基于DIG_化学发光法的Southernblot方法优化
DG) Southen blotIr基 于化 学 发 光 法 的方 法 优 化
1,2 1211111张晓张锐 于源华 史计 孟志刚 孙国清 周焘 郭三堆
1 ( ,100081;中国农业科学院生物技术研究所 国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程北京 2 长春理工大学生命科学技术学院,长春 130022)
: ,DIG-Southern blot ,摘 要目前基于 化学发光法的 技术已在生物实验室广泛应用但在试验过程中经常会遇到背景 、,。RFLP DIG-黑目的信号弱等问题以致不能获得理想结果在棉花线粒体基因组 分析过程中结合前人经验对基于 化学发光
Southernb lot 、、。,法的 技术在探针标记探针浓度探针剥离等方面进行了优化优化后的方法重复性好一张转好的尼龙膜最多
11 5 ; 。可以反复使用 次一份杂交液在两年内至少可以反复使用 次且不会明显降低杂交效果
: Southernb lot DIG 关键词标记 化学发光法 尼龙膜 探针
Optimization of Southern Blot Analysis Basedo n
DIG-Chemiluminescent Detection
1,2 1 2 1 1 1 1 1 Zhang XiaoZhang RuiYu uanhuaSh JiMeng ZhgangSun GuoqngZhou TaoGuo aSnduYiiii1 ( Botechnoogy Research nsttute,Natona Key Facty of Crop GenRe esources and Genetc mprovement,Chnese Academy f oilIiililiiIi2 Agricultural Sciences,Beijing 100081; College of Life Science,Changchun University of Science and Technology,Changchun 130022)
Abstract: Southernb lot technology based on thDeI Gchemiluminescent detection has beenw idely used in Biology laboratory,but- various troubles were appeareind the epxeriment,such as high background anldo w sensitivity which can causeo btain ideal results, Ac-
cording to theRFL P analysis of cotton mtDNA ancodmb ined with othersexperience,we optimized the Southernbl ot method based ’
on
the DIGchemiluminescent detection, We focused olna beling of probe,concentration of probe,stripping and rperobing of DNA blots,- With the optimized method,a nylon membrane can be used forti 1m1e s,and a piece of hybridization solution can be used for ti5m es within two yearsw ithout decreasing performanceob viously,
Southern blot 方法是分子生物学中的一项基本 、、Key words: Southernb lot hybridization DIG labeling Chemiluminescence Nylon membrane Probe品处理洗膜方法探针标记及曝光时间等多个方面
,、,、、 对试验方法进行了改进得到了结果理想重复性好 技术它在检测目的基因拷贝数鉴定转基因植株
、DNA , 开发分子标记筛选 文库中具有重要 的 作 用。的一套方法
