酶法改性大豆分离蛋白对乳化性能的影响

1 前言 1.1 立题背景和意义 大豆是我国的主要农作物之一，尤以北方种植甚为广泛，因为它兼备食用油脂资源和食用蛋白资源的特点，深受世界各国的青睐，我国也先后制定了“大豆行动 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 ”、“大豆产业发展计划”、“大豆专用品种种植”等多项计划，这些计划的全面实施，使我国豆制品的生产和市场发展呈现出欣欣向荣的景象，大豆食品越来越得到广大消费者的认可和青睐。大豆蛋白质无论从营养组成、资源丰富还是加工技术方面来看，都是人类最为熟悉、安全和经济的植物蛋白质资源。 大豆蛋白在国内资源丰富，除了部分被直接加工利用外，大部分存在于油料工业的高蛋白副产物豆粕中。长期以来，由于上游加工路径、本身性能等原因，导致豆粕深加工程度比较低。国内大豆蛋白资源越来越多，绝大部分用于饲料、酿造、水解蛋白等附加值相对比较低的场合，而附加值略高的食品蛋白类配料功能产品，目前仅仅生产浓缩蛋白和分离蛋白，主要用于肉制品工业，产能极少。分析造成这种局面的主要原因是大豆蛋白尽管具有价格便宜，也具有一定的功能性质，但是各种性质例如：起泡性与蛋清蛋白、乳化性与酪蛋白酸钠等天然优良性能的蛋白质相比还有很大的差距,导致其在现代食品加工中的应用受到一定限制。本文以大豆分离蛋白为原料,主要研究碱性蛋白酶对其乳化性的影响，对于提高大豆蛋白的使用价值具有重要的现实意义。 1.2 大豆分离蛋白的组织与结构 大豆蛋白是一种质优价廉、来源丰富的植物蛋白。大豆蛋白分子中存在大量的氢键、疏水键和离子键，同时具有许多重要的功能特性，使得大豆蛋白具有较好的成膜性能。 大豆蛋白，除了有少部分生理活性的蛋白之外，主要是贮存于子叶亚细胞结构—蛋白体中的蛋白。大豆分离蛋白主要包括7S和11S两种球蛋白成分，其中按不同物化性质，7S又包括β大豆伴球蛋白，r大豆伴球蛋白和碱性7S球蛋白，其中以β大豆伴球蛋白为主要成分，而11S球蛋白就一种。所以，大豆分离蛋白又常常被描述成由大豆球蛋白和β大豆伴球蛋白组成，就分别指11S和7S球蛋白。大豆分离蛋白的主要组成元素为C,H,O,N,S,P，还含有少量Zn, Mg, Fe, Cu等，它是由甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、脱氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸等20种氨基酸以肽键相结合而形成的天然高分子化合物。由20种氨基酸按一定的顺序以肽键相连形成的多肽链是大豆蛋白质分子的一级结构。二级结构是指蛋白质分子中多肽链主链骨架的空间构象。 1.3 大豆分离蛋白的功能特性 大豆分离蛋白的功能特性是指蛋白质在食品加工中，如制取、配制、加工、烹调、贮藏、销售过程中所 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现出来的理化特性的总称。其功能特性主要有乳化性、水合性、吸油性、胶凝性、溶解性、发泡性、粘性、结团性、组织性、结膜性、调色性等十一大功能，现分述如下： ①乳化性    乳化性是指脂肪乳化的形成和稳定乳化是液液两相体系间疏水液滴被液相所包围,分离蛋白质具有乳化剂特征结构,即两亲结构,在蛋白质分子中同时含有亲水基团和亲油基团。在油水混合液中,分散蛋白质有扩散到油水一界面趋势,且使疏水性多肽部分展开朝向脂质,极性部分朝向水相,因此,大豆蛋白质用于食品加工时,它是一种表面活性剂,可稳定乳化状态从而延长货架时间。 蛋白质乳化性能取决于两个因素以降低界面张力的能力在油——水界面上,蛋白质吸附所造成界面张力大幅降低。成膜能力该膜起着静电、结构和机械的屏障。乳化形成取决于快速解吸作用,在界面上展开及重新定向,其稳定能力性是通过界面自由能的降低和膜的流变性质决定的,后者起因于水合程度和分子间相互作用。 乳化性是大豆分离蛋白的一种重要的功能性质，包括乳化活性和乳化稳定性两个方面。