产腈水合酶重组大肠杆菌的质粒稳定性研究_cropped

产腈水合酶重组大肠杆菌的质粒稳定性研究_cropped ( ) 中国生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 杂志Ch ina B io techno logy, 2005 , 25 8 : 70,75 3 产腈水合酶重组大肠杆菌的质粒稳定性研究 33 史 悦 于慧敏 田卓玲 沈忠耀 () 清华大学化工系生物化工研究所 北京 100084 ( )()摘要 成功构建了腈水合酶 n itrile hyd ra ta se, NH a se高表达的重组大肠杆菌 E. coli BL21 D E3 M r M M ( ) / p ETNHKan,研究了重组质粒 p ETNH在重组菌株中的质粒稳定性 。结果表明 , p ETNH 具有较好的结构稳定性 ,连续传代 60代后质粒的基因序列没有明显缺失 ,且能够正常表达腈水合 M 酶 。p ETNH具有分离不稳定性 ,在无抗生素选择压力下 ,连续传代 48代后质粒丢失的无质粒细 胞开始出现 。琼脂糖凝胶电泳定量 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 表明 , 2 /3 的质粒 p ETNHM 以二聚体形式存在 ,导致质粒 拷贝数的下降 。进一步研究表明 ,重组细胞的连续高速分裂及腈水合酶的高表达也会造成质粒 拷贝数的下降 ,从而降低其分离稳定性 。反之 ,重组菌株相对于宿主菌株的较高比生长速率有利 于保持含质粒细胞的生长优势 ,卡那霉素的选择压力则能够保证质粒的稳定遗传 。 关键词 腈水合酶 重组大肠杆菌 质粒稳定性分离不稳定性 质粒拷贝数 微生物转化法生产丙烯酰胺是采用生物酶法生产, 本课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 组已成功地 从 诺 卡氏 菌在以前的研究中 ( ) 大宗化学品的成功范例 。红球菌 R hodococcus和诺卡 N oca rd ia YS22002 基因组中调取了腈水合酶基因 , 并提 ()() 氏菌 N oca rd ia 是该 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 中应用最为广泛的菌株 ,它们 交到 GenB ank A Y168347 。进一步通过对腈水合酶基 ( ) 体内都含有以腈水合酶 n itrile hyd ra ta se, NH a se 为 代 α因 亚基序列起始密码子进行定点突变 , 并插入表达 [ 1 ] 表的腈类代谢酶系 。在微生物法生产丙烯酰胺的流 ( ) 型载体 p ET28 a + ,成功构建了重组菌株 E. coli BL21 M r 程中 ,仍然普遍存在菌种的酶活稳定性差 、对底物和产 () ( ) D E3 / p ETNHKan, 在优化条件下 , 腈水合酶的 物的耐受性不高以及产物丙烯酰胺会向副产物丙烯酸 比活性可高达 450U /m g干菌重 , 远高于野生诺卡氏菌 [ 6 ] 进一步转化等问题 。为此 , 利用 基 因工 程 手 段 改 造 丙 的表达水平 。因此 , 该重组菌株 具 有 较 好 的 工业 应 烯酰胺的生产菌种 , 将成为今后微生物法 生 产 丙 烯 酰 用前景 ,故而其质粒稳定性研究具有相当 重 要 的理 论 [ 2,5 ] 胺的研究热点之一 。 意义和实践价值 。 重组大肠杆菌遗传背景清楚 , 载体受体系统完备 , 生长迅速 ,培养简单 , 是基因工 程 的 主 要 受 体菌 之 一 。 然而 ,克隆有外源基因的质粒载体转化到 大 肠 杆 菌 受 1 材料与方法 体细胞之后 ,会产生一系列的生理效应 , 影响到自身的 稳定性 。当利用质粒载体在大型发酵罐中高效表达某 1. 1 质粒 、菌株 、工具酶 、试剂和培养基 M种特殊产物时 ,质粒载体的丢失就意味着产量的下降 , 携 带 突 变 腈 水 合 酶 基 因 的 重 组 质 粒 p ETNH 从而给生产带来严重的后果 。因 此 , 质 粒 载 体 的 不 稳 M r )( ) ( ( ) E. coli BL21 D E3 p ETNH Kan和 重 组 菌 株 定性现象 ,一直是一个亟待解决的既有理 论 意 义 又 有 r ( )Kan均由本实验室构建 。限制性内切酶购自宝生物 实际应用价值的重要问题 。 () 工程 大连 有限公司 ; 寡核苷酸由北京赛百盛基因技 ( )术有限公司合成 ; 卡那霉素 Kan由北京鼎国生物技术 发展中心提 供 。重组 大 肠 杆 菌 的 优化 前 培 养 基 为 LB 培养基 。重组 DNA 技术 、感受态细胞制备 、质粒 DNA 收稿日期 : 2005 204 226 修回日期 : 2005 206 201 转化和 DNA 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 方 法 参 照 文 献 [ 7 ]。 ( ) 3 国家自然科学基金青年基金资助项目 20206014 , 全国百篇优 μLB K培养基为在 LB 培养基中加入 50g /m l卡那霉素 ( )秀博士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 作者专项 200345 的培养基 。 33 通讯作者 ,电子信箱 : yuhm @ tsinghua. edu. cn 构不稳定性可以通过宿主菌株的谨慎和恰当的选用来1. 2 显微计数法测定细胞总数 取 0. 01m l适当稀释的待测菌液 ,均匀涂布在直径 消除 。因此在质粒不稳定性的 研 究 过 程中 , 人 们关 注 最多的 ,通常是质粒的分离不稳定性 。 为 2. 60 cm 的载玻片圆面内 , 火焰固定后 , 滴加半滴美 M 兰染色液 ,均匀涂布 , 风干后在 油 镜 下 观 察 , 数 视 野 中 2. 1 质粒 pETNH的结构稳定性的菌数 , 共 计 数 10 ,12 个 视 野 。显 微 镜 油 镜 内 径 用 M α质粒 p ETNH是将 亚基起始密码子突变的诺卡 0101mm 精度的测微尺精密测定为 0113mm , 则总细胞 ( ) 氏菌 腈 水 合 酶 基 因 插 入 商 品 化 的 p ET28 a + 数用下式计算 : () Novagen公司 质 粒 载 体 而 得 到 的 , 插 入 位 点 为 N co I () 总细胞数 N个 /m l= 视野平均菌数 ×稀释倍 T 6 ( )和 B am H I,如图 1 a所示 ,其它常用的酶切位点如图 1 数 ×涂布面积 /接物面积 ×100 = 4 ×10×稀释倍数 × M 视野平均菌数 ( )b所示 。质粒 p ETNH的复制 、转录和表达基本继承 ( ) 了 p ET28 a + 的 性 质 , 而 p ET 载 体 系 列 的 源 头 可 从 1. 3 质粒拷贝数的测定 对一定条件下培养收获的重组菌进 行 细胞 计 数 , pB lue sc rip ts, pUC s追溯至 pBR322。对质粒 pBR322 的 然后定量 吸 取 一 定 量 的 菌 液 , 小 心 提 取 质 粒 , 定 量 上 构建过程进一步分析表明 , pBR322 内不存在任何具有 样 ,进 行 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 。采 用 计 算 机 L ISCA P 和 功能活性的转位因子 , 从而大大提高了质 粒 的 结构 稳 Im age M a ste r To ta lL ab软件分析系统定量计算样品中质 定性 。从 基 因 水 平 上 讲 , 作 为 pBR322 的 衍 生 质 粒 , 粒 DNA 的质量 ,则每 m l菌液收获的质粒的理论产量可 M 由下式计算 : p ETNH 应该具有较高的结构稳定性 。 M () ( ) 质粒的理论产量 m g /m l=细胞总数 m l×质粒 在理论分析 的基 础 上 , 进 一 步 对 质 粒 p ETNH 的 分子量 ×质粒拷贝数 ,故而 : 结构稳定性进行验证 。在 LB 培养基中对重组 E. coli M () BL21 D E3 / p ETNH每隔 6 h 进行反复的传代培养 ,约 60 代后收获细胞提取质粒 , 并对初始构建的质粒和传 代培 养 后 的 质 粒 分 别 以 EcoT22 I 单 酶 切 及 N co I 和 (μ)g /m l 质粒的理论产量 B am H I双酶切 ,结果如图 2 所示 。由图可见 , 连续传代 质粒拷贝数 = () (μ)细胞总数 m l×质粒的分子量 g 60 代后收获的质粒样品采用 EcoT22 I单酶切及 N co I和 B am H I双酶切后 , 分别获得了与初始质 粒 完 全 相同 的 2 结果与讨论 ( 预期长度基 因 片 段 E coT22 I单 酶 切 : 4. 1 kb、2. 2 kb 和 0. 3 kb,其中 0. 3 kb 的片断因为太小而在琼脂糖凝胶电 在基因工程菌中 ,重组质粒的不稳定性一般具有 2 () 种表现形式 ,一种是结构 序列 不稳定性 ,即重组质粒 上某一区域的 DNA 序列发生插入 、缺失 、重排 、修饰等 B am H I 双 酶 切 : 5.3 kb 和; N co I 和泳 中 检 测 不 到 现象 ,导致 其 表 观 生 物 学 功 能 的 丧 失 ; 另 一 种 是 分 离 ) 113 kb。 ()分配 不稳定性 ,是指整个重组质粒的 DNA 分子从受 体细胞中逃逸或丢失的现象 。