,,但该技术步骤较繁琐要想得到理想的结果往往费 1材料与方法 32 。Southernbl ot P 时费力传统 分析的探针通常是用1, 1 材料 35 S 。,、DIG 或标记近 年 来生 物 素等 非 放 射 性 标 记 1, 1, 1P30A、植物材料 棉花细胞质雄性不育系 ,物越来越多地用来标记核酸探针克服了放射性同 P53A、P80A、S25-4A、96-48A、AP25MA、1081A、 ,位素标记技术的固有缺点并且能够得到可以与放 CMS-D8; P30B、P53B、P80B、S254B、96--保 持 系 ,1,。射性标记 相 媲 美 的 结 果由于非放射标记法所 48B、AP25MB、108;1 BY18。恢复系
,需的步骤更多因此要得到理想的结果就需要注意 Southernbl ot 1, 1, 2所用探针及引物如基因探针
。,、更多的细节本研究结合具体试验从探针浓度样 1 ,。
表
关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf
所示引物由上海生工合成
2011-02-22: 收稿日期 : ( 2008ZX08005-004)基金项目国家转基因生物新品种培育科技重大专项 : ,,,: ; Ema: enerrgy@12 6, com-il作者简介张晓男博士研究生研究方向植物基因工程 : ,,,: ; E-mail: gsdui@ mail, caas, net, cn通讯作者郭三堆男研究员研究方向棉花基因工程研究
1 表 探针名称及引物序列 :。,提取棉花嫩叶液氮研磨时要做到快速充分苯酚
,氯仿抽提时要多抽提几次尽量使有机相和水相之 产物大 ( 53)Tm( ? )''探针 引物 引物序列? ( bp)小 。间无白色物质
1, 2, 2基 因 组 的 酶 切 电 泳 检 测 提 取 的 基 因 组 cbForwardCATTTGATAGATTATCCAAC551 061G
DNA,、RNA ,确保没有明显的蛋白残留后用紫外分 ReverseAATGGGCGTTATGGCAAAG60G
40 g ,。光光度计进行定量每个样品取 μ进行酶切 n9orwardCATGGGAATAGATCTGATACC59463F
400 40 10 ×b uffer,300L,L 酶切体系为 μ其中包含 μ ReverseCAAAATCGAAATAGCGAAATTC55 U ,4 L 100 ×BS A。,的限制性内切酶μ的 酶切时先 a1orwardATTTTCAAGTGGATGAGATCGG591 304F DNA、ddHO、10 × buffer ,,将基因组 加好反复混匀 2 ReverseATCACAGAATCCATTGACAGC61G ,3,BSA 。,然后再 加 入 和 内 切 酶再 充 分 混 匀然 后 a6orwardTATTTCTCATTCACAAATC49687F 37? 6 , 8 h。2 h 。反应 期间每隔 弹动混匀一次反 ReverseAGCATCATTCAAGTAAATACAG55 ,5 L ,应结束后取 μ进行电泳检测一是看酶切是否 a9orwardATGTTAGAAGGTGCAAAATCA55221F ,, 完全二是看各样品间亮度是否一致若某个样品亮Reverse55AAAACGAATGAGATCAGAAAG ,DNA。度明显弱则应再补切适量的基因组 若酶切 完c1orwardCCACAAGGATATAGGGACTC601 393DNA 0, 8 F,全且各样品间 量一致则用 倍体积异丙 醇
0, 1 3 mol / L NaAc ,和 倍体积 沉淀酶切产物然后 用 Reverse GATTGTTACGACCACGAAGAAAC61
75% 1 30 , 40 ddHO ,L 乙醇涮洗 次晾干后加入 μ重2 c2orwardATGCAGCGGAACCATGGC64625FG ,。溶准备上样 ReverseCTGCACTGACCATAGTAAACTC61 1, 2, 3 ,电泳 使用大孔梳齿和大胶板配胶梳孔容 c3orwardATGATTGAATCTCAGAGGCAC59791F 40 1 ×T AE,L ; 量要达到 μ以上缓冲液为 琼脂糖浓 ReverseACCACCCCACCAATAGATAGA61 0, 8% ; 35 V,16 h,度为 电泳条件为 即通常 要 跑 足 n6Forward TTCTGTTTTGTCGAGCCTTGCTTTG60559 500 Vh。 ReverseAGCATTTCGTCGGAATACATC56 1, 2, 40, 25 mol / L HCl ,转 膜 电 泳 结 束 后用 溶 s5orwardTGTCCGTCGTTCCGCTTTTTTCG62470F 15 min ,( 1, 5mol / L液浸 泡 凝 胶 后用 碱 变 性 液 ReverseCTATGGAGGTTGCTGCTGATGC62 NaCl,0. 5 mol / L NaOH ) 1 h。 Bio-处 理 然 后 使 用 n5orwardTCACCACCCGTTGTGCGGAGCC64333F Rad 785 。公司的 型真空转印仪进行转膜转 膜 条 ReverseTATGTACGCAGGGAGAGTTTC64G : 5 inch Hg,75 min。10 × SSC 2,,件转膜转完后用