乳化活性是指蛋白质在促进油水混合时，单位质量的蛋白质(g)能够稳定的油水界面的面积(m )。乳化稳定性是指蛋白质维持油水混合不分离的乳化特性对外界条件的抗应变能力。按照表面活性剂分类规则，大豆分离蛋白属于典型的氨基酸型表面活性剂。大豆蛋白的表面活性是大豆蛋白最重要、最基本的性质之一，在实际应用中则表现为乳化功能， 即能显著地降低油、水或空气、水的界面张力。大豆蛋白具有一定乳化能力，能使脂肪和水形成稳定的乳胶体系。 影响乳化性能因素很多如蛋白质变性程度、蛋白质种类、可溶性蛋白质浓度、pH值、离子强度、温度、糖的存在、低分子量表面活性剂存在等。 就大豆蛋白质本身而言,变性与否乳化性相差很大,变性蛋白质乳化特性往往明显下降。不同蛋白质组分,乳化特性也不一样,蛋白比蛋白更易形成稳定乳状液。含量高的大豆分离蛋白较高乳化能力与较高疏水性相一致。在蛋白质溶解度和乳化能力或乳状液稳定性间常存在一致的关系。 可溶性蛋白质能够扩散并吸附在油水界面,这是决定它们乳化性质最重要特征。不溶性蛋白质对乳化作用影响很少,这或许是由于在实验中蛋白质在它的表面性质能起作用之前必须先溶解和移动到界面。热聚集的不溶性大豆蛋白质比起相应的可溶性蛋白质来说是效力较低的乳化剂,然而,一旦乳状液形成,不溶解的蛋白质粒子也起着稳定乳状液作用。对分离蛋白而言,只有当氮溶解指数值近80%时,才能起到良好乳化效果。 pH以各种不同方式影响着蛋白质乳化性质。大豆蛋白在远离等电点pH时表现出较好乳化性质。如将天然大豆分离蛋白pH由7增加到9时可提高其乳化性能。 加热处理通常能降低吸附在界面上蛋白质膜的粘度和硬度,因而降低乳状液稳定性。然而,高度水化的界面蛋白质膜的凝胶作用提高表面粘度和硬度,从而稳定乳状液。如经过一段时间热处理的大豆分离蛋白具有最好的乳化性能,这类大豆分离蛋白具有较高的表面疏水性和溶解度。此类改性可源于聚集解离程度的改变或大豆分离蛋白中盐含量不同。 大豆分离蛋白部分水解可提高其溶解度、乳化能力及经历热聚集的能力,增加表面疏水性,提高大豆分离蛋白的溶解度和乳化活力。 多糖的添加对影响乳化稳定性很大,它是通过液相介质的流变性质改变及其与为蛋白质所包覆的油滴相互作用来实现的。蛋白质——多糖分散相可作为乳化剂来应用,以使有可能生产具有低含油量、高营养价值的新食品。 加入小分子表面活性剂,由于降低蛋白质膜的硬度和减弱使蛋白质保留在界面上作用力,因此,通常会有损于由蛋白质稳定的乳状液稳定性. 对于大豆分离蛋白的乳化特性的研究，国内外的研究已相当多，但有关大豆分离蛋白乳化性的影响因素研究较少。因此，本文对影响大豆分离蛋白的乳化性的外部因素如Ph、离子强度和温度等进行研究，以期能更好地发挥大豆分离蛋白在食品中应用的乳化特性。 ②水合性    大豆分离蛋白沿着它的肽链骨架，含有很多极性基，所以具有吸水性、保水性和膨胀性。 ③吸油性    分离蛋白吸收脂肪的作用是另一种形式的乳化作用。分离蛋白加入肉制品中，能形成乳状液和凝胶基质，防止脂肪向表面移动，因而起着促进脂肪吸收或脂肪结合的作用，可以减少肉制品加工过程中脂肪和汁液的损失，有助于维持外形的稳定。吸油性随蛋白质含量增加而增加，随pH值增大而减少。 ④胶凝性(又称凝胶性)    大豆蛋白质的分散物质经加热、冷却、渗析和碱处理，可得到凝胶。其形成受固形物浓度、速度、温度和加热时间、制冷情况、有无盐类巯基化合物、亚硫酸盐或脂类的影响。 ⑤溶解性    是指蛋白质在水溶液或食盐溶液中溶解的性能。其溶解的程度称为溶解度。平时所说的溶解性一般指水溶性。溶解性好的蛋白质其功能性必然好，具有良好的凝胶性、乳化性、发泡性和脂肪氧化酶活性，易于食品的加工使用，掺和到食品中就比较容易。大豆蛋白质的溶解性受原料的加热处理、溶出时加水量、pH值、共存盐类等条件的影响很大。加热会导致大豆蛋白变性，降低溶解度，所以在处理原料时加热温度不能太高，或采用干法加热(即原料大豆的水分含量不高并无水蒸气存在时高温加热)。液比对大豆蛋白质溶解度的影响更大。