生物膜形成和卡泊芬净对念珠菌属血分离株生物膜结构的效应

生物膜形成和卡泊芬净对念珠菌属血分离株生物膜结构的效应念珠菌生物膜是潜在网状聚合基质中的微生物菌落,附着于某一表面生长,对抗菌治疗高度顽固。这些生物膜对除棘白菌素和两性霉素B脂质体外的绝大多数抗真菌药表现出耐药性增强。本研究对不同念珠菌属(尤其是白色念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌)形成的生物膜进行了评价,并通过一个临床相关的体外模型系统评估了卡泊芬净(CAS)的效应。CAS在体外显示出对生物膜内的白色念珠菌和热带念珠菌细胞有活性。暴露于抗真菌药48小时后,评价生物膜形成的情况,用扫描电镜(SEM)观察CAS 对预先形成的念珠菌属生物膜的效应。观察到与生物膜有关的细胞形态有数种菌属特异性的差异。我们的结果证实了在高浓度CAS存在的情况下,白色念珠菌和热带念珠菌生物膜会出现矛盾性生长(PG)。SEM分析也证实了这些发现,这些发现与经生物膜敏感性试验获得的代谢活性有关。重要的是,这些结果提示,非典型细胞、增大细胞、圆锥细胞的出现与PG以及念珠菌属生物膜群体中的耐受细胞有关。这些发现的临床意义目前仍未明确。 念珠菌属是机会性病原菌,可导致病危患者发生浅表和全身疾病(8, 22, 44) ,与高死亡率(35%) 以及治疗费用高有关(8, 19)。本菌属是美国医院第四常见的血流感染原因,超过了革兰阴性杆菌引起的发病率(6, 17)。 最近的研究表明,本病原菌导致的大多数疾病与生物膜生长方式有关(7, 16, 28, 48)。生物膜是自发形成、生长在非生物活性或生物活性表面的微生物菌落,附着于自身产生、由胞外网状聚合物质组成的基质中(14, 15, 55),附着于植入的医疗器械时,常对抗菌治疗有难治性。 由于念珠菌属是机会性病原菌,因此可附着于网状聚合表面并产生生物膜结构,保护病原体逃避宿主防御和抗真菌药物(11, 16, 45, 48)。念珠菌生物膜对包括两性霉素B (AMB)、氟康唑、伊曲康唑和酮康唑在内的各种抗真菌药的耐药性比其浮游相要高(20, 38, 50)。然而,生物膜相关性微生物对抗真菌药耐药的分子基础目前尚未完全明确。 在体外和体内观察到的念珠菌生物膜复合结构提示形态分化产生菌丝对生物膜的形成和成熟有重要作用(7, 32, 33)。Baillie 和Douglas 证明了固定在菌丝或酵母相上的突变细胞虽然可变为生物膜,但是菌丝结构是为生物膜提供完整性和多层结构的必要因素(4)。据报告,近平滑念珠菌、光滑念珠菌以及热带念珠菌生物膜不如白色念珠菌产生的生物膜大;然而,必须进行进一步结构分析研究以描述这些微生物形成的生物膜(30, 31)。 念珠菌生物膜显示出来的耐药特性的机制目前未明。可能的机制包括生长率下降;生物膜上的细胞营养受限;耐药基因,尤其是编码外排泵的基因的表达;细胞密度增大;细胞衰老;或生物膜上有“持留”细胞(1, 3, 5, 29, 34, 36, 38, 43, 46, 48, 50, 51)。 棘白菌素是一类新型半合成两性脂肽,具有明显的抗真菌活性。当前已上市的棘白菌素有卡泊芬净(CAS)、米卡芬净和阿尼芬净。棘白菌素在体外和体内治疗念珠菌血症和侵袭性念珠菌病显示出显著疗效(25, 27, 42)。CAS是首个获得上市许可的抗真菌药,可抑制β-1,3-葡聚糖,β-1,3-葡聚糖是念珠菌细胞壁的主要结构成分;葡聚糖合成被证明是生物膜的特别有效的靶点(29, 31, 38, 48, 50)。高浓度棘白菌素的抗真菌活性反而减弱这一矛盾现象常见于白色念珠菌分离株,且似乎在各种棘白菌素中对CAS有特异性。在高浓度棘白菌素中存活的细胞对某些药物效应敏感,表现出在CAS存在的条件下生长减慢的证据(53, 54)。最近有研究描述了在念珠菌属生物膜中的这种效应(24, 37, 47);然而,我们还不知道有阐明CAS对念珠菌生物膜结构的效应的研究。