[应用]型胶原蛋白抗血清的制备和检测

[应用]型胶原蛋白抗血清的制备和检测 ?型胶原蛋白抗血清的制备和检测 【摘要】 目的: 探讨?型胶原蛋白(collagen protein type ?, C?)抗体产生规律，制备C?抗血清。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 : 采用纯化的鸡和猪C?免疫新西兰白兔，每隔10 d收集血清，以改良间接ELISA法检测抗C?抗体效价。结果: 鸡C?免疫新西兰白兔后，第10天抗体效价为1?3 200，第20天升至1?204 800;加强免疫后，第30天和第40天抗体效价分别达到1?409 600和1?819 200。猪C?免疫新西兰白兔后，第10天血清中未能检测出抗体，第20天血清抗体效价为1?3 200;加强免疫后，第30天和第40天抗体效价分别为1?51 200和1?102 400。结论: 采用纯化的鸡和猪C?免疫新西兰白兔后，经一定潜伏期血清中出现抗体，可以获得高效价抗C?抗体血清。抗体产生情况符合机体初次及再次免疫应答的有关规律，但血清抗体产生的潜伏期和效价与不同种属来源的胶原蛋白有关。 【关键词】 鸡; 猪; ?型胶原蛋白; 抗?型胶原蛋白抗体; 酶联免疫吸附实验 近年来研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)的发病与?型胶原蛋白(collagen protein type?, C?)自身免疫反应有关,1，2,，在RA患者血清和关节部位可检测到抗C?抗体,3,，用C?免疫动物可产生胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)，将抗C?抗体给动物输注亦可产生或有助于产生关节炎,4,，因此C?及其自身抗体对RA的发病起着非常重要的作用，但其作用机制和致病机制仍不清楚。不同动物来源的C?可作为抗原免疫异种动物，不仅能得到相应的抗体，而且有助于了解C?和抗C?抗体在RA等疾病中的发病机制。我们采用纯化的鸡和猪C?免疫新西兰白兔，每隔一定时间收集血清，以ELISA法检测抗C?抗体效价，获得了高效价的?型胶原抗血清，同时对鸡和猪C?抗体产生规律进行了比较和 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 。 1 材料与方法 1.1 主要试剂 胃蛋白酶(Amersco分装，武汉博士德生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 有限公司);鸡?型胶原蛋白参照品(C9301，Sigma公司);29,205 KD蛋白质相对分子质量标志物(上海华舜生物工程有限公司);HRP羊抗兔IgG(SA0040，上海普飞生物技术有限公司);四甲基联苯胺(TMB，上海华美生物工程公司);弗氏佐剂(Sigma公司)。其余均为分析纯试剂。 1.2 主要仪器 电泳仪(Bio-Rad公司);Gene Genius全自动图像分析系统(澳大利亚);Super T21冷冻离心机(美国);μQuant紫外可见扫描酶标仪(美国，Bio-Tek仪器公司)。 1.3 免疫用动物 新西兰白兔6只，雄性，体质量2.0,2.4 kg，购自南京江宁种兔厂。分为两组，每组3只，分别用于鸡?型胶原蛋白和猪?型胶原蛋白的免疫。 1.4 ?型胶原蛋白的提取、纯化和鉴定 以鸡胸剑突软骨和猪关节透明软骨为原料，用盐酸胍去除蛋白多糖、胃蛋白酶消化、氯化钠盐析等步骤提取与纯化鸡?型胶原蛋白和猪?型胶原蛋白。具体方法参照文献,5，6,进行。 1.5 兔抗?型胶原蛋白抗血清的制备与标本采集 将2 mg/ml精制无菌?型胶原蛋白与等量完全弗氏佐剂混合，充分乳化后，于新西兰大白兔的背部皮下进行多点注射，每只3 mg ?型胶原蛋白。于第20天追加抗原刺激，每只腹腔注射胶原蛋白2 mg。免疫前和免疫后每隔10 d，耳静脉采血，分离血清，-20?冻存。 1.6 血清抗?型胶原蛋白抗体的检测 参照Fujii等,7,的ELISA法，优化实验条件，建立抗?型胶原蛋白抗体间接ELISA法。将新鲜羊血清60? 20 min灭活，加入适量Tris(终浓度0.05 mol/L)和NaCl(终浓度0.15 mol/L)，用2 mol/L HCl调pH至8.0备用。用pH7.6的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液将C?配成20 μg,ml，4? 12 h进行包被，继以10%羊血清，37? 2 h进行封闭;待测血清用含10%羊血清的缓冲液血清作1?50稀释，37? 2 h后洗3次;用含10%羊血清的缓冲液将羊抗兔酶标IgG抗体作1?1000稀释，37? 1 h后洗3次;显色底物为TMB-H2O2，以2 mol/L H2SO4终止反应。