液比在5倍以下时，蛋白质浸出率急剧下降，蛋白质分子间容易进行相互反应，使溶解性降低。一般液比在1：10左右为合适。pH值对球蛋白影响较大，在pH值4.2-4.6时，球蛋白几乎不溶解。共存盐类对溶解度也有影响，如有氯化钠和氯化钙存在时，即使在等电点范围内pH值4.2-4.6也能溶解。另一方面，一些盐类(如石膏粉)能降低蛋白溶解度，可作沉淀剂。 ⑥发泡性    发泡性是指大豆蛋白质在加工中体积的增加率，可起到酥松作用。泡沫是空气分散在液相或半固相而成，由许多空气小滴为一层液态表面活化的可溶性蛋白薄膜所包裹着的群体所组成，降低了空气和水的表面张力。 利用大豆蛋白质的发泡性，可以赋予食品以疏松的结构和良好的口感。提高发泡性可用降解剂把大豆蛋白降解到一定程度，聚合度愈低，发泡性愈好。此外，大豆蛋白的发泡性还与浸出溶剂、溶液浓度、温度及pH值有关。低脂肪、高浓度、30-35℃、pH值在10以上时，发泡最好。 ⑦粘性    蛋白质的粘性是指液体流动时表现出来的内摩擦，又称流动性。蛋白质溶液的粘度受蛋白质的分子量、摩擦系数、温度、pH值、离子强度、处理条件等因素的影响，这些因素可改变蛋白质分子的形态结构、缔结状态、水合度、膨润度及粘度。大豆分离蛋白经碱、酸或热处理后，其膨润度升高，而且粘度增加。大豆蛋白溶液的表观粘度随蛋白浓度增加而指数升高，并与试样的膨润度相关。加热蛋白到80℃时，蛋白质发生离解或析解，分子比容增大，粘度增加，超过90℃以上粘度反而减小。pH值在6-8时，蛋白质结构最稳定，粘度最大；超过1l时粘度急剧减小，这是因为蛋白质缔合遭到破坏。 ⑧结团性    是指大豆分离蛋白与一定数量的水混合时，可以制成生面团似的物质。这一性质可应用于面粉制品中如面包、糕点等产品的加工制作中，以提高制品的蛋白含量并改善其性能。大豆蛋白的面团、弹性和粘结性低，加水以50%为宜，少于50%易碎；加水过多，食品发软甚至成浆状。 ⑨组织性    是指大豆蛋白经加工处理后，其蛋白分子重新排列组合，具有方向组织结构，凝固后形成类似肉的纤维状蛋白的过程。分离蛋白本身没有类似畜肉、鱼肉的咀嚼性，只有经过适当的加工处理，才能使其具有类似畜肉、鱼肉的性质使大豆蛋白组织化的方法很多，如纺丝法、挤压蒸煮法、湿式加热法、冻结法、胶化法等，其中以挤压法应用最为广泛。 ⑩结膜性    指大豆蛋白与水形成面团后，经高压蒸煮，其表面形成一层薄膜。这层膜是水与含水剂的一个屏障，当肉切碎后，用分离蛋白与鸡蛋蛋白的混合物涂在其纤维表面，形成薄膜，易于干燥，可以防止气味散失，有利于再水化过程。 调色性    是大豆分离蛋白对制品的漂白作用和增色作用。由于大豆蛋白中含有脂肪氧化酶，在不失活的条件下可氧化不饱和脂肪酸，从而对小麦面粉中的类胡萝卜素进行漂白，使它由黄色达到无色的程度，起到漂白的作用。增色作用是指在烘烤的条件下，大豆蛋白和面粉中的碳水化合物反应发生褐变，使烘烤食品表面颜色加深。 1.4 大豆蛋白的改性 目前蛋白质的改性方法主要有物理改性、化学改性、酶法改性以及生物工程改性。物理改性是利用加热、机械作用、声波等方式改变蛋白质高级结构和分子间聚集方式，一般不涉及蛋白质一级结构；实际上，物理改性就是在控制条件下蛋白质定向变形。物理改性常用方法有：加热、高静压、超高压、超声等。 化学改性可改善植物蛋白功能和营养特性，其实质是通过改变蛋白质结构、静电荷和疏水基，除去抗营养因子，从而改善植物蛋白性质。化学改性包括氨基酸共价连接、硫醇化、酰化、磷酸化、胍基化或用酸、碱、盐部分水解以改进植物蛋白功能性等。 酶法改性技术是利用蛋白酶内切作用及外切作用将蛋白分子切割成较小分子，使其蛋白功能特性有所改变。酶法改性程度取决于所用的酶、处理时间及人们所需要功能性质，同化学改性相比，酶法改性还具有以下几个方面优点： ①酶解过程十分温和，很少或没有不受欢迎副反应或副产品； ②最终水解产物经平衡后，含盐极少且最终产品功能性质可通过选择特定的酶和反应因素加以控制； ③蛋白水解物可直接为消化不良者提供营养，易被人体消化吸收且具有特殊的生理功能及保健功能。