RT-qPCR原理

RT-qPCR原理 Quanti,cation of mRNA using real-time RT-PCR Tania Nolan1, Rebecca E Hands2 & Stephen A Bustin2 1Sigma-Aldrich, Home,eld Road, Haverhill, UK. 2Institute of Cell and Molecular Science, Barts and the London, Queen Mary’s School of Medicine and Dentistry, University of London, Whitechapel, London E1 1BB, UK. Correspondence should be addressed to S.A.B. (s.a.bustin@qmul.ac.uk). Published online 9 November 2006; doi:10.1038/nprot.2006.236 中文翻译(原理) 实时RT-PCR定量测定mRNA 实时RT-PCR应用于明确要求定量数据分析的分子医学、生物工程、微生物学和诊断学定量测定mRNA所用的的方法。尽管他被描述成“黄金” 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ，但他还远远未达到成为标准检测的程度。由RNA模板的多变性、含量测定的设计和 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 造成的很重要的问题，与不恰当的数据标准化和数据分析一样，也是被众人所知却又忽视掉了。标准化的第一步，我们描绘了一系列RT-qPCR草案的基本的技术步骤，要求产生的数据具有可靠性和重演性。我们更愿意强调说，无论如何，RT-qPCR数据只是关于一个细胞或组织给定转录物的量的快速测定的信息。任何可变的mRNA水平的生物结果分析必须包括关于调节RNA、蛋白含量和蛋白活性的附注信息。这里描述的整个试验，包含了最初的含量设计到qPCR数据分析，需要大约15小时。 INTRODUCTION RT-qPCR包括三部分:?依靠逆转录酶将RNA转变成cDNA; ?用PCR扩增cDNA; ?实时监测和定量测定cDNA的量 尽管已经选用为定量测定RNA的方法，这种含量测定的安全性依然值得商榷。首要的是以下几点:?结果依赖于模板的量、质量和最佳的方案设计;?逆转录反应不是标准化的，因此，可能多变性高;?数据分析高度主观化，如果操作不恰当含量测定的结果就会混乱。因此，通过质量评估每一个RT-qPCR组分含量和保持数据分析的统一性来降低多变性和扩大重现性是必要的。基因表达测定标准化明确要求，与人类临床诊断分析有显而易见的关系。因此，我们关注这个实验的遍及整个实验指导的质量控制。 THE ASSAY RT-PCR (qPCR)在单管PCR的扩增和测定步骤结合使用荧光指示染料。含量的测定依赖于测定增加的荧光信号，其强度与每一次PCR循环的产物量成正比。此外，在单次反应中，用不同染料标记的探针能够监测和定量多标记的目的基因。在一次循环中，单次PCR荧光第一次超过既定的或背景荧光阈值，这个参数就称为循环阈值(Ct)或交叉点(Cp).起始浓度越高，Ct值越小。当维持PCR分析滴定终点敏感性和特异性时，这种荧光和扩增物的相关性使目的基因能够在一个较大的范围内被精确定量。闭管(均质)形式消除了扩增后手工操作的需要，显著的减少了手工操作的时间和污染的风险。 Current problems 这种技术的广泛应用造成大量的可定量测定数据的方法的产生，利用?新鲜的、冷冻的或FFPE样品;?整体活组织检查、显微切割、单个细胞、组织培养细胞;?总RNA或mRNA;?一系列不同cDNA引发机制;?不同的酶或酶切反应体系;?不同效率、灵敏度和活跃的检测?多样的检测试剂、反应条件、热循环仪?个人的分析方式及报告方法。每一步都明显不具有标准化的检测，在样品处理、对照的使用、数据处理和质量控制处理的不同使这种不标准化进一步加剧，并且与RT-qPCR的可靠性、相关性和重复性有及其密切的关系。 理想的情况是，在每一步引入不确定的实验设计时，要通过比较所有可能的实验方案得出。显然这种方法的并不现实，我们提出一系列基于现在的一些想法试验方案，每一步都包含在内。逐一讨论样品的选择、储存和RNA的提取已经超出了本文的范围，我们将在别处予以介绍。本文从RNA的提取开始。我们相信这些试验方案将为大多数研究人员所接受并且能够产生可靠的数据。