本研究旨在(i) 鉴定念珠菌属血分离株的体外生物膜生长,以及(ii) 通过扫描电镜(SEM) 获取关于CAS对与矛盾性生长(PG)有关的生物膜形态变化的效应的视觉证据。 材料和方法 生物体。本研究评价了3个临床念珠菌属分离株,包括一个白色念珠菌分离株(CA4),一个热带念珠菌分离株(CT8)以及一个近平滑念珠菌分离株(CP1)。所有菌株都是从入住韦拉克鲁斯医院(贝洛奥里藏特市,巴西)重症监护病房的念珠菌血症患者中获取的。通过血清芽管试验、玉米粉吐温80琼脂的微形态以及用ID32C系统(bioMerieux, Marcy l’Etoile, 法国)的代谢性质等传统生理和形态学方法对这些临床分离株进行鉴定。 培养基和生长条件。生物体原种保存于- 70°C。首先将每一份冰冻的原种培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂(Difco, Becton Dickinson, Sparks, MD),于35°C 孵育24小时。然后采集菌落,将之加入一根含L-谷氨酰胺、不含碳酸氢盐的RPMI 1640 肉汤培养基(Sigma Chemicals)的试管中,用3-(N-吗啉)丙磺酸(165 M; Sigma Chemicals)缓冲至pH为7.0。为所有实验制备1.0 × 106 CFU/ml(600 nm 的光密度为0.12)的标准悬液,制备后立即使用。 基底材料。从Biosurf ace Technologies(Bozeman, MT)购买直径为13 mm的,厚度为4 mm扁平硅圆盘。用稀释的实验室肥皂(Versaclean; Fisher Scientif ic, Pittsburgh, PA)清洗这些圆盘,在反渗透纯净水中至少漂洗5次,在70%的酒精中漂洗一次,风干,使用前进行高压灭菌处理。 用人血清对薄膜进行预处理。本实验所用血液是从科研资源部门(疾病预防控制中心)获取的。采集的血液的供体是非吸烟者、没有用药且之前的血源性病原菌试验为阴性。将血液在37°C 孵育1小时,然后以4000 × g 离心20分钟。移走血清,无菌过滤,然后在56°C 水浴中孵育30分钟,使补体失活。等分部分保存于-30°C备用。 生物膜形成。成熟念珠菌生物膜的形成如前所述(11, 29, 30, 36)。将高压灭菌过的硅盘置于12孔组织培养板(Corning Inc., Corning, NY)上,每个孔放一个圆盘,37°C 下在人血清中孵育24小时,然后在5 mL磷酸盐缓冲液(PBS)中漂洗5分钟,以除去过量的血清。随后将圆盘转移至一个新的含有3 ml 1.0 × 106 - CFU ml-念珠菌细胞悬液的12孔培养板上。圆盘在37°C 孵育1.5小时,摇动速度为100 rpm,如此使细胞贴壁。细胞贴壁后,在PBS中轻轻漂洗挂片,然后转移至含新鲜RPMI 1640肉汤的新培养板上,在35°C 下置于振动台孵育72小时,以使生物膜形成。对照组除了不加念珠菌细胞,以同样的方式处理圆盘。所有检测均进行三次。 定量检测生物膜。如前所述(11, 23, 29, 30, 37, 45),用2,3-二(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯胺基)羰基]-2H-四唑氢氧化物(XTT)还原试验对念珠菌生物膜进行定量。XTT (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 被线粒体脱氢酶还原为水溶性的甲臜产物,可通过分光光度法检测。通过临床和实验室标准协会(CLSI) 微量肉汤稀释法M27-A检测,生物膜代谢活性减少50% (50% RMA) 与MIC50(是与对照菌相比,生长被抑制50%时的MIC)相关(11, 21)。简而言之,应每天制备新鲜X TT-甲萘醌溶液:将1.5 mL X TT (在林格乳酸盐中的浓度为1 g/升;Sigma Chemicals, St. Louis, MO)加入300μl 甲萘醌溶液中(在丙酮中为0.4 mM;Sigma Chemicals)。