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大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA与marA基因分析

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大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA与marA基因分析大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA和marA基因分析 张海旺1 邓旭明2* 张煜1 苏杰1 胡仲明3 (1.河北北方学院,河北 张家口,075131; 2.中国人民解放军军需大学,吉林 长春;130062;3.军事兽医研究所,吉林 长春;130062) 摘要:目的 检测大肠杆菌在某些抗菌素的环境压力下耐药性的变化及其与acrA和marA基因突变的关系。方法 分别用四环素、氯霉素和环丙沙星对大肠杆菌质控株ATCC25922进行体外诱导培养,测定诱导前后多种抗菌药的MIC的变化;对各菌株的acrA和marA基因进行...

大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA与marA基因分析
大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA和marA基因分析 张海旺1 邓旭明2* 张煜1 苏杰1 胡仲明3 (1.河北北方学院,河北 张家口,075131; 2.中国人民解放军军需大学,吉林 长春;130062;3.军事兽医研究所,吉林 长春;130062) 摘要:目的 检测大肠杆菌在某些抗菌素的环境压力下耐药性的变化及其与acrA和marA基因突变的关系。方法 分别用四环素、氯霉素和环丙沙星对大肠杆菌质控株ATCC25922进行体外诱导培养,测定诱导前后多种抗菌药的MIC的变化;对各菌株的acrA和marA基因进行克隆和测序。结果 四环素诱导株产生多重耐药,氯霉素和环丙沙星的诱导引起单药耐药;四环素诱导株、氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的acrA和marA基因序列均与ATCC25922的一致。结论四环素、氯霉素和环丙沙星的诱导培养并未引起ATCC25922的acrA和marA基因的突变,诱导引起的大肠杆菌耐药性变化是由于其acrA和marA基因突变以外的其他原因所致。 关键词:大肠杆菌 多重耐药 外输泵 acrA marA 由于抗菌药物的广泛、持续和不当使用,各种病原菌对抗菌药物的耐药性日趋严重。现已发现细菌细胞膜上的外输泵(efflux pump)的表达水平提高,能主动将扩散入细菌细胞内的药物或其他底物泵出菌体外,从而使细菌获得非特异性的耐药性。大肠杆菌是畜禽的重要致病菌,是发现外输泵最多的细菌,现已发现了约30种外输泵。一般认为AcrAB-TolC是大肠杆菌主要的外输泵[1]。它包括药物质子转运子AcrB、周质融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC[2]。MarA是一个正调控蛋白,可增强acrAB和tolC的表达。本实验用四环素、氯霉素和环丙沙星通过人工体外诱导大肠杆菌使之产生耐药性,对AcrA和MarA的基因acrA和marA进行测序分析,检测耐药性产生与acrA和marA突变的关系。 1 材料和方法 1.1 材料 菌株:大肠杆菌质控株ATCC25922,购自吉林省卫生监督检测中心。 抗菌药:头孢噻肟、青霉素钾等,均为 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品或对照品,中国药品生物制品检定所出品;盐酸环丙沙星,对照品,中国兽医药品监察所出品。 染色试剂:结晶紫酒精饱和溶液、草酸铵溶液、革兰氏碘溶液、石碳酸复红溶液等按《药品微生物学检验 手册 华为质量管理手册 下载焊接手册下载团建手册下载团建手册下载ld手册下载 》[3]进行配制。 载体与质粒:克隆载体为pGEM-T,Promega公司产品。 酶与试剂:T4 DNA连接酶、Ex TaqTM DNA 聚合酶、各种限制性内切酶、溶菌酶、蛋白酶K均为TaKaRa公司产品。 