在适当反应条件下,酶催化反应速度可以达到非酶催化反应的108～1011倍。这样可以大大降低能耗，提高反应效率，因而对生产者具更大的吸引力。蛋白水解物易被人体消化吸收且具有特殊的生理功能及保健功能，水解产物是小分子肽和氨基酸，易为人体消化、吸收，也更适于食品加工领域的应用。 酶改性用来改善蛋白质乳化性的研究非常广泛，Amro，Gammaa等研究了粟米蛋白经胰凝乳蛋白酶处理后再使用多糖交联以及TGase处理后对其功能性的影响，经处理之后的乳化性与原始蛋白相比有很大提高；Barbel和Gerd在研究中发现将小麦蛋白使用木瓜蛋白酶有限水解，水解度大于3％后，起泡性开始下降，而水解度为2．8％时，乳化活性达到最高值，随着水解度升高到3％，乳化稳定性逐渐变好，水解度在3％以上时，乳化稳定性随着水解度的提高而下降。谷氨酰胺转移酶用于改善蛋白乳化性的研究也很多，Kingsley，Y．L．Xiong等研究了小麦蛋白经胰凝乳蛋白酶有限水解后使用TGase交联显著提高了小麦蛋白的溶解性同时降低了其表面疏水性，从而对乳化性产生影响。 生物工程改性主要是指基因工程改性。基因工程改性是指应用植物育种和分子技术，改变蛋白质分子结构，进而影响其功能性质方法。广义基因工程改性包括基因工程重组、基因突变和染色体变异；狭义基因工程改性则指基因定点修饰。 目前工业上常用的蛋白改性酶为蛋白质水解酶，即蛋白酶。蛋白酶种类很多，按其来源可分为动物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶；按其pH值应用范围可分为中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶。人们已经对蛋白酶进行了深入的研究，这也是目前工业上使用的唯一的一类酶。此外，人们正在研究的用于蛋白质改性的酶有转谷酰胺酶、蛋白激酶及肽谷酰胺酶。 碱性蛋白酶是国内外研究最多的一种高效细菌蛋白酶，它由选育出的地衣芽孢杆菌生产而得，该酶的有效成分枯草杆菌蛋白酶A是一种非特异性碱性内切蛋白酶，主要作用于含疏水性羧基的肽键，催化部位是丝氨酸。碱性蛋白酶改性大豆分离蛋白时，3h内水解度即可达到25％，在低水解度范围内DH(4．5％～8．2％)，改性大豆分离蛋白的持水能力，溶解度以及乳化活力指数均随着水解度的增加而增加，泡沫稳定性、粘度随着水解度的增加而降低，起泡能力则随着水解度的增加先增大而后降低。经碱性蛋白酶改性的大豆分离蛋白的乳化性得到较为突出的改善，Kim等人研究发现水解进行30min时碱性蛋白酶改性的大豆分离蛋白的乳化性的提高幅度要比胰凝乳蛋白酶高出两倍。此外，杨晓泉等人研究发现该酶对大豆胰蛋白酶抑制剂也有钝化作用，在最适酶解条件下可钝化约60％一70％。而且碱性蛋白酶具有高度的操作安全性，符合FAO/WHO/JECFA/FAA推荐的食品级酶制剂 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 。 本课题主要利用碱性蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶解改性，探讨了影响大豆分离蛋白乳化性的因素，优化酶解工艺条件。通过单因素试验，探讨了pH、酶解温度、酶加量、底物浓度、水解时间对乳化性能的影响，并通过二次回归正交试验和方差分析优化最佳工艺条件，为提高大豆分离蛋白的功能性质，拓宽其应用面以及提升附加值提供一定的理论和实践基础。 2 材料与方法 2.1 材料与仪器 大豆分离蛋白——北京奥博星生物技术有限 责任 安全质量包保责任状安全管理目标责任状8安全事故责任追究制幼儿园安全责任状占有损害赔偿请求权 公司（蛋白质质量分数＞90%）。经测定其蛋白质质量分数91.94%（常量凯氏定氮装置）。 金龙鱼大豆色拉油——食用级，上海嘉里粮油工业有限公司。 碱性蛋白酶——北京奥博星生物技术有限责任公司。 恒温水浴锅——巩义市予华仪器有限责任公司。 