清洗含有念珠菌属生物膜的圆盘,并将生物膜转移至一个新的12孔组织培养板中,每个孔含3 ml PBS和180μl XTT-甲萘醌溶液(根据上述方法制备)。培养板在37°C 下孵育2小时,然后去除培养基,以6000 × g 离心5分钟,使所有上悬细胞或碎屑变为颗粒。用分光光度计(Hach Company, Loveland, CO)测定490 nm处上清中的XTT甲臜含量。 抗真菌敏感性。CAS来自默克公司(Rahway, NJ)。我们利用CLSI微量肉汤稀释法进行浮游性敏感性试验(40)。念珠菌分离株保存于-70°C 备用。将每个菌株都覆盖于沙氏葡萄糖琼脂上,37°C 下孵育24小时。用无菌生理盐水制备CAS原液,用RPMI 1640培养基稀释。检测的稀释液浓度范围是16 μg/ml 至0.0625 μg/ml。以48小时时引起对照孔浊度显著降低的最低浓度作为CAS 的MIC。 对于对于生物膜敏感性试验,如前所述,生物膜形成于RPMI 1640 培养基上。生物膜生长24小时后,含有预制成的生物膜的圆盘用PBS洗3次,然后用CAS进行激发试验。CAS在RPMI 1640 培养基中稀释,得到10份二倍系列稀释液,浓度范围是0.25 μg/ml至to 128 μg/ml。轻轻摇动含生物膜的圆盘,然后将生物膜转移至含RPMI 1640 培养基(3 ml) 和各种浓度抗真菌药物的新培养板中。在35°C的条件下,生物膜在振动台上暴露于抗真菌药物48小时后,通过上述XTT还原法检测生物膜的活性。然后确定与无药物(未予处理)的对照 菌代谢活性相比导致生物膜50% RMA 的抗真菌药物浓度。分离株检测3次。 暴露于CAS后通过平板计数对念珠菌属生物膜进行定量。如前所述,预先在硅圆盘上形成念珠菌生物膜。圆盘暴露于不同浓度CAS 48小时后,在无菌条件下移去圆盘,用5 ml PBS 轻轻清洗,以去除浮游细胞以及粘附不牢的细胞。将圆盘逐个转移至10 ml PBS中,在42 kHz下用超声处理10分钟(model 2510 超声破碎器;Branson, Danbury, CT),然后以高速涡流处理30秒,随后再次用超声处理5分钟,涡流处理30秒,超声处理30秒,最后用涡流处理30秒。用Butterf ield 缓冲液(Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks,MD)稀释念珠菌悬液,将悬液涂在沙氏葡萄糖琼脂上。较早的研究表明,该过程基本可除去圆盘表面所有活的念珠菌属细胞,而且超声处理与悬液中的细胞存活率下降无关(未给出数据)。对于每个实验,确定3种不同圆盘上存活细胞的数量,受检分离株的平均数量以每平方厘米的CFU 表示。 SEM。对于用SEM 检测,如前所述,念珠菌属生物膜在12孔组织培养板上生长。生长24小时后,用PBS 清洗圆盘,,将不同浓度(每ml RPMI 1640 分别有1.0/16和128 μg CAS)的CA S 加入样本中。然后将培养板置于振动台上,在35°C 下再孵育48小时。对照(未予处理)样本仅用RPMI 1640 孵育。根据敏感性试验测定所得的代谢活性结果选择药物浓度。 孵育后,用PBS 清洗样本(含生物膜的圆盘),将样本放入含5%戊二醛固定液的二甲胂酸缓冲液,室温下过夜。然后把样本经梯度乙醇脱水,浸入六甲基二硅胺烷(Polysciences Inc., Warrington, PA) 中,最后在室温下风干过夜。随后将样本放在涂 有银粉漆、用金喷镀的铝棒(Polaron SC7640 sputter coater; Thermo VG Scientif ic, United Kingdom) 上,用FEI XL30 环境SEM (FEI Co., Hillsboro, OR) 进行观察。检查样本的整个表面,采集具有代表性的样本图像。