其他试剂:乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2)、焦碳酸二乙酯(DEPC),Sigma公司产品;dNTP、5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-gal)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素(Amp)、琼脂糖、羟基甲基氨基甲烷(Tris)等均为TaKaRa公司产品;饱和酚、氯仿、异丙醇、CaCl2、葡萄糖、甲基红等,均为国产分析纯试剂; DNA片段凝胶回收试剂盒(Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0),TaKaRa公司产品; 国家自然基金资助项目,No 30270999 作者介绍:张海旺,生于1956年,博士,教授。研究方向:耐药机理。*通讯作者 E-mail:zhw5148@yahoo.com..cn 分子量标准参照物:DNA Marker DL2,000、λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker,均为TaKaRa公司产品。 引物:根据GenBank中acrA、marA基因序列 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 PCR扩增引物:acrA的上游引物(PACR-F)序列为5′-ATG AAC AAA AAC AGA GGG TTT ACG CCT-3′;下游引物(PACR-R)5′-TTA AGA CTT GGA CTG TTC AGG CTG-3′,marA的上游引物(PMAR-F)序列为5′-ATG ACG ATG TCC AGA CGC AAT AC-3′,下游引物(PMAR-R)5′-CTA GCT GTT GTA ATG ATT TAA TGG-3′。上海博亚生物技术有限公司合成。 仪器:生物显微镜,OLYMPUS产品;PCR扩增仪,TC-25/H型,杭州 DAHE THERMO-MAGNETICS CO.LTD产品;电泳仪,DYY-6B型,北京市六一仪器厂产品;空气浴振荡器,HZQ-C,哈尔滨市东明医疗仪器厂生产;高速台式冷冻离心机,TGL-16M,长沙湘仪离心机仪器有限公司生产等。 1.2. 方法 1.2.1 菌株鉴定 对购进的菌株作生化和形态鉴定,以确保菌株的可靠性:用营养肉汤作复苏培养,再将菌液接种于琼脂平板37oC培养至长出菌落;取上一步得到的单菌落进行糖发酵试验(葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖)、靛基质试验、M.R试验、V—P试验鉴定及革兰氏染色的光镜观察。鉴定确认为ATCC25922的菌株作后续实验之用。 1.2.2 MIC测定 按照NCCLS(National Committee for Clinical Laboratory Standards)规定的方法配制包括诱导剂(氯霉素、四环素、环丙沙星)在内的各种受试抗菌药的标准溶液;用2倍连续稀释法配制各种含抗菌药的营养肉汤培养基,抗菌药的首选浓度范围为0.125~4.0μg/ml培养基(据细菌生长情况再作升或降的调整)。在1ml培养基中接种100μl菌液(约为105CFU);37oC培养24h,确定MIC。 1.2.3 诱导 分别在三种含1/2×MIC诱导剂的麦康凯培养基接种适量培养物(约105CFU),37oC培养24h,挑选生长良好的菌落,接种于1×MIC诱导剂的培养基37oC培养24h,以此类推,逐渐提高培养基中诱导剂的浓度直到诱导前MIC的128倍(据细菌生长情况诱导剂浓度提高幅度可在1~2倍于原浓度的范围适当调整,也可当细菌生长不良时在同一个浓度重复传代培养)。 1.2.4 耐药谱的确定 上一步最后获得的诱导剂浓度达到128×MIC的耐药株,作4次无诱导剂传代培养后,再分别测定三个诱导株对所有受试抗菌药的MIC,以确定三个诱导株的多重耐药谱。 1.2.5 受试菌株acrA、marA基因序列的检测 据上一步耐药谱检测结果,氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的耐药谱相近,而四环素诱导株的耐药谱与之差异较大,故选择四环素诱导株(名为SEMR)、环丙沙星诱导株(名为SEICI)和质控株(ATCC25922)作acrA、marA基因序列的检测。 