×SSC 2 , 3 。涮洗尼龙膜 次 1, 1, 3high prime labeling andDIG 试 剂 与 仪 器 1, 2, 5 紫外交联 将尼龙膜放到紫外交联仪中交 detection starterk it II Roche EcoR I,。购自 公司2 1 min,0, 1 J / cm。联 照射剂量大约为 Hind 1, 2, 6,预杂交 交联结束后直接将尼龙膜放入杂 III Promega 。Taq DNA 限制性内切酶购自 公 司聚 ,,1 h。交管中加入预杂交液在杂交炉中慢速转动 。。 合酶购自天根生物公司琼脂糖购自西班牙其它1, 2, 7 4 50 L PCR探针的制备与处理 做 管 μ的 ,化学试剂购自北京拜尔迪生物技术公司均为分析 , 反应体系来扩增目的基因片段凝胶回收后用紫外+ 。Hybond-N Amersham ; 纯尼 龙 膜 购 自 公 司凝 胶 回,1 g DNA 分光光度计进行定量取 按照试剂盒 中 μAxygene adder 0331 。DNA l收试剂盒购自 公司购 自 ,37? ,20 h,的要求进行标记标记条件为 期间弹动 Fermentas CL-1000 Ultravio- let 。公司紫外交联仪为 。,DNA Marker 。混匀数次同时将 也进行标记标记 Crosslinker( UVP ) 。美 国 公 司紫 外 分 光 光 度 计 为 ,10 mn,, 20? 。i结束后沸水浴处理 冻存备用使用 ND-1000( NanoDrop ) 。美国 公司 ,Marker 时将目的基因探针和 探针同时加到预杂交 1, 2 方,25 ng / mL,Marker 液中探针总浓度为 其中 探针占 ,2,1, 2, 1DNA CTAB 棉花基因组 提取 改良的 法 法
1 /6( ,Marker 1) 。( 如果不需要指示条带的精确大小探针这为试验结果的获得了产量较一致的探针图
) 。0, 22 mol / L 0, 45也可以 不 加 将 杂 交 液 用 μ或 。 重复性打下基础
mol / L ,。μ滤膜进行过滤后便可用来杂交尼龙膜
20 , 36 h,1, 2, 8杂交 杂交时间为 杂交液体积为 2 3, 5 mL /100 cm25 ng / mL。:。尼龙膜探针浓度 即
3, 5 mL,,( 25 ×配置 杂 交 液则所需的探针量为
3, 5) /2 300,× 20 = 0, 76 L。μ
SDS,5 min,,1, 2, 92 ×SS C /0, 1%室 温洗洗膜
。0, 5 ×SS C /0, 1% SDS,66? ,45min ,两次每 次
pg /( 图片上方的数字表示 探 针 溶液梯度稀释后的浓度 2 h,。洗两次 L) ; control DIG μ为试剂盒中所带的 标记的对照探针 1, 2, 10100 mL lbocking buffer,1 h。,封 闭 室 温 1 图 探针效率检测: 1 ? 500,1, 6antbody,20 mL bockngiliL抗体μ
12 2, 2 最适探针浓度的确定方法 buffer。 washing buffer( blocking 1, 2, 11洗 涤 Southernb lot ,为获得清 晰 的 杂 交 图 片合 适 的
buffer, 0. 3%Tween 2)0 2 h 。洗 后过夜 。25 ng /探针浓度至关重要试剂盒中的推荐浓度是 1, 2, 12de-,洗 涤 完 成 后将 膜 浸 到 加 反 应 底 物 mL,,但是开始做出来的片子背景值很高出 现 这 个 tecton buffer ,i中充 分 浸 透然后尼龙膜放到保鲜,25问题主要因为探针浓度不准确不 知 如 何 获 得 膜 ng / mL ,,的探针浓度在试剂盒说明书上并没有给出 ,CSPD,上迅速均匀滴加上 然后用尼龙膜覆盖保鲜 。, 确切的定量方法为获得合适的浓度对标记
模板
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。37? 15 min。膜置于 培养箱中孵育 ,: 和标记时间这两个指标进行了定量即标记反应的 1, 2, 13 ,X 压片 根据尼龙膜上信号强弱将 光胶 ,1 模板用紫外分光光度计进行精确定量后从中 取