实验需进行3次。 统计分析。用双侧t 检验和Excel 2003 (Microsof t Corporation, Redmond, WA) 分析数据。认为P 值≤0.05为有显著性。 结果 CAS 和AMB 在体外对预先形成的念珠菌属生物膜的活性。白色念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌浮游(自由漂浮)细胞和生物膜对CAS 的敏感性呈现于表1。本研究所用的浮游念珠菌分离株对受检的抗真菌药高度敏感,但是近平滑念珠菌的敏感性似乎比其他菌株要小。 生物膜敏感性试验的结果呈现于图1。如图1中的A至C所示,CAS 抑制80%附着性热带念珠菌、白色念珠菌以及近平滑念珠菌生物膜生长的最小药物浓度(SMICs)(代谢活性降低50%)无法与这些微生物的浮游相MIC相比。预测热带念珠菌和白色念珠菌生物膜的S MIC 分别是0.25 μg/ml 和0.5 μg/ml,比各自的浮游相MIC 稀释度高2倍(表1)。近平滑念珠菌的(4 μg/ml)是其浮游相MIC 的16倍(图1C),证明生物膜相关性近平滑念珠菌细胞对CAS 的耐药性明显较其浮游细胞大。 表1. 用CLSI 和XTT 法a得出的不同念珠菌属在浮游和生物膜生长情况下对抗真菌药的敏感性————————————————————————————————————————— CAS 的MIC(4 μg/ml): ————————————————————— 分离株浮游生长的细胞b生长48小时的生物膜 (SMIC50)c ————————————————————————————————————————— 白色念珠菌(CA4) 0.0625 0.5 近平滑念珠菌(CP1) 0.25 4 热带念珠菌(CT8) 0.0625 0.25 ————————————————————————————————————————— a表示的是至少3个独立实验的结果。 b浮游细胞的MIC 终点是根据肉眼确定造成细胞生长相对于无药物对照孔的细胞生长显著减少的最低药物浓度得出的。 c生物膜的MIC 终点是根据XTT 还原法测定的导致相对于未予处理的生长对照细胞的代谢活性降低50% RMA 的最低药物浓度得出的。 热带念珠菌和白色念珠菌表现出的敏感性类型是生物膜细胞对浓度高于SMIC (4-16 μg/ml) 的CAS 的敏感性低于浓度约为0.25-2 μg/ml 的CAS 的敏感性,这种情况被称为矛盾性生长。未观察到近平滑念珠菌对CAS 有PG。总的说来,这些结果提示CAS 对预先形成的白色念珠菌和热带念珠菌生物膜更为有效。 微观评价念珠菌属生物膜的PG。为了将PG 和念珠菌细胞形态学的变化联系起来,我们用SEM 观察了不同浓度CAS 对生物膜相关性细胞的效应。SEM 可提供关于生物膜结构中出现的不同细胞形态学的有用信息。将3个相同的含有每种菌株的圆盘暴露于3种不同浓度CAS(1 μg/ml、16 μg/ml和128 μg/ml),并与未予处理的对照圆盘进行比较。由于硅圆盘的表面是一致扁平的,因此,很容易获得平面图像。图2至图4显示的是不同念珠菌属形成的生物膜SEM 图像。热带念珠菌和近平滑念珠菌(分别是图3和图4)产生的生物膜延伸范围不如白色念珠菌(图2)。SEM 还发现生物膜结构具有菌株特异性。对照组(未予处理)白色念珠菌的生物膜结构具有高度异质性,由一层密集的酵母、假菌丝以及菌丝相组成(图2A)。热带念珠菌和近平滑念珠菌的生物膜表现为典型的微菌落/水通道结构,含有酵母细胞聚集体(不 规则 编码规则下载淘宝规则下载天猫规则下载麻将竞赛规则pdf麻将竞赛规则pdf 的基底芽生孢子层集聚)和丝状体(图3A和图4A)。 预先形成的白色念珠菌生物膜暴露于CAS 后,显示出菌丝较少,而增大的芽生孢子数量显著增多,以1 μg/ml CAS 处理后,这些孢子大多倒塌。用16 μg/ml CAS 处理后也可以观察到孢子倒塌,但是程度较小。