低速台式离心机——上海安亭科学仪器厂。 pH-3C精密Ph计——上海精密科学仪器有限公司。 85-1磁力搅拌器——苏州江东精密仪器有限公司。 FA1004电子天平——上海良平仪器仪表有限公司。 2.2 测定方法 2.2.1 粗蛋白质含量测定：常量凯氏定氮法 原理：样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨游离，用硼酸吸收后在用盐酸或硫酸标准溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的质量分数。 消化：取大豆分离蛋白1g于100ml凯氏烧瓶中，加入硫酸钾 3g, 五水硫酸铜1g,浓硫酸20ml开始消化，约2小时后，至蓝绿色透明液为止，冷却转入100ml容量瓶定容。 蒸馏：取50ml消化液至50ml蒸馏瓶中，加入100ml水，40ml30%氢氧化钠溶液，蒸出液约70ml，接受瓶预先加入25ml4%硼酸溶液，结束后先取接受瓶，在关电源。 滴定：接收瓶中加入2滴混合指示剂，用0.1mol/L盐酸滴定。 计算公式：W=(c(V1-V2)·N/1000)/m·F·100 C －－盐酸的浓度（0.1mol/L）, V1－－消耗盐酸的体积（ml）, V2－－空白试样消耗的盐酸体积（ml）, N －－N的摩尔质量（14.01）， M －－蛋白质质量（1g）, F －－蛋白质换算系数（6.25）。 结果计算：V1=1.40ml,V2=0.35ml W=91.94% 常量凯氏定氮消化、蒸馏装置如图1所示： 图1 常量凯氏定氮消化、蒸馏装置图 2.2.2 水解度测定方法 酶解反应开始前，调节反应体系的pH至所需值，开始进行反应，反映结束后测定反应体系的pH值，用0.05N的氢氧化钠将pH调回反应前的值，记录下所用碱液的量，按下式即可计算出蛋白质的水解度： 水解度=B·Mb·(1/a)·(1/Mp)·(1/htot)·100% B －－氢氧化钠体积（ml）, Mb－－氢氧化钠的浓度（N）， 1/a－－2.26, Mp－－蛋白质的净质量， htot－－每克原料蛋白质的肽键毫摩尔数（m·mol/g）取8.2。 2.2.3 乳化性测定方法 用电子天平称取0.5g大豆分离蛋白样品，分散于5ml水中，加入5ml色拉油搅拌1分钟，2500转每分钟离心5分钟，分别测定离心管中乳化层的高度和液体总高度。两者的比值即为样品的乳化能力。 乳化能力（%）=乳化层高度·100/液体总高度。 2.4 试验方法 2.4.1 大豆蛋白的酶解工艺 按一定的底物浓度准确称取大豆分离蛋白于水解反应器中，加入适量蒸馏水，轻微搅拌至底物均匀溶解于水中。然后在水浴锅中调节温度到酶解反应温度后，用酸碱溶液调节酸碱度至所需的pH值，依据所用酶的活力单位，准确量取蛋白酶后加入水解反应器，并慢慢搅拌。反应到预定时间，即停止加热搅拌，迅速升温到85℃，加热10分钟钝化蛋白酶。用碱液滴定至水解前的pH值，记录水解过程消耗的碱液量，并以此计算水解度，再取样品计算乳化性。 2.4.2 碱性蛋白酶的酶解单因素实验 ①加酶量对乳化性的影响 称取5g大豆分离蛋白于100ml蒸馏水中，均匀分成5份，每份20ml，底物浓度为5%，在温度T=50℃，pH为8.0的条件下分别加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的酶量在50℃左右下酶解60min。 ②反应时间对乳化性的影响 称取5g大豆分离蛋白于100ml蒸馏水中，均匀分成5份，每份20ml，底物浓度为5%，加入1.5%的酶用量，在pH=8.0，温度为50℃左右下酶解，酶解时间分别为30min,60min,90min,120min,150min。 ③底物浓度对乳化性的影响 称取100ml蒸馏水，分为5份啊，每份20ml，分别加入底物质量分数为4.0%，4.5%，5.0%，5.5%，6.0%的大豆分离蛋白，加入1.5%的酶用量，在pH为8.0，温度为50℃左右下酶解，酶解时间为90min。 ④温度对乳化性的影响 称取5g大豆分离蛋白于100ml蒸馏水中，均匀分成5份，每份20ml，底物浓度为5%，加入1.5%的酶用量，在pH=8.0的条件下水解90min,温度控制分别为40℃，45℃,50℃,55℃.60℃。 ⑤pH对乳化性的影响 称取5g大豆分离蛋白于100ml蒸馏水中，均匀分成5份，每份20ml，底物浓度为5%，加入1.5%的酶用量，在温度为55℃左右下水解，反应时间为90min，pH分别为6.0,7.0,8.0,9.0,10.0。 2.4.3 酶解工艺条件优化 本试验采用二次回归正交组合设计，建立数学模型，优化工艺条件。 在单因素试验基础上，取酶用量(X1)、反应时间(X2)、底物浓度(X3)、酶解温度(X4)进行正交试验。各因素取值范围分别为：酶用量（1.0%-2.0%），反应时间（60-120分钟），底物浓度（4-6%），酶解温度（45-65℃）。取零水平试验次数为4，则星号臂长度γ=1.525。因素水平编码表如下： 表1 因素水平编码表 规范变量Zj 零水平0 变化间距△j 上水平1 下水平－1 上星臂号γ 上星臂号-γ 自然变量xj X1 1.5 0.328 1.828 1.172 2 1 X2 90 19.672 109.672 70.328 120 60 X3 5 0.656 5.656 4.344 6 4 X4 55 6.557 61.557 48.443 65 45                 3 结果讨论 3.1 碱性蛋白酶的酶解单因素结果分析 3.1.1 加酶量对乳化性的影响 试验分别在酶用量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%（E/S）的条件下进行水解，试验结果见表2： 表2 加酶量的影响 酶用量g(E/S) 0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 2.5% 乳化性（%） 41.2 47.1 52.9 43.8 43.8 水解度(%) 1.083 1.805 2.527 3.249 3.61             图2 酶加量对大豆分离蛋白乳化性的影响 以乳化性为指标，探讨在不同酶用量的情况下，对乳化性的影响，以此优化酶解工艺条件。由图2可知，随着酶浓度的增加，水解度逐渐增加,乳化性也随之增大，当酶用量为1.5%（E/S)时乳化性为52.9，之后随着酶用量的增加乳化性逐渐减小，考虑到成本价格等因素，确定1.5% （E/S)为水解反应最优酶用量。 3.1.2 反应时间对乳化性的影响 试验分别在反应时间为30min、60min、90min、120min、150min的条件下进行水解，试验结果见表3： 表3反应时间的影响 反应时间 30min 60min 90min 120min 150min 乳化性(%) 50 55.6 61.1 50 52.6 水解度(%) 1.083 2.166 2.527 2.166 2.166             图3 反应时间对大豆分离蛋白乳化性的影响 以乳化性为指标，探讨在不同反应时间的情况下，对乳化性的影响，以此优化酶解工艺条件。由图3可知，碱性蛋白酶水解大豆蛋白反应平衡极快，水解度在前90min保持增长趋势，在90min之后渐渐变小。在前90min乳化性由于碱性蛋白酶对大豆分离蛋白的水解保持增长的趋势，90min之后由于水解完全，酶也逐渐失活导致了乳化性的降低。以此确定酶解时间为90min。 3.1.3 底物浓度对乳化性的影响 试验分别在底物浓度为4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%的条件下进行水解，试验结果见表4： 表4底物浓度对乳化性的影响 底物浓度 4.0% 4.5% 5.0% 5.5% 6.0% 乳化性(%) 43.8 52.9 58.8 43.8 43.8 水解度(%) 2.034 2.408 2.712 2.962 2.717             图4 底物浓度对大豆分离蛋白乳化性的影响 以乳化性为指标，探讨在不同的底物浓度的情况下，对乳化性的影响，以此优化酶解工艺条件。