一 般 情 况 下 , 质 粒 的 结 M 图 1 质粒 pETNH的简单基因谱图及常用酶切位点 MF ig. 1 S im p le gen em a p an d som e re str ic t ion en don uc lea se s ite s of p la sm id pETNH 72 中国生物工程杂志Ch ina B io techno logy Vo l. 25 No. 8 2005 图 2 不同条件下收获的质粒 D NA 酶切后 图 3 重组菌细胞连续分裂时的质粒丢失及 Kan 的 1. 2 %琼脂糖凝胶电泳的添加对质粒稳定性的影响 F ig. 2 A ga ro se ge l e lec trophore s is ( 1. 2%) of or ig ina l F ig. 3 P la sm id lo ss an d effec t of kanam yc in M pETNHan d the on e iso la ted from ce lls grown to 60 supp lem en ta t ion on p la sm id sta b il ity dur in g gen era t ion s d ige sted w ith re str ic t ion en don uc lea se s con t in uou s d iv is ion of recom b inan t ce lls 1 ,3: o rigina l con structed p la sm id s of no d ige stion, N co I / 中 , 当重组菌细胞连续分 裂 约 48 次 左 右时 , 质 粒就 开B am H I d igestion, and EcoT22 I d ige stion, re sp ec tive ly; 4: DL + 15 000 m arker; 5 ,7: 60 2gene ration p la sm id s of no d igestion, N co I ( ) 始丢失 ,含质粒细胞 P 的 百 分 率 逐 渐下 降 ; 当世 代 数增大到约 66 代时 , 质粒丢失率接近 90 % , 说明质粒 / B am H I d igestion, and EcoT22 I d ige stion, re sp ective ly M p ETNH具有分离不稳定性 ,宿主细胞的连续高速分裂 将导致质粒的丢失 。而在 LB K培养基中 , 由于 Kan 选 进一步将连续复制 60 代后的质粒转入宿主 E. coli () BL21 D E3 ,并对重组菌进行腈水合酶的诱导表达 ,结 + M 择压力的存在 , P 菌的百分率在传代过程中一直保持 果表明腈水合酶能够正常表达 。证明质粒 p ETNH确 恒定 。 实具有良好的结构稳定性 , 即使经过长时间连续复制 , M ( ) 因此 ,为了保证菌种 BL21 D E3 /p ETNH的稳定 也没有产生 DNA 序列的明显自发突变 。 传代和保藏 ,必须在菌种保藏培养基中加入 Kan 抗生 M 2. 2 质粒 pETNH的分离不稳定性素的选择压力 。另一方面 , 尽管质 粒 具 有 分 离 不稳 定 质粒 的 分 离 不 稳 定 性 是 质 粒 不 稳 定 性 的 主 要 因 性 ,但它仍然 能 够 在 无 抗 生 素 选 择 压 力 条 件 下 , 在 48 素 ,历来受到学者们的高度重视 。大量研究表明 , 宿主 世代内保持质粒的稳定遗传 , 该性能已经 足 够 满足 工 的新陈代谢负荷 、质粒的寡聚化效应及在 缺 陷 性 分 配 业生产的需要 。 过程中造成的拷贝数差度等 , 均是产生无 质 粒 细 胞 的 M 2. 2. 2 质粒特性对 p ETNH分 离不 稳 定 性 的 影 响 在重要因素 ,而不利的环境条件及无质粒细 胞 的 生 长 竞 重组菌细胞中 , 质粒载体的拷贝数是影 响 质 粒分 离 不争等则 是 进 一 步 扩 大 质 粒 分 离 不 稳 定 性 的 重 要 原 [ 8, 9 ] 稳定性的重要因素 。对于松 弛 型 质 粒载 体 , 一般 情 况因 。M 下 ,伴随着细胞的分裂 , 质粒以随机方式分配到子细 胞2. 2. 1 质粒 p ETNH的分 离 不 稳 定性 及 抗 生 素 选 择 中 ,质粒拷贝数越高 , 出现无质粒载体细胞的概率就 越压力的影响 抗生素的选择压力是保证质粒分离稳定 性低 ,质粒也就越稳定 。而质粒载 体 的 寡 聚 化 效应 会 导的重要因素 。分别在 LB 和 LB K培养基中对重组菌 M 致质粒载体的拷贝数大大降低 , 从而通 常 会 加重 质 粒() BL21 D E3 /p ETNH进行反复的传代培养 , 以考察重 的分离不稳定性 。 组菌株的分离不稳定性及宿主细胞连续分裂时 Kan 的 分别收获在 LB 培养基中连续传代培养 30 代 、60 添加对质粒稳定性的影响 。为了保证所有的细胞均具 ( ) 代及 经 过 诱 导 大 量 表 达 腈 水 合 酶 的 BL21 D E3 / 有分裂能力 ,确定传代时间为 6 h,即当细胞处于对数生 M p ETNH细胞 , 利用试剂盒提取质粒 , 进行 0. 