检测波长为450 nm/630 nm;以测定孔D值与阴性对照平均D值的比值大于2.1者为阳性。 1.7 血清抗?型胶原蛋白抗体效价的检测 将ELISA法检测为阳性的血清作系列稀释，采用上述间接ELISA法测定，以呈阳性的最高稀释倍数作为血清?型胶原蛋白抗体效价。 2 结果 2.1 ?型胶原蛋白纯度鉴定 从鸡胸剑突软骨和猪关节透明软骨中，获得了鸡?型胶原蛋白和猪?型胶原蛋白，其SDS-PAGE电泳结果见图1。图1表明，鸡?型胶原蛋白和猪?型胶原蛋白的电泳行为一致，均出现3条带，与Sigma公司参照品相同。 A:蛋白相对分子质量标志物;B:Sigma公司的鸡?型胶原蛋白;C:本室提取的鸡?型胶原蛋白;D:本室提取的猪?型胶原蛋白 图1 ?型胶原蛋白SDS-PAGE电泳图谱(略) Fig 1 SDS-PAGE electrophoretic picture for C? preparation 2.2 ?型胶原蛋白抗体产生情况 对免疫前和免疫后每隔10 d采集的兔血清标本，用ELISA法测定?型胶原蛋白抗体随时间变化情况，并将兔血清倍比稀释测定抗体效价。 2.2.1 兔抗鸡?型胶原蛋白抗体产生情况 鸡?型胶原蛋白首次免疫新西兰白兔后，经较短潜伏期血清中即出现抗体，抗体滴度随时间快速增加，第10天抗体效价为1?3 200，第20天升至1?204 800;第20天加强免疫后，抗体效价进一步增加，第30天和第40天抗体效价分别达到1?409 600和1?819 200。血清抗体效价的变化见图2。 2.2.2 兔抗猪?型胶原蛋白抗体产生情况 猪?型胶原蛋白免疫新西兰大白兔后，潜伏期较长，第10天血清中未能检测出抗体，第20天血清抗体效价为1?3 200;加强免疫后，抗体效价快速上升，第30和40天抗体效价分别为1?51 200和1?102 400。血清抗体效价的变化见图3。 图2 鸡?型胶原蛋白免疫新西兰白兔后血清抗体效价的变化(略) Fig 2 Serum antibody titers of New Zealand white rabbit immunized with chicken C ? 图3 猪?型胶原蛋白免疫新西兰大白兔后血清抗体效价的变化(略) Fig 3 Serum antibody titers of New Zealand white rabbitimmunized with pig C? 3 讨论 ?型胶原蛋白是软骨基质的主要有机成分，是关节软骨中主要细胞外间质之一。虽然在人体含量较多，但临床取材可获得的数量有限;而且?型胶原蛋白与蛋白多糖形成紧密的结合，难以用单纯的化学方法提取,8,。目前所报道的方法，操作复杂，条件不一，结果存在差别。我们以鸡胸剑突软骨和猪关节透明软骨为原料，用盐酸胍去除蛋白多糖、胃蛋白酶消化、氯化钠盐析和DE22纤维素处理等步骤，制备出高纯度的?型胶原蛋白,5，6,。SDS-PAGE电泳图谱显示:鸡?型胶原蛋白和猪?型胶原蛋白的电泳行为一致，均出现3条带，与Sigma公司鸡?型胶原蛋白相同。结果提示鸡和猪?型胶原蛋白的结构相似，可能存在相同的抗原决定簇。由于?型胶原蛋白是由3条相同的α链构成的，所以SDS-PAGE电泳图谱会出现1条含量高的α带和2条含量较少的β二聚体、γ三聚体条带。 血清?型胶原蛋白的抗体检测方法有双扩法、间接血凝反应法、ELISA法等。双扩法虽操作简单，但未变性胶原蛋白在中性pH及室温条件下易形成纤维，在琼脂糖凝胶内难以扩散;间接红细胞凝集反应，易出现非特异性反应，各型胶原蛋白之间存在交叉反应，不利于结果判断。我们以自提的可溶性鸡?型胶原蛋白和猪?型胶原蛋白作为包被抗原，优化实验条件，建立了抗?型胶原蛋白抗体间接ELISA法，提高了结果的重复性和特异性，在人、兔和鼠血清抗?型胶原抗体的检测中获得了满意的结果，并应用于本研究中。 ?型胶原蛋白是目前公认的关节软骨特异性抗原，用同种或异种动物的?型胶原蛋白 免疫动物都能产生较强的体液免疫和细胞免疫反应,2,。我们采用纯化的鸡和猪?型胶原蛋白免疫新西兰白兔，每隔10 d收集血清，以ELISA法检测抗?型胶原蛋白抗体及其效价，研究了?型胶原蛋白抗体产生规律。实验结果表明，鸡和猪?型胶原蛋白免疫新西兰大白兔后，经一定潜伏期血清中出现抗体，抗体产生情况符合机体初次及再次免疫应答的有关规律，可以获得高效价抗?型胶原蛋白抗体血清，为进行胶原蛋白免疫研究提供了必要条件。 目前?型胶原蛋白的来源主要有人、猪、牛、鸡等，尽管不同种属?型胶原蛋白的结构相似，但在氨基酸组成和结构上均有区别，可能存在其特有的抗原决定簇，作为抗原免疫同种动物时产生的免疫应答可能存在差异。实验结果显示，鸡?型胶原蛋白免疫新西兰白兔后，血清中出现抗体的潜伏期较短，第10天血清中抗体效价为1?3 200，免疫应答反应强;猪?型胶原蛋白免疫新西兰大白兔后，潜伏期较长，第10天血清中未能检测出抗体，抗体滴度较低。由此可见血清抗体产生的潜伏期和效价与不同种属来源的胶原蛋白有关。