由图4可知，随着底物浓度的增加，水解度持增长趋势，底物浓度为4.0％～5.0％时，乳化性缓慢增加，5.5％～6.0％时又缓慢减小，由此可确定5.0％为底物浓度时乳化性较高。 3.1.4 温度对乳化性的影响 试验分别在温度为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的条件下进行水解，试验结果见表5： 表5 温度对乳化性的影响 温度 40℃ 45℃ 50℃ 55℃ 60℃ 乳化性(%) 50 52.9 62.5 68.8 43.8 水解度(%) 2.170 2.712 3.254 3.8 3.8             图5 温度对大豆分离蛋白乳化性的影响 以乳化性为指标，探讨在不同酶解温度的情况下，对乳化性的影响，以此优化酶解工艺条件。由上图图5可知，在其他条件一致的情况下，水解度一直保持增长的趋势，到温度55℃后几乎不变，当温度高于55℃，随着温度的升高，乳化性逐步减小，50℃～55℃时，乳化值缓慢增加，当温度高于55℃后乳化值下降，由此确定最优酶解反应温度为55℃。 3.1.5 pH对乳化性的影响 试验分别在pH为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的条件下进行水解，试验结果见表6： 表6  pH对乳化性的影响 pH 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 乳化性(%) 37.5 43.8 68.8 47.1 40 水解度(%) 1.085 1.627 3.254 4.882 12.476             图6  pH对大豆分离蛋白乳化性的影响 以乳化性为指标，探讨在不同pH值的影响下，对乳化性的影响，以此优化酶解工艺条件。结果由图6可知，随着pH的增加，水解度变化较大，持增长趋势，当PH为6.0～8.0时，乳化值缓慢增加，8.0～10.0时又缓慢减小。由此可确定8.0为酶解反应最优的pH值。 3.2 二次回归正交结果分析 二次回归结果见表7： 表7 四元二次回归正交组合试验设计方案及试验结果 试验号 Z1 Z2 Z3 Z4 乳化性Y（%） 1 1 1 1 1 50.3 2 1 1 -1 -1 42.7 3 1 -1 1 -1 46.3 4 1 -1 -1 1 47.5 5 -1 1 1 -1 50.1 6 -1 1 -1 1 43.2 7 -1 -1 1 1 43.8 8 -1 -1 -1 -1 42.1 9 1.525 0 0 0 52.9 10 -1.525 0 0 0 47.5 11 0 1.525 0 0 50.3 12 0 -1.525 0 0 55.7 13 0 0 1.525 0 45.2 14 0 0 -1.525 0 43.7 15 0 0 0 1.525 40.8 16 0 0 0 -1.525 53.3 17 0 0 0 0 69.1 18 0 0 0 0 67.2 19 0 0 0 0 68.8 20 0 0 0 0 70.5             对试验结果进行回归分析，所得回归方程为： y=79.9+13.7x2-23.1x4-3.7x1x2+8.5x1x4-1.3x2x3+5.2x3x4-45.3x12-17.1x32-0.1x42 模型方差分析见下表 表8 模型方差分析 df SS MS F Significance F 回归分析 14 1501.246 107.2319 3.511067 0.086337 残差 8 310.964 38.8705     总计 22 1812.21             模型F=3.511>F（14，8）=3.24，表明模型高度显著。 相关系数R2=91%，模型拟合程度好，可以用此模型分析和预测。 