高效液相色谱法测定玉米中的黄曲霉毒素

高效液相色谱法测定玉米中的黄曲霉毒素 高效液相色谱法测定玉米中的黄曲霉毒素 高效液相色谱法测定玉米中的黄曲霉毒素——高秀芬计融李燕俊等一105一 论着 高效液相色谱法测定玉米中的黄曲霉毒素 高秀芬计融李燕俊王玉平 (中国疾病预防控制中心营养与食品安全所,北京100021) 摘要:目的建立一种定量检测玉米中黄曲霉毒素的高效液相色谱 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 .方法样品用甲醇一盐酸溶液提取, 正己烷脱脂,再经二氟甲烷萃取和硅胶柱净化,最后与TFA进行衍生反应,以甲醇一乙腈一水为流动相,C.s柱分离 并通过荧光检测器定量.结果4种黄曲霉毒素在15min内得到良好的基线分离,样品中AFB,A,AFG,,A 的检出限分别为0.04,0.02,0.10和0.04pg/kg.0.10—50.00pg/kgAFBl加标回收率为78.2%一85.9%,相对 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 偏 差为10%16%;10.00和40.00gg/kg总黄曲霉毒素加标回收率分另日为86.5%和89.2%,相对标准偏差分别为13% 和9.2%.盲样测定结果在给定浓度范围内.结论该方法灵敏度高,稳定性好,成本低,可以用于玉米中黄曲霉 毒素的定量检测,并具有推广应用的前景. 关键词:黄曲霉毒素类;色谱法,高压液相;玉米 DeterminationofAflatoxinsinCornsbyHighPerformanceLiquidChromatography GAOXiu—fen,JIRong,LIYan-jun,WANGYu—ping (NationalInstituteforNutritionandFoodSafety,ChineseCDC,Beijing100021,China) Abstract:ObjectiveAhighperformanceliquidchromatographicmethodforthequantitative determinationofaflatoxinsin c0rn$wasestablished.MethodsThesampleswer.eextractedwithmethanol—hydrochloricacid,defattedwithhexane.The extractswerecleanedbyliquid-liquidpartitioningwithdichloromethaneandthenappliedtosilica?gelpurificationcolumn.After reacti0nwitIltrifluoroaceticacid.fourkindsofanatoxinswerequantifiedbyreverse.HPLCwi山fluorometricdetector,using methanol-tolune.waterasmobilephase.Thebaselineseparationoffourkindsofaflatoxlnswasachievedwithin15minutes. ResultsThedetectionlimitsforAFB1,AFB2,AFG1,AFG2were0.04,0.02,0.10and0.04g,kg,respectively.The recoveriesofsamplesspikedwithAFB,of0.10—50.00tLg/kgwere78.2%一 85.9%,withtherelativestandarddeviationsof 10%16%.erecoveriesofsamplesspikedwithtotalailatoxinsof10.00and40.00ttg/kgwere86.5%and89.2%, respectively,withtherelativestandarddeviationsof13%and9.2%,respectively.edetectionsofablindsamplegaveresults withinthevenrangeofconcentration.ConclusionThismethodishighlysensitive,stablewithlowcost,andcanbeusedto detectaflatoxinsincornquantitatively. Keyword:Aflatoxins,Chromatography,HighPressureLiquid;Corn [4] [5] [6] Blackwellscienceinc,1997. NEILCEO,LEHRERSB.Seafoodallergyandallergens:areview: theInstituteofFoodTechnologists[C].ExpertPanelFoodSatety Nutrition,2000. BYUNMW,KIMJH.EffectsofGammaRadiationonthe ConformationalandAntigenicPropertiesofaHeat?StableMajor AllergeninBrownShrimp[J].FoodProtect,2000,7:940—944. LEEJW,YOOKHS,LEEKH,eta1.Conformationalchangesof my~inbyganunaradiation[M].RadiatPhysChem,1999. [7] [8] [9] 李振兴,林洪,靳晓梅,等.利用电泳纯化的微量虾类过敏原制 备多克隆抗体[J].水产,2005,30(2):281—284. NAGPALS,RAJAPPAL,METCAEFED,eta1.Isolationand characterizationofheat—stableallergensfromshrimp(Penaeusinclicus) [J].AllergyClinImmunol,1989,83(1):26—36. THAYERDW.Foodirradiation:benfitsandconcerns[J].JFood Qual,1990,13:147—169. [收稿日期:2007—02—01] 中图分类号:R15文献标识码:A文章编号:1004—8456(2007)02—0102一o4 基金项目:"十五"国家重大科技专项"食品安全关键技术"课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 (2001BA804A3205) 作者简介:高秀芬女硕士 通讯作者:计融男研究员 一 106一TN袁1:卫生杂志vTFNF2007年第19CHESEL0FF00DH卷第2期INJ0URNAYGIENE'.r凹'棚 黄曲霉毒素是某些真菌在生长繁殖过程中产生 的一组有毒代谢产物,主要由黄曲霉和寄生曲霉产 生,能污染多种农作物,包括粮谷,坚果,油料种子和 香料等,其中玉米,花生最易受到污染.由于其广泛 存在性及其毒性,黄曲霉毒素被普遍认为是一种造 成全球范围危害的真菌毒素.天然污染的黄曲霉毒 素主要有4种,分别为黄曲霉毒素B.,B,G.,G(简 称为AFB,AFB,AFG.,AFG).黄曲霉毒素的检测 方法有多种,包括薄层色谱法(TLC),高效液相色谱 法(HPLC)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)等,而其 中荧光检测HPLC方法因其灵敏,稳定等特点,是最 为广泛应用的定量分析方法?J.本研究建立了一种 可以用于玉米中AFB.,AFB,AFG.,AFG检测的 HPLC方法. 1材料与方法 1.1试剂分析纯甲醇,二氯甲烷,正己烷,苯,无 水乙醚,丙酮,盐酸,乙酸,氯化钠,无水硫酸钠(20, 40目)均为西陇化工产品;色谱纯甲醇,乙腈,均为 克来顿产品;三氟乙酸和黄曲霉毒素标准品均为 Sigma产品;去离子水自制.硅胶6o(o.063,0.200 mm,E.Merck产品,使用前先活化,100cI=加热4h, 冷却至室温后按1m]/lO0g分次加入水,每次间充 分混匀,加完后机械振摇4,6h,密闭容器放置16h 以上),玉米粉盲样为VICAM产品(AFB.含量5.9, 10.9t,~g/kg). 1.2仪器设备Waters600型高效液相系统, Waters2475型荧光检测器,PALLPURELABPLUS纯 水仪,TECAN样品浓缩仪,上海亚荣旋转蒸发器,哈 尔滨东联电子振荡器. 1.3色谱条件色谱柱为HypesilBDSC.柱,4.6 mn3x150mm,5m;流动相为甲醇+乙腈+水混合 溶液(17+17+70,体积分数),流速1ml/min;检测器 激发波长360nm,发射波长440nm;进样量20l. 1.4试样提取净化及衍生方法粉碎试样通过20 目筛,混匀后取50g至500ml具塞锥形瓶中,加入 200ml甲醇和50ml0.1mol/L盐酸,高速振荡提取 10rain,静置后过滤上清液.取50m1滤液至250m1 分液漏斗中,向分液漏斗中加入50rnl10%氯化钠 溶液,手动混合均匀,再向该分液漏斗中加入50rnl 正己烷,手动提取约1min,静置分层,如有乳化,滴 加少许甲醇促使分层.下层转移至另一分液漏斗, 在分液漏斗中加入25rnl二氯甲烷,萃取分离.将 二氯甲烷层收集到150ml茄形瓶中,再重复萃取2 次,收集到同一茄形瓶中,40cI=旋转蒸发至剩余大 约2ml液体. 向100ml烧杯中加入2.0g硅胶,再加入约20 rnl乙醚+正己烷(3+1),玻璃棒搅动使硅胶悬浮, 倒人加有脱脂棉塞的玻璃柱中,冲洗烧杯及柱壁,使 硅胶全部进入玻璃柱中.