7 %的 琼 长后期时进行传代 。实验结果如图 3 所示 : ( )脂糖凝胶电泳 ,并以原质粒为对照 ,电泳结果如图 4 a 由图 3 可见 ,在没有抗生素选择压力的 LB 培养基 M 10 kb 左右的质粒 DNA ,分别采用了强条带 。回收纯化 所示 。由图可 见 , 重 组 质 粒 p ETNH除 了 在 4. 8 kb 处 (理论长度 6. 6 kb, 由于环状质粒形成超螺旋 , 所以出 N co I和 B am H I对其进行单酶切 , 酶切后的电泳结果如 ) ( )现在 4. 8 kb 位臵 出现条带以外 , 还在 10 kb 左 右 出 现 图 4 b所示 。 M 图 4 环状超螺旋质粒 pETNH的琼脂糖凝胶电泳 ( 0. 7 %)及二聚体质粒的酶切验证 M F ig. 4 A ga ro se ge l e lec trophore s is ( 0. 7 %) of c ircu la r superco iled p la sm id pETNH( a ) an d l in ea r p la sm id d ige sted by N co I an d B am H I( b) ( ) re sp ec tively a1: DNA m a rke r; 2 ,4: p lasm id s of o rigina lly con struc ted, 30 gene ra tion s and 60 gene ra tion s, ( ) b1: DNAm a rke r; 2: N co I d ige st; 3: B am H I d ige st. ( ) 由图 4 b 可见 , 酶切后仅得到一条长度均为 6. 6 M kb的线性质粒条带 , 是重组质粒 p ETNH长度的理论 M 值 ,说明酶切 前 的 样 品 为 p ETNH的 二 聚 体 。也 就 是 M ()说 ,重组质粒 p ETNH在宿主 BL21 D E3 中 ,主要以单 体和二聚体 2 种形式同时存在 ,且由 To ta lL ab软件的定 量分析可知 ,这 2 种形式的质粒比为 1 ?2。由于质粒的 寡聚化效应会降低重组质粒的拷贝数 , 故 而 大 量 形 成 M 的重组质粒 p ETNH的二聚体不利于质粒的分离稳定 性 。 M 2. 2. 3 连续传代及 诱 导 产 酶 对质 粒 p ETNH的 拷 贝 M 数的影响 质粒 p ETNH属于 松 弛 型 , 应 该 具 有 较 高 的拷贝数 。分别取 2. 4m l在 LB 培养 基 中 传 10 代 、30 M (( ) 代以及经过诱导产酶的 BL 21 D E3 /p ETNH菌液 细 99 胞计数结果分别为 2. 16 ×10个 /m l、1. 92 ×10个 /m l M 9 图 5 不同条件下质粒 pETNH 拷贝数的定量测定 μ) 及 1. 87 ×10个 /m l, 小心 提 取 质 粒 , 分 别 获 得 100l F ig. 5 Quan t ita t ive de term ina t ion of p la sm id copy μ质粒样品 。各加样 3l进行 0. 7 %琼脂糖凝胶电泳 , 同 M n um ber of pETNH un der d ifferen t con d it ion s μ(( ) ) 时加入 3l 150 ngDNA M a rke r作参照 图 5 。采用 1: 10 gene ration s; 2: 60 gene ra tion s; To ta lL ab软件计算可知 , 3 条泳道中质粒的质量分别为 3: induced exp ression of n itrile hyd ra ta se; 4: DNA M a rke r 77. 6 , 46. 2 和 21. 8 ng。则 3 种菌液收获的质粒的理论 μμμ产量分别为 0. 92g /m l、0. 55g /m l和 0. 26g /m l。 M 因 p ETNH单体的分子大小为 6 600 bp , 每单位碱 - 15M μ基对的平均质量为 1. 059 ×10 g, 因 此 p ETNH单 - 123 μ() 体的分子质量为 : 6. 989 ×10 g 即 4. 21 ×10kD a 。 74 中国生物工程杂志Ch ina B io techno logy Vo l. 25 No. 8 2005 M M (( ) 计算表明 , 3 种菌液中重组质粒 p ETNH的拷贝数 以 p ETNH在 E. coli BL21 D E3 中的引入 , 将对宿 质粒 )单体计 分别为 61、41 和 20。该结果说明 ,在不同的传 主细胞的生长造成一定的生理负担 , 从而 影 响 质粒 的 M M ( ) 代培养和诱导表 达 条 件下 , 重 组质 粒 p ETNH在 宿 主 分离稳定 性 。