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一、小麦基因组DNA提取.doc

一、小麦基因组DNA提取

日理万鸡千金
2017-12-08 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《一、小麦基因组DNA提取doc》,可适用于综合领域

一、小麦基因组DNA提取一、小麦基因组DNA提取:、用单籽粒粉碎机磨碎~粒小麦干种子放入ml离心管中加μlSDS提取液水浴min期间间歇震荡。、rpmmin吸取μl上清液加入等体积(μl)酚氯仿异戊醇(::)于冰上颠倒混匀min。、rpmmin吸取μl上清液加入倍异丙醇(μl)和倍体积(μl)NaAc(pH)混匀后冰上静置min期间间歇震荡。、出现絮状DNA沉淀rpmmin。、弃上清沉淀用乙醇漂洗遍然后用无水乙醇漂洗遍室温晾干加μl的×TE(或双蒸水)溶解过夜倍稀释备用。二、PCR反应体系(ul用于SSR分析):终浓度ulWaterul×buffer(Mg)×uldNTP(mM)mMulTaq(Uul)UulPrimer(uMul条)uM(条)ulDNAul三、PCR扩增条件(用于SSR分析):预变性min变性min退火min个循环延伸min延伸min保存PCR完成后加变性双指示剂(DNAloadingbuffer)在PCR仪上变性,min然后立即置于冰上存准备点样电泳。四、聚丙烯酰胺凝胶电泳准备工作:首先用去污剂清洗玻璃板(包括耳朵板和底板)凉干后先用,乙醇涂擦两块玻璃板然后再用亲水硅烷(Bindingsilane)均匀涂擦底板用疏水硅烷(Repelsilane)于通风橱中均匀涂擦耳朵板稍凉一会待玻璃表面变干然后组装两块玻璃板(期间注意调节水平仪)开始灌胶边灌边轻轻拍打玻璃表面以防胶内产生气泡。胶灌完后再次调节水平仪待胶凝聚约min或过夜准备电泳。(注:一整套电泳设备包括玻璃板电泳槽电泳仪梳子等均购自北京六一仪器厂)。具体操作程序:()安装已凝聚的凝胶到电泳槽中上下电泳槽均加×TBE电极缓冲液约L()预电泳恒功率W,min)用吸耳球清除胶面沉积的尿素和气泡后插入样品梳子(()加样ul电泳约h,W恒功率()固定:,HAC溶液(可以继续留用作停显液),min()冲洗:去离子水洗min次次()银染:gAgNOml甲醛Lwater,min()冲洗:去离子水快速漂洗次(约秒)()显影:gNaCOLwaterml甲醛(现加)ul预冷硫代硫酸钠(mgml现加)(提前将gNaCOLwater充分溶解后置于冰箱预冷临用前现加甲醛和硫代硫酸钠)。()停显:,HAC()冲洗:去离子水冲洗遍后室温凉干照相保存。×TBEbufferL―――――室温保存TrisgmMBoricacid(MW:)mMEDTA(M,PH)mlmMWatertoLAcryBis变性凝胶储存液―――――保存(TCMUrea×TBEbuffea:b=:)mlmlWatermlmlAcry(a)ggBis(b)ggUrea(MW:)gg×TBEmlml过滤保存。灌胶时ml胶液ulAPS(,)ulTEMEDmin后聚合(冬天TEMED可加到ul)。T,abC=babDNAloadingbuffer:ml――――室温保存formamide(甲酰胺)ml()mMEDTA(pH)ml(M,pH)溴酚蓝g二甲苯青gBindingSilaneml―――现配现用ml乙醇ulBindingsilaneulHACRepelSilaneL―――――室温保存ml氯仿mlRepelSilanetoL硫代硫酸钠mgmlml―――保存g硫代硫酸钠mlwatertomgmlDNA提取液(SDS,Tris饱和酚法)ml室温保存reagentstocktotalmMTriscl(pH)MmlmMNClMmlamMEDTA(pH)MmlSDSmlβMEml(临用前加入)WatermlEDTA(MW:)MpHml――――保存gmlwatertoM用NOH调pHaNClMml――――保存agNClmlwatertomlaTrisCl(MW:)MpHml――――保存TrisclgWatermlAdjustpHtowithHCl保存。×TE缓冲液ml――――保存finalamountTriscl(M,pH)mMmlEDTA(M,pH)mMulWaterml灭菌后保存。APS(过硫酸铵)ml――――室温保存gAPSml双蒸水

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