硅胶自然下沉完全后,打 开活塞(排干过程中,加入约1em柱高的无水 Na2so,颗粒),使液面排至硫酸钠层上端,关闭活 塞.将浓缩的提取液加入柱中,用3,4rnl二氯甲 烷清洗茄形瓶,洗液一并加入柱中. 打开活塞,控制流速约1滴/s,液面流至硫酸钠 层上端后,分别加入25rnl苯+乙酸(9+1)和30rnl 乙醚+正己烷(3+1)进行洗涤(此时可适当加快流 速,排干至Na2so,的上端),弃去洗涤液.用100ml 二氯甲烷+丙酮(9+1)洗脱,收集洗脱液到150ml 茄形瓶中,40cI=旋转蒸发至剩余大约5,6ml,移人 10rnl试管中,并用少许二氯甲烷清洗茄形瓶,清洗 液一并移人试管中.在40cI=铝加热块中,氮气吹 干. 向提取物试管中加入200I11正己烷和50三 氟乙酸(TFA),立即于涡旋混合器上混合30s,静置 5min,再向试管中加入1.950ml水+乙腈(9+1), 混合30s,静置分层10min.下层水相用于液相色 谱测定,该2.0ml水相测定液相当于10g试样. 1.5浓度计算采用单点校正法,以50rig/ml AFB.,AFG.和25rig/mlAFB,AF的峰面积为参 比,试样中某成分的峰面积与相应的参比峰面积相 比较,求得试样测定液中黄曲霉毒素的浓度,再由测 定液与原试样的关系(2ml测定液相当于10g试 样)换算得样品中的含量, 计算公式 六西格玛计算公式下载结构力学静力计算公式下载重复性计算公式下载六西格玛计算公式下载年假计算公式 如下: 黄曲霉毒素含量(tlgl培)=(PIP')XCX(2.O/lO)XF 其中P和P'分别为试样中黄曲霉毒素和对应 标准的峰面积;C是标准浓度,AFB.,AFG为 50rig/ml,AFB2,AFG2为25rig/ml.F稀释倍数. 2结果 2.1色谱分离在所选用色谱条件下,黄曲霉毒素 得到良好的基线分离,4种毒素在15min内出峰,先 后顺序为AFG.,AFB.,AFG:,AFB:,图1为黄曲霉毒 素标准色谱图. 2.2校正曲线和检出限以1.00,5.0o,25.0o, 50.00,100.00ng/ml标准作校正曲线,在给定条件下 进行HPLC分析,以峰面积对浓度做校正曲线,R> 99.9%,校正曲线见图2,5.按照信噪比为3, AFB,AFB,AFG.和AFG的检出限分别为0.20, 0.10,0.50和0.20rig/ml,试样的检出限依次为 0.04,0.02,0.10和0.04~g/kg. 2.3回收率向空白样品中添加不同量的黄曲霉 高效液相色谱法测定玉米中的黄曲霉毒素——高秀芬计融李燕俊等 6O 50 挺40 量30 20 10 1:AF.(AFGl的衍生物)2:AFB2.(AFBl的衍生物) 3:AF'G24:AnI2 图1黄曲霉毒素标准色谱图 8o0 7o0 6O0 醛500 嚏400 藿300 2oo lo0 0 醛 喧 图2AFB.峰面积对浓度校正曲线 浓度(ng/m1) 图3AFB2峰面积对浓度校正曲线 醛 眩 掌 图4AFG峰面积对浓度校正曲线 图5A峰面积对浓度校正曲线 毒素,每个添加量做5份平行样,分别计算AFB.的 回收率和4种毒素的平均回收率. 表1AFB回收率 表24种黄曲霉毒素的平均回收率 2.4盲样测定从中检维康购买的VICAM玉米粉 盲样,AFB.的含量范围5.9,10.9,ug/kg,3次测定结 果如下,均在给定范围内. 表3盲样测定结果 样品编号实测含量(kg) 8.60 7.23 10.49 3讨论 本研究主要参考AOAC990.33,并进行了一 些改变,使其更易.于操作,例如将水浴蒸于改为低压 浓缩,加快了实验速度,另外去掉Na~SO使用前的 高温处理,在收集二氯甲烷萃取分离液时,不再通过 无水Na2so,,简化了操作难度,由于后续步骤还有 脱水处理,没有降低实验效果. HPLC方法在黄曲霉毒素的检测上广泛应用, 已经报道了大量不同的方法.在灵敏度方面,不同 文献报道的结果稍有差别,但基本在10, 10. , ug/kg范围内-6i,本方法的灵敏度也在该范围 内,低于绝大多数国家的限量标准,可以满足管理上 的需要.在净化方法上,应用较广的有c.柱,硅胶 柱,免疫亲和柱'以及多功能净化柱口等,有些净 化方法操作简单并可以达到良好的净化效果,如免 疫亲和柱和多功能柱,但是这些净化柱价格昂贵,每 个样品检测费用需要增加150元左右,难以推广使 用.本方法使用的硅胶柱,成本仅几元,虽然增加了 操作步骤,但大大降低了成本,并且保持了较高的回 收率,达到良好的净化效果.本方法使用的TFA衍 生法与另外几种常用的衍生法如卤族元素衍生,光 化学衍生,电化学衍生等相比,不需要特殊的衍生设 备,易于实验室开展,大大提高了AFB.和AFG.的 灵敏度. 枷枷珊瑚瑚抛啪啪卯0 ?-—— 108?