将 重 组 菌 E. coli BL21 D E3 /p ETNH () 细胞中的拷贝数差异很大 。首 先 , 长时 间 的 传 代 培 养 和宿主菌 E. coli BL21 D E3 在 LB 培养基中进行平行 会使质粒 的 复 制 能 力 有 所 降 低 , 从 而 使 拷 贝 数 减 少 。 培养 ,测定 OD值随 时间 的 变 化 曲 线 , 并 计 算 其比 生 600 其次 ,菌体经诱导产酶后 , 由于蛋白表达过程需要占用 长速率 ,结果如图 6 所示 。由图可见 ,重组菌和宿主菌 较多的能量 、营养和前体物质 , 所以也会导致质粒拷贝 21 21 数的下降 ,从而影响质粒的分离稳定性 。此外 , 由于以 的最大比生长速率分别为 0. 732 h 和 0. 689 h ,重组菌 ( ) 略高 于 宿 主 菌 。也 就 是 说 , 重 组 菌 BL 21 D E3 / 二聚体形式存在的重组质粒在宿主细胞中约占总量的 M p ETNH并没有由于携带质粒而表现出严重的生理负 2 / 3 , 而 二 聚 体 质 粒 的 拷 贝 数 仅 为 单 体 质 粒 拷 贝 数 的 担 。重组菌和宿主菌的这一生长特性将有利于避免质 1 / 2 ,因此 ,质粒的二聚化现 象 也 必 然会 影 响 到 质 粒 载 粒丢失后的空宿主细胞发展成为优势菌群 , 从 而有 利 体的分离稳定性 。 于保持质粒的分离稳定性 。 质粒引入对宿主细胞生长的影响 理论上讲 ,2. 2. 4 图 6 重组菌和宿主菌在 L B培养基中的生长比较 F ig. 6 C om pa r ison of ce ll grow th ( a ) an d spec if ic ce ll grow th ra te ( b) in L B m ed ium be tween the M recom b inan t E. co li BL 21 ( D E3 ) / pETNHan d ho st E. co li BL 21 ( D E3) 进一步研究表明 , 培养过程中的碳源和氮源限制 、 参考文献 溶氧限制等因素都会在一定程度上加重质粒的分离不 [ 10 ] 稳定性 ,这同文献的结论相一致 。 [ 1 ] 沈寅初 , 张国凡 , 韩建生. 微生物法生产丙烯酰胺. 工业微 综上 所 述 , 在 高 产 腈 水 合 酶 的 重 组 大 肠 杆 菌 E. ( ) 生物 , 1994 , 24 2 : 24 ,32 M M ( ) coli BL21 D E3 /p ETNH中 , 重组 质 粒 p ETNH具 有 Shen Y C, Zhang G F, H an J S. Indu stria l M icrob io logy, 结构稳定性和分离不稳定性 。其 中 , 质 粒 载 体 的 二 聚 ( ) 1994 , 24 2 : 24 , 32 化效应 、重组细胞的连续分裂以及腈水合 酶 的 诱 导 表 [ 2 ] Kobayash i M , N ish iyam a M , N agasawa T, et al. C lon ing, 达等因素都将加重质粒的分 离 不 稳 定 性 。反之 , 重 组 nucleo tide sequence and exp ression in E. coli of two cobalt2 细胞相对于宿主细胞的较高比生长速率有利于保持有 con taining nitrile hyd ratase genes from Rhodococcu s rhodoch rou s 质粒细胞的生长优势 , 而抗生素的正向选 择 压 力 则 将 ( ) J1. B ioch im B iophys A cta, 1991, 1129 1: 23,33 保证重组质粒在重组细胞内的稳定遗传 。上述研究对 [ 3 ] 史悦 , 于慧敏 , 孙旭东 ,等. 腈水合酶基因克隆与调控表达 ( ) 的研究进展. 中国生物工程杂志 , 2004 , 24 7 : 34 ,39 于含质粒基因工程菌株的进一步工业化应用具有重要 意义 。 Sh i Y, Yu H M , Sun X D , e t a l. Ch ina B io techno logy, 2004 , ( ) 24 7 : 34 ,39 [ 4 ] 史悦 , 孙旭东 , 于慧敏 , 等. 有效增强重组腈代谢酶系表达 ( ) L abo ra to ry M anua l. N ew Yo rk: Co ld Sp ring H arbo r L abo ra to ry 活性的策略. 现代化工 , 2003 , 23 9 : 23 ,26 Sh i Y, Sun X D , Yu H M , e t al. Modern Chem ical Indu stry, P re ss, 1989 ( ) 2003 , 23 9 : 23 ,26 [ 8 ] 吴乃虎. 