在每次试验中，每一个推荐的特定的试验方案的都会经过验证，但是不同的应用可能需要许多修改以适应特定的使用者。RT-qPCR操作和替换步骤的整体考虑如图2所示。 RNA assessment 常用的定量测定RNA的方法有很多，每年选修EMBO qPCR课程的学生一般会比较用Ribogreen、Agilent BioAnalyser、分光光度计、Nanodrop及现在使用更多的BioRad Experion 用以测定相同的RNA样品。结果显示，没有任何两种方法会产生相同的数据，比较用不同方法获得的数据是不明智的。这得出这样一个结论，谨慎的做法是用同一种方法测定所有的样品并加以报道。 RNA quality RNA质量包含两方面的内容，纯度(无蛋白、无DNA污染、无抑制因子)和完整性。传统意义上RNA质量通过分析其在A260/A280时的比率，和/或分析核糖体RNA在琼脂糖凝胶上的条带以及一个最新的方法Agilent Bioanalyser/BioRad Experion micro,uidic capillary electrophoresis systems。一个近期的报道声称，通过测定Agilent2100一些电泳图谱，包括测定这些区域的18S and 28S RNA片段，28S顶点高度，快速反应区比例和标志高度，并用这些计算每一个RNA样品的完整数(RIN)，可以更加客观的测定RNA的质量。然而，通过RT-qPCR分心操作得出的关于RNA样品完整性的详尽分析却得出不同的结论。作者提出， 通过大量的组织样品提取的RNA样品，将他们控制分解并用Agilent Bioanalyser进行分析。这些样品的RIN在10(表面上完整的材料)到4(几乎无法 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 是rRNA)之间。这些样品的每一个转录物的质量都会被RT-qPCR验证。在一些组织中检测到的转录物的质量不受RNI的影响，反之，一些具有线性关系或其他具有阈值效应的会受影响。严格来说，对于不同的组织其转录物的质量和RNI值之间的关系是不同的，并且这些因子间并没有可预见的关系。作者推断适度减少RNA样品能够增加分析和定量的可靠性，只要扩增子保持较短的状态(<250bp)并且不受内部影响标准化表达。这两个报道的差异可能是由于RIN和作者提倡的使用RINs的参考基因表达值之间相对较弱的相关系数(0.52)。 由于缺乏一种可选择的可靠地mRNA完整性的测量标准，我们提议用GAPDH(NM_002046)从3’到5’端对目的基因进行测定。许多年来，获取的数据不依赖于rRNA的完整性，需要提供一个合理的检测目的转录物分解量化标准和规范采用微点阵使用者以及长期来被接受及常用的适用于PCR终点分析的标准方法。对无所不在表达的mRNA完整性从3’到5’端分析测量，已被GAPDH基因特异的证实，它被认为是在一个给定的样品中所有mRNA完整性的代表。然而，因为不同的mRNA降解率不同，这不可能总是作为范例，并且对于特异的目的基因设计相似的试验方案是必要的。1.3 kb GAPDH mRNA的实时反应用oligo-dT作预处理，用单独的多重PCR分析测定，三重目标扩增水平的量。空间分离一个是在mRNA的5’端，第二个在中间，第三个在3’端。扩增比率反映了oligo-dT预处理的实时反应沿着整个始转录物起前进是否成功。明白地说，RT酶从5’端扩增的进行依赖于mRNA的完整性，如果mRNA降解了，酶就无法完成。显然，3’:5’的比率接近1表明其高度完整，反之，任何大于5的比率说明mRNA的分解。这个实验分析用TaqMan 试剂(如:每次扩增由目标特异性差别标记探针进行检测)设计成三重分析。 Inhibitory components(抑制元件) 抑制元件逐渐在生物体内被发现，并造成qPCR在灵敏度和动力学方面的显著降低。抑制因子可被用于生物样品中核酸的抽提或样品共纯化，例如胆盐、尿素、血红素、肝磷脂或IgG.。最乐观的情况是，抑制因子造成不精确的定量测定结果;而最糟糕的是高度抑制会产生假阴性结果。最常用的解释样品间PCR效率的不同的方法是扩增参考基因，并联报道基因，将他们的表达水平。然而，这两种方法假定两种分析是在同一抑制水平。在绝对定量测定是问题会更加显著，此测定外部校正曲线常用于计算试验样品转录物量，并常用于病原体的定量。一些或全部生物样品可能包含有抑制因子，这些抑制因子并不存在于用于建立核酸标准曲线的样品中，这导致待测样品中的mRNA被低估。应当进一步关注是，FFPE样品提取的核酸毋庸置疑的会进一步加重mRNA被低估的情况。显然，这些抑制因子更容易影响任何定量数据的比较。