15 min , 2, 5 h。片曝光 X 3 mn 45 s,i;1, 2, 14光胶片的冲洗 显影 定影 g ,20 h。20 μ进行标记标 记 时 间 定 为 这 样 就 认 为
。然后用清水反复冲洗 2 300 gn。L μ标记反应液中的探针产量为 根 据 这 1, 2, 15 探针剥离方法 用尼龙膜完成对一个基因 ,个数值以及所需的杂交液体积来确定标记反应液
,5 min,探针的检测后及时将之置于无菌水中浸泡 。,N mL ,的量例如如果需要 杂交液则标记产物为
,0, 2mol / L NaOH /然后 放 入 杂 交 管 中加 入 适 量 { ,( 25 ×N ) /2 300,× 20 }L。为验证这个定量方μ 0. 1%SDS 37? ,,,15,溶 液慢 速 转 动洗 两 次每 次 ,28 ng / mL 25法是否可行根 据这个
公式
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确定了 和 min; 2 ×SSC ,,用足量 浸泡两次然后用保鲜膜包裹 ng / mL 6 mL ,,这两个浓度按照 的杂交液用量分别 4? 。置 冰箱中保存 ,( 28 ×6 ) /2 300, × 20 = 1. 46 L ,( 25 取了μ和
×2结果
6) /2 300,× 20 = 1, 3 L 。μ探针进行杂交反应2, 1 探针效率检测
,Marker、电泳时只对分子量 阳性对照进行了上Southernb lot ,探针效率直 接 决 定 的 试 验 结 果
,, 样制备两块相同的胶和相同的上样量然后进行转。所以首先要确保探针具有足够的活性为获得活性
。( 2) 28 , ng / mL 膜杂交结果图 表明的浓度明显偏 ,。足够高的探针着重注意以下方面首先是探针模
,X ,、; 高光胶片曝光后背景高有较多的黑点和黑团,PCR ,板的量用 法扩增获得足够的探针模板从 中
25 ng / mL ,,而 这个浓度则比较合适信号明显背景 1 g 。,取 μ进行标记其次是标记时间为便于后续试
,清亮说明按照之前定量的方法可以比较精确地获 ,验杂交液中探针浓度的确定我们将标记反应时间
( 25 ng / mL) 。得合适的探 针 浓 度用该合适探针浓 20 h。定为 通过固定起始模板量和标记时间这两个
,度的杂交液对正式酶切的样品进行检测通常都能 ,a6 、c1 、n6 ,参数在对 等不同基因探针进行标记后
。得到理想的结果
Southern blot ,的 检测因 此尝试了对探针进行剥离
。 , 和对尼 龙膜进行反复 使 用剥 离 探 针 时要 着 重
: ; 注意两个方面一 是如何剥离干净二 是 如 何 少 损
DNA。,失膜上的 为 剥 离 干 净需要在杂交和检测
; NaOH / SDS 过程中始终保持尼龙膜的湿润用 溶
,液处理尼 龙 膜 时要保证溶液与尼龙 膜 正 面 充 分
,。 接触推 荐使用杂交管 和杂交炉来剥离探针为
DNA ,、减 少 膜 上 的 损 失需要调低杂交管的转速 。缩短剥离时间 M, DNA Marker; 1, pBI4ABC;分 子 量 质 粒
2, pBI4ABC EcoR I ;单酶切回收的大片段 ( 3) 10 ,结果图 显示对尼龙膜进行 次探针剥离
图片下方的数字代表探针浓度,11 ,处理即可以对同一张膜进行 次的反复使用并
图 2 探针浓度对结果的影响11 ,且这 次的杂交结果都较为理想完全可以达到探
。,2, 3索杂交条带多态性的要求例如本研究依次使用 同一张尼龙膜的反复使用
, c2、s5、a1、n5、a6、n6、n9、cb、c1、c3a 9 转好一张尼龙膜费时费力所以尼龙膜的再生了 和 进 行 了
Southernbl ot ,s5、a1、n5 n6 试验发现 和 基因在棉花 。 具有 意 义本研究在对棉花线粒体基因组进行
。RFLP ,不同品系之间显示出明显多态性 分析时需要对同一组样品进行多个基因探针
M, DNA ; S, CMS P30A; N, P30B; R, Y18R分子量标记系 保持系 恢复系
3 11 图 同一张尼龙膜反复进行 次杂交分析
2, 4,好的杂交液反复使用来检测不同的样品不仅可以 同一份杂交液的反复使用
,,要获得一份探针浓度合适的杂交液往往需要进省去重新摸索条件的步骤避免浪费而且更容易获
。,。得重复性好的结果本研究在对不同的棉花品种进 行摸索而摸索工作比较费时如果能将一份摸索
Southernbl ot ,a1 。,行 分析时使用了同一份 基因的杂释探针浓度如果检测不到目的信号则需要从探针
。, 20? ,65? 、DNA 、、交液该杂交液 冻存每次使用之前 水标记效率样品酶切量转膜是否充分地高辛
,5 ,、浴化开即可两年内反复使用了 次每次都获得了试剂盒是否过期溶液配置是否正确等方面来查找问