1.2.5.1 目的基因(acrA、marA)的获取 1.2.5.1.1 DNA提取:按卢圣栋等[4]的方法提取SEMR、SEICI和ATCC25922的基因组DNA。 1.2.5.1.2 acrA、marA基因的PCR扩增:以大肠杆菌染色体DNA为模板,用引物PACR-F和PACR-R扩增acrA(全长1194bp),用PMAR-F和PMAR-R扩增marA(全长390bp)。取5μlPCR产物在0.7%琼脂糖凝胶进行电泳观察PCR结果。 1.2.5.1.3 PCR产物的回收:用DNA片段凝胶回收试剂盒回收acrA和marA基因的PCR产物,方法按试剂盒使说明书进行。 1.2.5.2 acrA、marA基因的克隆 1.2.5.2.1 目的基因片段与载体的连接:将回收的PCR产物连接到pGEM-T 载体上。反应体系为:2×Rapid Ligation Buffer,5μl;PCR产物(2ng/μl),3μl;pGEM-T vector(50ng/μl),1μl;T4 DNA Ligase,1μl。16℃连接过夜。 1.2.5.2.2 感受态菌的制备:CaCl2法制备DH5α感受态细胞[5]。 1.2.5.2.3 重组质粒的转化:参照《分子克隆指南》[5]进行。 1.2.5.2.4 阳性克隆的筛选:利用α互补法(蓝/白菌落筛选法)进行阳性克隆的初步筛选[5]。 1.2.5.3 重组质粒的鉴定 1.2.5.3.1提取质粒:碱裂解法[5]提取质粒,作0.7%琼脂糖凝胶电泳,紫外分析仪观察并拍照。 1.2.5.3.2 重组质粒的酶切鉴定:用NcoⅠ和NotⅠ双酶切鉴定acrA-pGEM-T和marA-pGEM-T质粒。将经过电泳筛选出的疑似阳性克隆质粒进行NcoⅠ和NotⅠ双酶切反应,同时做阴性克隆质粒的酶切对照。酶切反应体系为:克隆质粒,5μl;10×H Buffer,1μl ;0.1%BSA,2μl; NcoⅠ,1μl;NotⅠ1μl ;ddH2O,10μl。37℃恒温水浴2~4h。0.7%琼脂糖凝胶电泳,紫外分析仪下观察电泳结果并拍照。 1.2.5.3.3 重组质粒的PCR扩增鉴定:利用PCR反应,对经过上述鉴定的疑似阳性质粒再作PCR扩增鉴定。用引物PACR-F和PACR-R扩增鉴定acrA-pGEM-T质粒;用PMAR-F和PMAR-R扩增鉴定marA-pGEM-T质粒。取5μl PCR扩增产物在0.7%琼脂糖凝胶进行电泳,在紫外灯下观察电泳结果并进行拍照。 1.2.5.4 重组质粒的核苷酸序列测定与分析 对经上述鉴定后均符合要求的阳性克隆质粒进行序列测定(上海博亚生物技术有限公司完成),用DNAsis软件分析测序结果。 2 结果 2.1 受试药物的MIC 包括三种诱导剂(氯霉素、四环素、环丙沙星)在内的各种受试抗菌药对于质控株的MIC见表1。 2.2 诱导株的耐药性变化 四环素、环丙沙星和氯霉素三个诱导株的MIC变化详见表2。从表中可见,在四环素诱导株,除小诺霉素、妥布霉素、阿米卡星和链霉素的MIC没有明显的提高外,青霉素钾、头孢噻肟、四环素、土霉素、氯霉素、利福平、甲砜霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和头孢西丁的MIC提高幅度都有达到或超过4倍(经统计处理,MIC变化值≥4×MIC为具有显著性意义);在环丙沙星诱导株,只有头孢噻肟MIC提高倍数达到或超过了4,而其它受试抗菌药的MIC变化都没有显著性意义;氯霉素诱导株与环丙沙星诱导株相似,只有头孢噻肟的MIC提高具有显著性意义,而其他药物没有显著意义。 2.3 acrA、marA基因检测结果 2.3.1 SEMR、SEICI和ATCC25922基因组DNA的提取结果 从ATCC25922、SEMR、SEICI中提取的染色体DNA作0.7%的琼脂糖凝胶电泳,观察到一条特异带,大于23kb。见图1。 2.3.2 SEMR、SEICI、ATCC25922 acrA、marA基因的PCR扩增结果 acrA、marA 的PCR扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳,以DNA Marker DL2,000为对照,结果在约1194bp和390bp处分别出现特异的目的片段,与预计的片段大小吻合。见图2、图3。
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分类:小学体育
上传时间:2019-05-11
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