阻断白色念珠菌粘附口腔膜上皮细胞的实验研究

阻断白色念珠菌粘附口腔膜上皮细胞的实验研究 阻断白色念珠菌粘附口腔膜上皮细胞的实 验研究 4中国檄l牛志学杂志2?1年6月第13卷第3期ChineseJournat0fM+cxoecoLo~yJune200i.Voti3N03 文章编号:i005—376X(2001)06316402 阻断白色念珠菌粘附口腔粘膜上皮细胞的实验研究 刘为国,伦永志,黄敏,徐曼丽 【1.大连大学医学院,豆宁大连116001;2.大连医科大学.豆宁大连116027) 【口腔微生态学】 摘要白色念珠菌的粘附与其表面甘露糖结构有关,为探讨阻断粘附的方法.我们采用体外法测定其 对El腔上皮细胞的粘附数量,显示:白色念殊菌牯附感染上皮细胞后.甘露糖可以在一定程度上碱少粘附, 绿幕安及刀豆素A可"有救地减少牯附.提示甘露糖及绿慕安可能有助于治疗白色念珠苗感染. 关键词:白色念珠菌;粘跗;口腔上皮细胞. 中圈分类导R379.4文献标识码:A THEEXPERIMENTALSTUDY0FINHIBITINGCAD,DAA,口,一 CASADHERET0HUMANEPITHELIUM IIUWei—guo.LUNYong—zhi.HUANGMin,fat. (Medicalcollegeofc?university,Dalian11601,China) AbstractM~nDosecontainingmoietiesontheNilrfaceofCadidaalbica[IScouldmediatethe adherence ofthisyeaststOhumanepitheliumTostudythemethodsoflnhibitingadherence,we[~easure dtilequan tityofadherecneofCadidaalbicanstOepithelialcellsl[roTheresultssbowedthatFDallnosec aninhib— itedadherencepartly.andPA—MSHA(PseudomonasaeruginosawithMannoseSensitivehemagglutlnatlon Pil;)vaccinandconcanavalinACarlinh;bitedadherenceeffectivelyafterCadidaalbicansad heredtoepithelial ceilsThereforemannoseandPA—MSHAvaccinCOuldpreventadhesionandinlettions. Keywords:Cadidaalbicans{humanepithelialcells;adherence. 白色念珠菌是真菌中晟常见的致病菌,据认为2j, 50的健康^.其口腔,消化道,阴道可有白色念珠苗,但并 不发病.当宿主防御机能降低以后.这种非致病性念珠苗转 化为致病性菌.SandinRL等研究刀豆素A对自色念球菌粘 附的抑制作用可以被甘露糖所抑制,因而甘露糖夼导自色急 珠苗粘附我们通过刀豆素A与白色念珠苗的结台实验 证明:白色念珠苗表面甘露糖结构是其表面识别配体,与 SandinRL等的结论一致.为进一步研究抑制粘附打下了基 础 布研究采用白色念珠菌标准株,以人口腔牯膜上皮细胞 并测定糖类等受体物质在不同淮度下,不同 进行粘附实驻, 条件下对粘附作用的影响 1材辩与方法 1.1材科 1.11菌种白色念珠苗标准株,由中国生物制品鉴定所 提供. 1.12人口腔粘膜上皮细胞取自健康志愿者口腔牯膜. 志愿者口腔状况良好,一局内无应用药物史. 1.13主要试剂D甘露糖:分析纯,上海试剂二厂:D一葡 萄糖:分析纯,沈陌市试剂一厂?D一半乳糖:分析纯,上海试剂 二厂:L岩藻糖:分析纯,SERVA公司ID一果糖:分析纯.