( 4) 。,。,。较理想的结果 图 当杂交信号减弱背景 升 高题所在这些步骤虽然耗时但很有必要
DNA 。DNA ,,。 基因组 的酶切处理提取结束后先 进时要停止杂交液的反复使用
RNA ,行电泳以确保无明显的蛋白和 残留然后用 紫
,DNA 外分光光度计定量根据定量结果确定加入 样
。,品的量如果所检测物种的基因组较大则需要增 加
DNA 5 g 。,,酶切 的量例如拟南芥基因组较小酶切 μ
; 基因组即可得到较浓重的信号条带而棉花的基 因
,,组较大要想得到同等强度的信号基因组的酶切 量
30 g 。,通常需要 μ以上酶切结束后从酶切反应液 中
,、取出少量进行电泳检测确保酶切充分样品间亮度 一
,。,致后再进行下一步试验有研究认为酶切后的样 品
,。需要酚仿抽提但本研究认为这一步不是必需的
。 杂交时间和杂交液体积杂交时间说明书要求
4 h 18 h,,后过夜但我们认为杂交时间不要低于 本
18 , 30 h。研究所用的杂交时间是在 杂交液的用量
2 3, 5 mL /100 cm,说明书要求 膜本试验中需要对杂
,6 , 8 mL /交液反复使用所以将杂交液体积增加到 S, P30A; S1, P53A; S2, P80A; S3, S254 S4, 9648 S5,-A;-A; 2 100 cm。膜提高杂交时间和杂交液体积都可以增 强AP25MA; S6, 1081A; S7, CMSD8 N, P30B; N1. P53B; N2,-;
P80B; N3, S25-4B; N4, 96-48B; N5, AP25MB; N6, 1081B; ,,杂交效果只要保证探针浓度不变杂交液体积的 增R, Y18; 1 , 5 代表杂交液的使用次数 。,加不会提高片子背景按照经验杂交液反复回 收4 5 图 同一份杂交液反复使用 次后的杂交效果5 ,。使用 次不会明显影响杂交效果
。: 洗涤时间洗涤步骤分两步一是杂交 结 束 后 3讨论
SSC / SDS / : 用 溶 液 洗 涤二 是 加抗体后用马来酸 DIG Southernbl ot 将基于 化学发光法 试验中的
Tween20 。,溶液洗 涤这 两 步 的 时间都可以延长特 :注意事项根据重要性不同进行如下排序
。25 ng / mL 。 DIG 探针 浓 度的浓度非常重要/ Tween20 。别是马来 酸 洗 涤 步 骤地 高 辛 与 抗 体 的
Southernbl ot 化学发光法的 试验最常见的问题是试 ,/ 结合 力 是 比 较 牢 固 的我 们 曾 将尼龙膜用马来酸 ,,验初期片子背 景 高其主要的原因 就 是 探 针 浓 度 Tween20 55? 2 h,溶液在 高温洗涤了 但最后得到的杂 交。1 g 过高如果控制好标记反应的模 板 量 μ和标记 。信号仍然比较强通常将膜放在杂交管里或大培养 皿20 h 20 ,L ,时间 这两 个 条 件在 μ反 应 体 系 中最 后 / Tween20 ,里用马来酸 溶液室温洗涤一整夜这样不 仅2 300 gn。的探针产量大概都可以达到 根据这个估 测,可以得到重复性较好的结果而且使试验时间的安 排,N mL,的产量如果杂交液体积是 那么所需的探 针量。更有弹性 { ,( 25 ×N ) /2 300,× 20 } L。就是μ如果想要 得到。Blocking buffer ,尼龙膜的封闭要足量封闭时 ,,较理想的杂交结果则需要对杂交液进行预试 验即,。间要延长这有助于降低背景封闭液的用量可以 ,Marker ,,配一块胶只加 和阳性对照快速电泳 后进2 ,80 cm在说明书要求的基础上稍微多加例如 尼龙 。, 行转膜杂交如果最后得到的片子背景清亮信号2 ,100 cm100 mL,膜封闭液可以使用 膜的用量为 并 且,。清晰则杂交液可以用来进行正式试验如果背 景较2 h。封闭时间不短于 ,重则需要往杂交液中添加适量的预杂交液来稀
。 标记探针时注意事项探针标记效果直接影响
200 ,。信号强 度本 研 究所用探针模板的长度为 ,的凝胶颗粒从而避免杂交过程中凝胶颗粒非特异
1 300 bp,。,。 探针模板太短会降低杂交信号探 针 模结合抗体产生大黑点
PCR 200 50 / × 4 。,UV ,L ( L 板一般用 法 制 备μμ管 交联方法研 究 发 现交 联 法 要 好 于 干 烘 )( 120? ,30 min; 80? ,120 min) ,30 W 管法或 使用 的 紫 ,4,PCR ,30 L ,,40 cm,1 min。反应 液经 凝 胶 回 收 用 μ洗 脱可 以 保 证外灯管与尼龙膜相距 照射
