度,从而阻碍了乳糖(或其他糖)操纵子 的转录启动,结果导致了与乳糖(或其他糖)的利用有 关的酶不能合成或合成很少.总体来说,在接种细菌 量均相同的前提下,糖发酵试验,西藏一9903对糖类 的发酵速度要比C83907对糖类的发酵速度迟缓,这 说明西藏一9903在分解糖过程中细胞内cAMP浓度 要低于C83907,导致了与乳糖(或其他糖)的利用有关 的酶的合成数量低于C83907. 4.6本试验用平板凝集试验和试管凝集试验,确定了 西藏一9903菌株的血清型为O26,O,O,Ol58.该 法的优点是特异性强,敏感性高,方法简便,设备简单 4.7经抗原性试验,西藏一9903油乳剂灭活疫苗免 疫家兔后,血清抗体效价>12,家兔具有良好的免疫保 护性. 4.8致病性试验结果表明,西藏一9903与C83907都 具有致病力.由于牦牛生产环境复杂,不易清洁消毒, 因此,在生产实践中应采用综合性疾病防制措施.保汪 牦牛生产的健康发展. 参考文献 [1]房海.大肠埃希氏菌[M].石家庄:河北科学技 术出版社,1997,91 (2]曾群辉,查果,旦巴次仁,等.牦牛致病性大肠 埃希氏菌病的诊断[J].中国预防兽医,2001,23 (2):144,145 [3]廖娟,王红宁,黄勇,等.牦牛致病性大肠杆菌 的分离鉴定及药敏试验[J].畜牧与兽医,2006,38 (8):49,5O [4]曾群辉,朱国玉,索朗斯珠,等.牦牛大肠埃希 氏菌病灭活疫苗的制备[J].中国兽药杂志,2007,41 (9):24—26 [5]姚火春.兽医微生物学实验指导[M].北京:中 国农业出版社,2002,21 [6]AllanBJ.Characterizati0nofEscherichiacoliisola. tedfromcaseofaviancolibacillosis[J].CanJVetRes, 1993,57:146,151 [7]甘肃农业大学.兽医微生物学实验指导[M], 北京:农业出版社,1980,44 [8]曾群辉,索朗斯珠,查果,等.西藏牦牛ETEC的 血清学试验与疫病治疗[J].中国草食动物,2001,3(5 — 1):46,50 (9]普旺堆,曾群辉,旦巴次仁,等.牦牛ETEC灭活 疫苗安全性与免疫效力试验[J].中国兽药杂志, 2008,42(8):5,8 [10]曾群辉,旦巴次仁,查果,等.西藏那曲地区牦 牛"疑难病"的疫情调查[J].中国草食动物,2001,3 (5—1):72,74 编校陈庆芝 57