上 梅试粥二厂;蔗糖:分析纯,哈尔滨市化工试剂厂乳糖:丹析 纯,麦芽糖:分析纯,中国科学院上海生物化学研究所;绿慕 安(绿脓杆苗MSHA茸毛株免疫制剂);广东宝舜集田公司: 刀豆素A:分析纯,Sigma公司 1.1.4倪器及器材分析天平:Sartorious瑞士;LD4—2A 离心机:北京医用离心机厂;水浴恒温振荡器(SHA—C型): 江苏金坛市医疗仪器厂;吸掖器(1OOg1):上海医械专机厂. 1.2方岳 收稿日期;20020226 1.2.1白色念聋菌苗悬液的制备自色念珠苗接种至新鲜 的抄堡氏固体培养基,37?培养18h,收集苗细胞,用pH74 的hank'S平衡盐溶液离一0洗涤3次,用血细胞计数板调整 菌细胞涟度为1×10/'mI. 12.2颊粘膜上皮细胞(BEC)悬渍的制备用无苗筷子轻 刮健康志愿者双侧颊牯膜,用pH7,4的hank'S平衡盐溶液 离一0洗涤3谯.用血细胞计数板橱整BEC浓度l×10/ ml= 1.23试剂的制备前述糖类制备成1,0.5,0.1三 绿 个浓度,刀豆素A制备成500,100及10gml3十浓度,慕安淮度为18亿/ml,丹成3组:一组:1糖类,500~gm】 刀豆素,18亿/'ml绿慕安;二组:0.5糖类,100gg/ml刀豆 索:三组:0.1糖类,1O,ug/ml刀豆素. 1.24粘附买驻 1.24.1自色念珠苗牯附上皮细胞实验(对照组) 白色念珠苗与上皮细胞悬液各0.1ml混台,37?水洛恒温 振荡器中,每15min振一班,1h后取出,离心洗涤3次(每 次离心力为150×g,3min),弃上清液,沉蓰物馀片,风干,无 水己醇固定,革兰染色,镜下随机计数100十上皮细胞,算出 每个口腔上皮细胞粘附白色念珠菌数. 1.242上皮细胞与白色念珠菌作用后,再加八受体物质 (绿幕安或某一淮度的糖类或刀豆素)作用lh及2h对牯附 的影响,方法同上 1.3统计方岳统计三次实验,每谯实验两谯重复计数的 结果,白色念珠苗对上皮细胞的粘附率为均值土标准差经 检验与对照组比较,P值小于O.叽者为有显着性差异. 2结果 2.1白色盘珠茵粘附上皮钿胞后,再加八受体物质分别作 用1h.2h对粘附作用的影响.见表1. 中国微牛杰学杂志2001年6月第13卷第3括Chinelourn~】ofMi[?e010EY,Ju 雌2001,V0】13N03165 表】自色念珠蕾玷上盅鲷眶后,加^受体轴质科牯咐作用的影响 粘附熬(=S) 受悻物质组2组3组 lh2hlh2h1h2h 甘露糖 ?_葡萄糖 D_半糖 L-岩藻糖 果糖 蘼糖 乳糖 麦芽糖 刀豆素A 绿摹盔 对照纽 'S?l{,lE2?l2】9:09,17S?lu!.9?lt2【?1 2l8il22lB?l22il322j=I42:?Jn22li"9 :19?J225i09217?0921B?I22?Ju2a3?】2 _6?0S2】付l023-_1222B?l3227=og22g?】c 21S=1o223?l021s11C232?O922B=11226?1【 22{?1】225?08:3?12Z29?4232?2}23509 228?09227=I【233i【0235?】i24】?04242il-0 234il0235?lZ237?9338?0g2;9?I226?12 i?=I2J.8土】n142:ll【39?【215j=I2l;8?】 ;士I113=09 22?10 注:P<0Ol与对照组比较 表中显示:白色念珠菌粘附上皮细胞后,绿慕安及刀豆 素A可以有效地减少粘附,D一甘露糖在一定程度上可喊 少粘附,但随着浓度的降低.影响力喊小,以至影响力不显 着.延长受体物质作用时间,只始部分地减少粘附,但没有显 着性差异. I?