暴露于128 μg/ml CAS 的生物膜含有的孢子比没有暴露于药物的生物膜多得多(虽然大小比在1 μg/ml 和16 μg/ml 所见的小),但是似乎未受CAS 处理的影响。在1 μg/ml CAS 中生长的生物膜的存活数量比未予处理的生物膜数量约少CFU/cm2对数的2倍,但16 μg/ml CAS 组的生物膜数量约等于对照组(表2)。预先形成的生物膜暴露于128 μg/ml CAS 后存活的数量减少,但仍可检测出来,但是无检测到XTT 还原(图1和表2)。 图1.暴露于不同浓度CAS 的念珠菌属生物膜的代谢活性。代谢活性以含有经处理生物膜的硅圆盘相对于含未经处理生物膜的硅圆盘(对照)的平均光密度来表示。(A)白色念珠菌;(B)热带念珠菌;(C)近平滑念珠菌。误差条图,标准差(n=3)。 与白色念珠菌不同的是,热带念珠菌在有CAS 存在的条件下生长时,并未显示出细胞形态有明显变化(图2和3)。然而,细胞在1 μg/ml CAS 中生长时,检查的全部视野的所有细胞均出现倒塌的细胞壁。 16 μg/ml CAS 对细胞形态的效应显著要小,虽然可观察到圆锥形细胞。预先形成的生物膜暴露于128 μg/ml CAS 后,形态与未经处理的生物膜非常相似。暴露于1 μg/ml CAS 和16 μg/ml CAS的细胞的存活数量和XTT 活性是一致的(表2和图1A)。但是,暴露于128 μg/ml CAS 后,生物膜显示出的存活数量减少,但是仍可被检测出来;在此浓度下未检测到XTT 活性。暴露于128 μg/ml CAS 的细胞的形态与未经处理的对照细胞形态相似。 无论是否暴露于CAS,近平滑念珠菌的生物膜主要都是由酵母细胞组成的。与对白色念珠菌和热带念珠菌的效应相反,1 μg/ml CAS 似乎不会对近平滑念珠菌的细胞结构造成影响。可观察到16 μg/ml CAS 对细胞形态学的效应,但是未观察到128 μg/ml CAS 对细胞形态学有效应。细胞的存活数量和代谢活性表明,随着浓度增大,CAS 逐渐减少。在CAS 浓度为64 μg/ml 或128 μg/ml 时,未检测到XTT 还原,但是可检测到存活细胞(图2)。这些结果提示,对于白色念珠菌和热带念珠菌,PG 与代谢活性增加、存活细胞数以及生物膜内的主要细胞形态学变化有关。 图2.在不同CAS 浓度中预先形成的白色念珠菌生物膜的扫描电镜图像。生物膜在暴露于抗菌剂前先在硅圆盘上生长24小时;然后在含有不同浓度的RPMI 1640 培养基中孵育48小时。(A)未予药物处理的白色念珠菌生物膜(对照);(B 到D)分别暴露于1 μg/ml、16 μg/ml 或128 μg/ml CAS 后形成的白色念珠菌生物膜。图像是典型视野的图像。横条长度为10 μm。 讨论 近年来,人们对念珠菌属形成生物膜的能力进行了评价(16, 20, 23, 29, 39, 45, 49, 52)。由于已意识到经常使用医疗器械会导致器械相关性感染相应增多,因此目前对念珠菌生物膜很显著的临床机构给予了特别重视(16, 31, 48)。生物膜细胞的特征在于对部分抗真菌药物耐药性显著增强以及表型发生改变,这使得根除它们变得困难(4, 11, 31, 32, 48)。了解念珠菌属生物膜形成和表性特征将有助于我们创造出旨在根除和预防此过程的新策略,从而降低这些感染的发生率。 我们通过一个生物膜模型系统证实了白色念珠菌、热带念珠菌以及近平滑念珠菌这3个具有医学相关性的念珠菌属菌株的SMIC50s。我们的生物膜MIC 结果证实了如下发现:其他研究组的结果表明,临床浓度的CAS 在体外对白色念珠菌和热带念珠菌有良好活性(2, 12, 29, 37, 47)。如之前别人已发表的结果一样,我们假设,根据XTT 代谢活性得出的检测结果足以间接对生物膜进行定量。虽然XTT 检测可用于监测生物膜形成,但是显微镜分析对菌株和菌属比较至关重要(31)。