基因工程原理. 第 2 版. 北京 : 科学出版社 , 1998 , 176 ,238 [ 5 ] Sh i Y, Yu H M , Sun X D , e t a l. C lon ing of the n itrile W u N H. P rinc ip le of Gene tic Engineering. 2 nd ed. B e ijing: hyd ra ta se gene from N oca rd ia sp. in Escherich ia coli and P ich ia Sc ience P re ss, 1998. 176 ,238 pastoris and its func tiona l exp re ssion u sing site2d irec ted (β[ 9 ] Yu H M , , Sh i Y, Sun X D , e t a l. Effec t of po ly 2( ) m u tagenesis. Enz M ic rob Techno l, 2004 , 35 6 - 7 : 557 , ) hyd roxybu tyra teaccum u la tion on the stab ility of a recom b inan t 562 ( ) p la sm id in Escherich ia coli. J B io sc i B ioeng, 2003 , 96 2 : [ 6 ] 史悦 , 于慧敏 , 赵晖 , 等. 诺卡氏菌腈水合酶基因在重组大 肠杆菌中的活性表达. 见 : 第一届全国化学工程与生物化 179 ,183 工年会论文摘要 1南京 : 南京工业大学 , 2004. 756 [ 10 ] 刘志伟 , 郭勇 , 张晨. 培养过程对基因工程菌稳定性的影 ( ) 响. 微生物学通报 , 2001 , 28 2 : 86 ,89 Sh i Y, Yu H M , Zhao H , e t a l. In: 1 st Ch ine se N a tiona l ( ) L iu ZH W , Guo Y, Zhang Ch. 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Howeve r, p la sm id p ETNHis segrega tiona lly un stab le, becau se the p la sm id2free ce lls app ea red afte r 48 gene ra tion s unde r no kanam yc in se lec tion p re ssu re. A ga ro se ge l e lec trop ho re sis showed tha t 2 /3 of p la sm id s fo rm ed d im e r fo rm in the recom b inan t ce lls, wh ich sign ifican tly cu t down the p la sm id cop y M num be r of p ETNH. Fu rthe r stud ie s showed tha t the con tinuou s h igh2sp eed d ivision of recom b inan t ce lls and the h igh leve l exp re ssion of NH a se wou ld bo th reduce the cop y num be r of p la sm id s and wo rsen the segrega tiona l M in stab ility of p ETNH. O n the con tra ry, the h ighe r sp ec ific grow th ra te of recom b inan t ce lls wa s benefic ia l to keep the grow ing sup e rio rity of p la sm id2ha rbo ring ce lls, and the supp lem en ta tion of kanam yc in p re ssu re w ill M M () en su re the stab le inhe ritance of p ETNHin the recom b inan t E. co li BL21 D E3 / p ETNH. ()E. R ecom b inan t Key word s N itrile hyd ra ta se NH a se coli P la sm id stab ility Segrega tiona l in stab ility P la sm id cop y num be r