围】白色老珠曹粘附上皮蛔眶科曝组×{0c 一围2卑墓安置作用自色毒蒜蕾后,自色毒蒜蕾丰牯咐刊上皮蛔胞上×l0c 一围3刀豆蠹A磺作用自色老珠曹后一自色老珠蕾丰牯喇刊l-it~I+I-x49,3 2.2形态学观察显微镜下所见:经革兰染色后.颊粘膜上 皮细胞染成红色,白色念珠菌染成紫色照片1为白色念珠 菌牯附感染上皮细胞,见白色念珠菌成簇聚集在上皮细胞的 细胞膜上.照片2为绿慕安预处理白色念珠菌后.白色盘珠 菌分散在上皮细胞周围,束发生牯附照片3为刀豆索A预 作用于白色念珠菌后,白色念珠菌未发生牯附. 3讨论 关于糖类物质耐白色念珠菌牯附的影响,各国学者作 了很多工作把白色念璩菌的单一菌株培养在一种富含不同 糖类(以作碳源)的培养基中,如含500ram的半乳糖,蔗糖, 葡萄糖和果糖.便能粘附于颊牯膜上皮细胞生长在加半乳 糖的培养基中的白色念璩菌对上皮细胞的粘附力最大,依次 使其粘附力降低的是加蔗糖,葡萄糖或果糖].白色念珠菌 牯附到食管细胞系细胞可以被D葡糖胺或N-乙酰葡糖胺 部分地抑制,而D甘露糖,D一葡萄糖,L一岩藻糖或D一半乳糖 则不能产生抑制J.白色念珠菌对于阴道上皮细胞的粘附, 不能被甘露糖,半乳糖或一甲基一D一甘露糖苷所抑制.却能被 D一岩藻糖和L一岩藻糖所抑制.葡萄糖则能增加粘附]这些 实验产生的差异可能与白色念珠对细胞进行牯附的配体一 受体识别有关.宿主细胞的膜受体根据部位不同,具体的化 台物也不同:口腔粘膜是纤维牯连蛋白,酯质,甘露糖和一 乙酰葡糖膀;肠道牯膜为粘蛋白;阴道粘膜为岩藻糖因而, 糖类对白色念珠菌表面结构的封闭作用也不同,对粘附的影 响也会产生差异 实验结果显示:当白色念珠菌牯附口腔上皮细胞后,再 加^受体物质则只有D,甘露糖,绿慕安及刀豆素A可 产生作用.D一甘露糖与白色念珠菌竞争上皮细胞上的粘附受 体而发挥作用.绿幕安及刀豆索A通过与白色念珠菌的凝 集作用而减少其对上皮细胞的粘附.延长作用时向,只能部 分地减少牯附.前其他糖类对已经牯附到上皮细胞的白色念 珠苗几乎设有影响 绿慕安是绿脓杆菌苗毛株制成的免疫制剂.该绿脓杆 菌为甘露糖敏感血凝菌毛株]园其IrISHA周身性复台菌 毛的高效跨菌属的免疫原性,免疫』,体后能广泛封闭复台性 糖蛋白和糖脂类受体.车实验证实其有抗白色念珠菌粘附 上皮细胞的功效.同时,绿慕安与白色念珠菌的凝集,也间接 地证实了其甘露糖敏感血凝的特点 综上所述,甘露糖盈甘露糖识别物质一刀豆隶A,绿慕 安均可以影响白色念珠菌的牯附作用,甘露糖类物质及绿慕 安是否可以治疗口腔白色念珠菌病.还需要进一步的临床研 究,这对于探索口腔白色念珠菌病的防治具有积极的意义. 参考文献: [1]SAND1NRL,ROFERSALPATTERSONRJ,etEvidence [or?n05tmediatedhefenceofCandidaalbicanstohuman buecalceilinro_J:InfectImmun.198+9,35(1】7985 [妇白天玺,张庆华卿『七口腔念殊菌病学[M]北京:^民军压出 版社.199510:1O0. [3]ENACHEE,ESKANDAR1T,BORJAL,?Candidaalbican~ adherencetoahumanoesophagealcellllneJ]Microbiology, 1996.142(ptl0)274iO9746 B]SOBEJDMYERSPG.KAYED.alAdherenceofCandidaat— bican~t0humanvaginalandbucalepithetialceilsEl7Infect DLsu1981143(1):7682. ;]牟希亚绿臃杆菌甘露糖艋感血龌菌毛抹的建立J]微生物学 报.1P86,06:l6 [6:牟希亚菌毛学研究进展EM]大连:大连出版牡,j999.4:118