本研究证实了白色念珠菌和热带念珠菌有PG 效应,但近平滑念珠菌无PG 效应。我们的对白色念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌的部分定量生物膜结果是与Melo 和同事们发表的一项研究的结果一致的(37)。他们报告了白色念珠菌(100%受检 菌株)、热带念珠菌(67%受检菌株)和近平滑念珠菌(57%受检菌株)生物膜出现PG 的频率很高。本研究的一个重要受限之处在于受检菌株数量太少。此限制可影响不同菌属PG 的检测,如本研究中观察到的近平滑念珠菌。 图3.在不同CAS 浓度中预先形成的白色念珠菌生物膜的扫描电镜图像。生物膜在暴露于抗菌剂前先在硅圆盘上生长24小时;然后在含有不同浓度的RPMI 1640 培养基中孵育48小时。(A)未予药物处理的热带念珠菌生物膜(对照);(B 到D)分别暴露于1 μg/ml、16 μg/ml 或128 μg/ml CAS 后形成的热带念珠菌生物膜。图像是典型视野的图像。横条长度为10 μm。 在本研究中,我们用SEM 观察与暴露于CAS 后预先形成的念珠菌生物膜有关的形态学变化。SEM 证实了1 μg/ml CAS 对热带念珠菌和白色念珠菌的固着细胞是有效的。我们显示了16 μg/ml CAS 可导致预先形成的白色念珠菌和热带念珠菌生物膜发生显著的形态学改变,伴有增大的芽生孢子、畸变细胞以及较少的菌丝。SEM 所观察的样本的制备涉及在戊二醛中固定、梯度脱水步骤以及临界点干燥。将样本暴露于真空进行观察时,此脱水过程会改变生物膜的胞外网状聚合物基质(31, 45) 。倒塌细胞的形态(尤其是用1 μg/ml 或16 μg/ml CAS 处理的白色念珠菌和热带念珠菌生物膜)提示细胞壁结构发生改变对SEM 过程的破坏性效应更为敏感。需要用透射电镜确定已处理和未予处理的细胞壁有无此效应。 之前已有学者描述了念珠菌属分离株可发生与PG 相关的生物膜形态学改变(37);但是,据我们所知,本研究首次提供了关于附着于生物材料的白色念珠菌和热带念珠菌生物膜的PG 的详细SEM 图像分析。我们的结果还显示,即使处于高浓度(128 μg/ml)CAS中,生物膜中仍然至少有一定比例的细胞保持存活。这种结果有四种可能的解释:(1)产生的生物膜很多,这些细胞可能使代谢远离了正则函数(54, 56); (2)本研究的生物膜来自异质人群,生长速度不同,因此亚群细胞也可因其生长速度较慢而获得对抗真菌药的耐药性(32, 38);(3)CAS 浓度高时药物无法完全溶解;(4)生物膜含有可在浓度远高于MIC 的抗生素中存活的持留细胞(是野生型的表型变异体,而非突变体)(34)。之前对白色念珠菌生物膜形成的研究描述了生物膜暴露于各种抗真菌药物后出现了持留细胞(29, 34)。持留最初是用来描述休眠、生长缓慢或不生长的细胞(26, 35) ,但目前被公认为是在杀微生物抗生素存在的条件下既不生长也不死亡的耐药细胞。在本研究中,我们观察到白色念珠菌和热带念珠菌的固着细胞亚群显示出的对CAS 耐药类型,并且在药物浓度为16 μg/ml 时出现形态学畸变。有意思的是,在CAS 浓度为128 μg/ml 时,同一真菌菌属表现出的生物膜结构与对照生物膜相似。然而,当我们对暴露于此药物浓度的生物膜和对照组存活细胞数量和XTT 活性低的结果进行比较时,却未观察到相似的情况。上述观察结果提示,在高CAS 浓度时,有菌属特异性的“冬眠”现象。必须进行进一步研究以明确情况是否如此。 图4.在不同CAS 浓度中预先形成的白色念珠菌生物膜的扫描电镜图像。生物膜在暴露于抗菌剂前先在硅圆盘上生长24小时;然后在含有不同浓度的RPMI 1640 培养基中孵育48小时。(A)未予药物处理的近平滑念珠菌生物膜(对照);(B 到D)分别暴露于1 μg/ml、16 μg/ml 或128 μg/ml CAS 后形成的近平滑念珠菌生物膜。图像是典型视野的图像。横条长度为10 μm。 表2. 从硅挂片中回收的存活细胞中位数量