然而，最近的一个调查发现，只有6%的研究人员检测他们的核酸样品有无抑制因子。 生物样品中抑制因子的的检测有不同的方法。在一个样品测定中PCR的效率可以通过连续稀释的样品分析检测，尽管当样品很少的时候是不现实的。例如，显微切片得到的单个细胞。此外，还有在数学上计算PCR效率，即分析扩增回应曲线的方法。共纯化和共扩大目的核酸的IAC能够检测抑制因子及显示在处理过程中模板的损失。另一个方法利用整个细菌基因组来检测临床样品中的抑制因子。最近，我们描述了一个命名为SPUD31的qPCR参考试验方案。它通过逆转录或PCR步骤检测抑制因子，即通过记录有义链扩增的拷贝数的Ct特征:一个人造扩增子(SPUD-A)被扩大成用两个引物(SPUD F和SPUD R)和用TaqMan 探针(SPUD P) 检测到的样品。在水溶液中，Ct值记录一个无限制反应的特征(例如，25左右)。 伴随这个包含SPUD扩增子的反应，在RNA样品中进行的反应包括完全相同成分(SPUD-A, SPUD 引物以及SPUD 探针)。当与那些没有RNA的样品比较时，RNA样品中潜在的抑制因子导致这些反应的Ct值变高。 Reverse transcription反转录 RT-qPCR分析可以用单管进行逆转录和PCR或用一个或两个管分开进行逆转录和PCR。逆转录酶和cDNA引发机制的选择已经在别处被很好的考虑和讨论。由于逆转录酶的效率依赖于靶标和逆转录酶的选择，如果实验室间想要比较实验结果，用相同的酶、引发机制和试验条件是很重要的。在2004-2005年，ABRF研究的主题是cDNA的引发机制，并且每一个实验方法都有其优点和缺点。由于并没有一个最好的运行机制，在逆转录阶段，我们搜集了包含随机引物，oligo-dT和基因特异性引物的试验方案。 Single RT and PCR enzyme 单独的酶，例如Tth聚合酶能够作用于RNA-和DNA-依赖的DNA聚合酶，并且用于不需要再次附加物的单管混合反应。它主要的优点是减少了手工操作的时间和污染的可能性。它也有一些缺点。第一，由于在反应开始时所有的试剂都被加到管里面，这就没有了优化两个不同反应的可能性。第二，只有用目标特异性引物才能够进行分析。第三，测量的灵敏性会降低，可能是由于Tth聚合酶的转录活性效率降低。第四，最彻底的研究即比较两种操作发现，这个反应的特征是由大量的引物二聚体聚集造成的，这可能造成定量测量的真实结果被隐藏。我们发现将变性温度降低到92.1?，并将扩增设计的尽可能短能够减少这些问题。这可能是因为这种酶比Taq聚合酶的热稳定性稍低。 Separate RT and PCR enzymes 反应可以是偶联(单管)或非耦联的的(两管)。在偶联反应中，逆转录酶在高dNTP以及目标特异性或oligo-dT引物存在的情况下合成cDNA。伴随着逆转录反应，PCR buffer (无 Mg2+)、耐热的DNA聚合酶和序列特异性引物的加入，PCR开始在同一试管里进行。在非偶联反应中，逆转录酶在第一个管中合成cDNA，在优化条件下，用随机、oligo-dT或序列特异性引物合成。逆转录反应后将组分转到另一个含有DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液和PCR引物的管中，RCR将在适合DNA聚合酶的条件下进行反应。当试验是正常进行，中段分析两种酶反应体系的不同可能是很小的，其相关性在0.974 到 0.98835。这种方法的缺点是?在两种酶/单管反应中，在转录过程中，病毒逆转录模板开关活性会产生错误结果?还有另外的污染的可能性，甚至在失活后逆转录酶依然可能会抑制PCR反应，导致高估扩增效率和结果定量。 然而作为平衡，对于研究程序来说，增加的弹性、敏感性和优化的潜在可能性，使两次酶反应优于单次酶反应。在诊断上来讲，手工操作时间和污染可能性的减少可能使单管酶反应更加适合。 cDNA priming 在一个单次反应中，随机引物或ligo-dT引发机制都会产生一个典型的cDNA库。然而，实验显示用随机六聚体引物引发机制的实验，样品中所有的靶标的逆转录效率不相同，并且当测量靶标时，加入的样品量和cDNA之间并没有线性关系。一个关于不同长度随机引物RT引发机制效率的比较显示，15-nt-长的随机寡核苷酸链，产生的cDNA的量至少是随机六聚体的两倍。15-mers在引发时更加有效，结果是逆转录反应高于模板的80%，相较于随机六聚体引物诱导的逆转录反应只有40%。不用惊奇，这造成在整个转录组DNA芯片的一个数量级有更多的基因被检测。当然，我们建议用15-mers随机引物引发cDNA合成反应。然而，由于作者没有说明线性的问题，这种改变是否能够克服随机六聚体方法的特殊的限制依然存在。 