-—— 中国食品卫生杂志 CHINESEJOURNALOFFOODHYGIENE2007年第l9卷第2期 论着 HACCP体系在婴幼儿配方粉生产中的应用研究 李凌包大跃徐娇张立实史根生张凤张贵海 ({.四川大学华西公共卫生学院,四川成都610041;2.卫生部卫生监督局,北京100044; 3.石家庄三鹿集团股份有限公司,河北石家庄050071) 摘要:目的为了进一步提高婴幼儿配方粉的卫生质量,确保婴幼儿配方粉的安全.方法选择在中国具有代 表性的采用湿法工艺生产的l家企业作为试点单位,参照CAC发布的(HACCP体系及其应用准则》进行现场调查, 了解生产工艺,对婴幼儿配方粉生产所涉及的所有环节进行危害分析.确立了原料奶的验收,配料,杀菌浓缩3个 关键控制点,确定了相应的关键限值和控制措施,建立了监控,纠偏,验证程序和文件记录保存系统.结论建立 的HACCP体系合理有效,能够充分保障婴幼儿配方粉的卫生质量和安全. 关键词:危害分析和关键控制点;婴儿食品;乳制品 StudyonAppficafionofHACCPinInfantFormulaEnterprises LILing,BAODa—yue,XUJiao,ZHANGLi—shi,SHIGen—sheng,ZHANGFeng,ZHANGGui—hai (PublicHealthSchoolofSichuanUniversity,SichuanChengdu610041,China) Abstract:ObjectiveToimprovethehy~enicqualityofinfantformula,thestudyontheapplicat ionofHACCPininfant formulaenterprisesWgScarriedout.MethodOneenterpriseinwhichtherepresentativewettechniqueWaSusedtoproduce infantformulawagsel~tedastheobject.Accordingto"HACCPSystemandGuidelinesforItsApplication"issuedbyCAC. hazardanalysistOrawmaterialandeachprocessingstepWaSconductedbyinvestigationofthetechnicalprocessesonthespot. Threecriticalcontrolpoints(CCPs)weredefined:thequalityofrawmilk,mixingthesupplementaries,sterilizationand condensation.ThecriticallimitsandcontrolmeasuresofeachCCPweresetupaSwel1.Themonitorsystem,correctiveactions, verificationprocedures,anddocumentsandreCOrdSkeepingwerealsoestablished.ConclusionTheHACCPsystemwasfeaSible andeffective,anditcouldensul~thehygienicqualityandsafetyofinfantformula.. Keyword:HazardAnalyrsisandCriticalControlPoint;Infantfood;DairyProducts 参考文献 [1]JAIMEZJ,FE1VI'ECA,VAZQUEZBI.Applicationoftheassayof aflatoxinsbyliquidchromatographywithfluorescencedetectioninfood analysis[J].JournalofChromatographyA,2000,882:1-10. [2]Methodforaflatoxinsincornandpeanutbutter[z].AOACOfficial Method.99O.33. [3]王君,刘秀梅.食品中黄曲霉毒素B.,B,G.,G的高效液相色 谱测定方法[J].中国食品卫生杂志,2005,17(6):498.500. [4]高军侠,倪余文,万吴雷.过柱纯化一高效液相色谱法测定玉米 黄曲霉毒素[J].生态学杂志,2005,24(8):967.969. [5]冯建蕾,许梓荣,史莹华.HPLC法检测发酵玉米粉中的黄曲霉 毒素BI,Gl,B2,G2[J].中国饲料,2005,16:25—27. [6]许梓荣,史莹华,冯建蕾.光化学衍生法结合HPLC测定食品和 饲料中的黄曲霉毒素[J].中国粮油,2005,20(2):71—75. 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