100 ng / L ,10 1 g,CSPD detection buffer L 。μ以上的浓度取 μ即可达到 μ这的 使 用 方 法将 膜 在 中
20 16 , 10 =L ,( ,CSPD,样在 μ标记反应液里可以最少留出浸透放到保鲜膜上后要马上往膜上滴加 防 止 ,5,,( ) 。6) L ddHO,膜变干燥导致背景高呈现圆形灰斑 μ的体 积 给 以 稀 释 探 针模板中的标记 2
( 。,反应抑制物或干扰物如凝胶纯化过程中残留的凝 探针的剥离尼龙膜每次使用完以后要 尽 快
,。) 。,( 1 #) 剥离探针然后湿润保存剥离探针的方法是将膜 胶颗粒标记时标记反应液 试剂盒中的 管
,2 0? ,0, 2 mol / L NaOH /0, 1%SDS,37? ,,每次 用完后要及时放回 冻 存防 止 其 中 的 放在杂交管 里 Klenow ,Klenow 酶 失 活因 为 酶的活性是确 保 标 记 15 min,,2 × SSC 。洗两次然 后 用 浸 泡 后 备 用增 加
。, 效率的关键因素探针标记反应之前和之后都需要 尼龙膜的使用次数可显著降低试验成本如果一张
,DNA 10 Southernb lot,煮沸每次煮沸时管中的 溶液都会蒸发到管盖 膜可以反复使用 次则每个 基 因 的
,6,,,,70%。内壁所以每次煮沸结束后都要快速离心一下再 检测成本可下降
。DNA ,/ ,11放到冰浴中为充分 防 止 复 性采 用 乙 醇 冰 依照 经 验一张转好的尼龙膜可反复使用 ( , 5? ) 。,,2 0? ; 5 。浴按 照 经 验标 记 好 的 探 针 在 次一份配好的杂交液可反复使用 次以上也就
,11 。; 放 置两年不会明显降低杂交效果 是说一张尼龙膜可以检测 个基因探针一份杂
50 。( ) 。15 ,交液在两年内可检测 样次由于省去了重新转胶片曝光压片时间试剂盒中要求压片 30 min,40 g DNA South-DNA 、、、,但本研究在用 μ棉 花 总 做 膜所需的 提取酶切电泳转 膜以 及 重 新 摸 ern blot ,2 h。CSPD 时平均的压片时间是 发光底物, 索探针浓度所需的预试验等繁琐步骤尼龙膜和杂
,24 h ,。 经碱性磷酸酶催 化 后可 以 持 续 发 光 以 上在交液的反复使用可明显加快试验进度
,。 这期间可以 进 行 多 次 摸 索以获得最佳曝光效果
参 考 文 献 CSPD ,我们发现加上 后发光强度在一定时 间 内 是
,1, Neuhaus-Url G,Neuhaus G, The use of thenon radioactive digoxige- 。,11 , 13 h 逐渐提高的例如第 之间的发光强度高
nin chemiluminescent technology for plant genomic Southernb lot hy- 1 , 3 h ,。于第 之间但背景值也相应升高冲洗胶片 bridization: a comparison with radioactivity, Transgenic ,3 min,30 s 。时显影 定影 即可红光灯很容易漏光 Research, 1993,2( 2) : 115-120, ,,导致胶片背景灰暗所以可以不用红光灯事先开灯 ,2, Huang J,Ge X,Sun M, Modified CTAB protocol using a silica ma-
,。熟悉一下每种容器的位置然后关灯洗片 10 000。,r /抗体 处 理抗 体 在 使 用 前要 预 先 trix for isolation of plant genomic DNA, Biotechnique,2000,28( 3) :
432-434, min,4? ,5 min。离心 该步骤可降低片子背景中的 ,3, DW, ,M,, 3 , J,萨姆布鲁克 拉塞尔 分子克隆实验 指 南第 版黄 。1 ? 1000 0,黑点颗粒试剂盒中推荐的抗体浓度是 ,, : 2002: 487515,,-培堂译北京科学出版社 ,1 ? 12 降低抗体浓 度 可 减 轻 背 景 值所 以 选 用 ,4, Allefs JJ,Salentjin EM,Krens FA,et al, Optimization of 500。 nonradio-
1, 6 20 mL Blocking buffer L 。即取 μ抗体加到 中 active Southernb lot hybridization: single copy detection and reuse
of 。,, 电泳方法推荐低电压长时间电泳本研究采
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