Oligo-dT引物只能用于完整的RNA。即使如此，cDNA分子可能被截断，因为RT酶不能够有效作用于高度结构化的区域。因此oligo-dT引发机制应朝着3’端进行转录。对于那些需要检验剪接变体、有长的3’ UTR区域或那些没有polyA序列的实验来说，这是一个不恰当的选择。此外，当用来自福尔马林的组织切片提取RNA时，不推荐oligo-dT引发机 制，因为甲醛固定会造成mRNA40 polyA尾的丢失。目标特异性引物是最特别最灵敏的方法 目标特异性引物是将mRNA转变成cDNA最特别最灵敏的方法，当RNA质量是限制因素的时候我们推荐使用这个方法。即便如此，一个最近的报告显示， 用多轮串联PCR方法，可以用特异性引物将72个基因从有限的RNA样本中进行特异和可靠地扩增。尽管如此，与随机引物一样，单个逆转录反应的效率也可能有所不同。通过将未知样品与校正样品(当使用DDCt分析时)或标准曲线关联分析，将这些反转录效率的差异置于可控状态。的不同稀释浓度RNA样本的特异引发和其cDNA产物呈线性关系，因此，这种引发方式的另一个优点是RT-qPCR的反应效率可以通过标准曲线的梯度分析得到确定。一个非常重要的对照是在每个板上加一个校正样品或一个标准曲线样品，用于测定批间差异，这些差异可能源于多个样品在不同板上进行反应。 PCR 条件优化 试验的优化时获得更好灵敏度、特异性、重复性和一个较大的线性动态范围的关键。幸运的是，由于RT这一步差异很大，尽管在非最佳条件下，qPCR不同重复的差异较大，但是在最适条件下，qPCR有很好的重复性。 由于引物的不同以及引物浓度的不同导致了引物和靶标二聚体的热稳定性的不同。因此，可以得到优化的杂交和引发机制的引物浓度是很重要的。尽管，优化PCR反应常被作为分析测定发展的基本部分，在许多试验室，关于高流通量和快速数据报告的最近动态已经使这一步被去除。实际上，一些制造商上声称，如果用他们的特殊的标准混合物，优化引物浓度是不必要的。然而，我们很清楚潜在于最初的推荐的原理依然是有效的，引物浓度的优化可以显著的改进分析测定的敏感性。 我们建议用荧光核酸染料，例如SYBR Green I 或EvaGreen，与分析扩增曲线和融解曲线联结以优化分析。融解曲线是一个强大的工具，一个精确地鉴定扩增物和将其与引物二聚体和其它小的扩增的人工产物。DNA融解是在一个特定的温度，叫做解链温度(Tm)，定义的是一半DNA的双链结构被破坏时的温度。DNA分子的解链温度依赖于它的大小和核酸组成;因此相较于AT碱基对较多的扩增子，GC丰富的扩增子有较高的Tm值。在融解曲线分析时，当从一个低于样品Tm值的既定的温度开始慢慢加热到高于他们的解链温度时，实时设备会连续的检测每一个样品的荧光。荧光染料在双链DNA变性时释放，为每一个单链扩增子的产物提供准确的Tm值。融解峰的计算通过分析融解曲线的第一个负导数(–dF/dT)差别。这些顶点值类似于电泳凝胶上的条带，能够定量检测在一次循环结束的时候产物量。短的引物二聚体比较长的靶扩增子的温度解链低。 Conclusions 我们所提倡的下述方法，常用于确保最佳的重复性。在已发表的报告中，他们的广泛的使用和丰富的内容构成标准化程序的发展的进步，减少不同研究的不确定的外界因素。 ? 当定量检测来自活组织mRNA水平时合适的样品的选择是生物学上有意义数据获取的 基本标准。我们强烈建议使用显微切片时将定量和表达数值关联起来。 ?使用引物(50–600 nM)评定任何一个待测RNA的质量以用于定量测定是最基本的。尤其是，在所有的出版物中，应当提供的的数据是每一个样品无抑制因子存在时的数据，例如细胞中的RNA，RNA整体。 ?应当用单独的试验测定RNA的质量，用于RT反应阶段的RNA的量应该是尽可能保持恒定。 ?cDNA引发试验应当是连贯的，有特定的首选的引发条件，以及恒定的时间(越短越好)和反应温度(越高越好)。 ?标准化应当是用已知的内部对照基因，如果使用的话，必须保证每一个试验设备和恰当的 数据包含在每一个出版文章里。 ? 序列特异性标准曲线的扩增应当进行分析和报告数据，以揭示每一个RCR扩增的效率和敏感性，确定在这个分析的动态范围内任何一个未知样品的定量。 ? 阴性对照中的任一信号测定应当通过融解曲线或其他的分析来进行报道和证实。 ?当报道的数据作为一个相关的改变(例如，用DDCt分析)，应当证明目标测定的Ct值的范围。 一个更加详尽关于这些和其他的讨论可以在其他的地方找到以及在线看。关于RT-qPCR 操作规程 操作规程下载怎么下载操作规程眼科护理技术滚筒筛操作规程中医护理技术操作规程 重要的实用性考虑的要点见框1所示。