最佳工艺条件： 在拟合得到蛋白质水解与乳化性关系数学模型基础上，通过软件分析得到最佳工艺条件是：酶用量X1 为2%（E/S），反应时间X2为60min, 底物浓度X3为6%，酶解温度X4为65℃，在此工艺条件下乳化值为70.6%。 4.结论 本试验研究了以Alcalase碱性蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶解改性，并探讨了pH、酶解温度、酶加量、底物浓度、水解时间对乳化效果的影响，并且采用二次回归正交组合设计，建立数学模型，优化工艺条件，得到了碱性蛋白酶对大豆分离蛋白最优条件组合：在pH为8.0的情况下，酶用量为2%（E/S），反应时间为60min, 底物浓度为6%，酶解温度为65℃，在此工艺条件下乳化值为70.6%，使乳化性得到较大提高，为大豆分离蛋白酶解产物在食品工业中的使用价值具有重要的现实意义。 参考文献 [1] 冯昌友，陈建霞．大豆蛋白及其在食品工业中的应用【J】．食品与机械，2000，2(76)：21—22 [2] 徐红华，刘欣．复合酶法改善大豆分离蛋白起泡性的工艺优化[J]．食品与发酵工业，2007，33(1)：51-54 [3] 赵威祺．大豆蛋白质的构造和功能特性【J】．粮食与食品工业，2003，2：24—28 [4] 黄友如，华欲飞，裘爱泳．大豆分离蛋白功能性质及其影响因素【J】．粮食与油脂，2003，5：12-17 [5] 邢小鹏，吴高峻，孙华．大豆分离蛋白的功能特性[J]．食品工业科技，2000，21(4)：74—76 [6] 张根生，岳晓霞．大豆分离蛋白乳化性影响因素的研究[J]．食品科学，2006，27(7)：48—51． [7] 郑家丰．大豆蛋白的功能特性研究[J]．中国粮油学报，1996(4)：21—24． [8] 刘大川，杨国燕．酶改性大豆分离蛋白的制备及产品功能性的研究啊．中国油脂，2004，12(29)：56-61． [9] 管军军，裘爱泳，周瑞宝．提高大豆分离蛋白乳化性及乳化稳定性的研究【J】．中国油脂，2003，28(11)：38-42． [10] 朱小乔，刘通讯。大豆分离蛋白(SPI)乳化稳定性的研究【J】．粮油食品科技，2003，ll(1)：l6-18． [11] 高安全，姬学亮．张二琴．大豆蛋白酶法改性研究【J】．开封大学学报，2004，(9)：92—94． [12] 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[19] 郭永，张春红．大豆蛋白改性的研究现状及发展趋势[J]．粮油加工与食品机械，2003，7：23--29 致谢 本论文是在导师肖连冬教授的精心指导和严格要求下完成的。从论文的选题、实验研究的进展到最终的完稿，肖老师都倾注了大量的心血。她精湛的专业知识、求真务实的科研态度、一丝不苟的工作作风，给我留下了不可磨灭的印象，也将潜移默化地影响着我，让我受益终生。导师在生活上也给予了我许多热情的帮助和无微不至的关怀，并教给我许多做人的道理。在此，作者衷心感谢她的辛勤培养，并祝愿她在今后的工作和生活中万事如意! 在求学过程中，感谢薛刚老师、刘尚军老师、李继红老师、程爽老师、岳春老师、王冬梅老师等在学习中给予我的关心和帮助。在此，我向这几位老师送上我诚挚的谢意和衷心的祝福。 在本课题的研究过程中，首先要感谢同学乔菲菲、韩二芳、张亚平、高戬给我在学习、生活方面的大力帮助、支持和鼓励!感谢室友在学习、生活中给予我的帮助与鼓励!感谓本组同学所带给我的快乐，让我在郁闷时打起精神!在此论文完成之际，作者要特别感谢我的父母及亲友对自己在精神和物质上的关心和支持，这是我不断进取的动力。 此外，在这里我要深深感谢培育我四年的母校，在南工我得到了真正意义上的成长。衷心祝愿母校明天更美好，桃李满天下！ 最后，我再一次衷心的感谢在求学过程中所有关心、支持和帮助过我的老师、同学、朋友和家人。我将更加努力工作和学习，以不辜负他们对我的期望。谢谢!