激活态雪旺细胞在细胞培养下的生长规律_cropped

激活态雪旺细胞在细胞培养下的生长规律_cropped 激活态雪旺细胞在细胞培养下的生长规律 劳杰 顾玉东 【摘要】 目的 了解激活态雪旺细胞在细胞培养下的生长规律 。方法 应用改良的雪旺细胞培养 () 法体外培养激活态雪旺细胞 ,通过激活态雪旺细胞在各生长点 3 d ,5 d ,7 d ,9 d ,11 d ,13 d的计数 ,绘制激 3活态雪旺细胞的生长曲线 。作 Lowry 蛋白测定 , H2胸腺嘧啶核甙测定 ,了解激活态雪旺细胞在细胞培养 3下的生长情况 。结果 每个时间段检测激活态雪旺细胞的生长繁殖能力 ,Lowry 蛋白含量 , H2胸腺嘧啶 ( 核甙的 含 量 , 均 数 倍 于 正 常 态 的 雪 旺 细 胞 ; 两 者 差 异 均 有 非 常 显 著 性 意 义 t = 2213 、6711 、7214 , P < ) 0. 001。结论 激活态雪旺细胞在细胞培养下具有旺盛的生长繁殖能力 。 【关键词】 许旺氏细胞 ; 细胞 ,培养的 ; 大鼠 ,Spragne Dawley ; 激活态许旺氏细胞 Gro wing rule of the activated Schwann cells in culture LAO Jie , GU Yudong. Department of Hand S urgery , Huashan Hospital , Fudan University , S hanghai 200040 , China 【Abstract】 Objective To explore the growing rule of the activated Schwann cells from adult SD rat in culture . Methods The activated Schwann cells were cultured in vitro using modified culture method. The numbers of activated ( ) Schwann cells were counted at various growing point 3 d , 5 d , 7 d , 9 d , 11 d , 13 d, then the growing curve of 3 activated Schwann cells was drawn. The Lowry protein and H ]2thymine nucleoside were checked to examine the growth of activated Schwann cells in culture . Results The proliferation of activated Schwann cells ,the Lowry protein 3 and H ]2thymine nucleoside are several folds more than the normal Schwann cells at each growing point . There was statistically significant difference between them. Conclusion The activated Schwann cells can proliferate highly in cell culture . 【 Key words】 Schwann cells ; Cell ,cultured ; Rats ,Sprague2Dawley ; Activated Schwann cells ( )( ) 学者们对雪旺细胞在周围神经再生中的作用进行 改良方法提取激活态雪旺细胞 。1 实验组 G1: 将 4 了很多的研究工作 ,雪旺细胞在周围神经再生中的作 激活态雪旺细胞 1 × 10个/ ml ,种入 44 孔培养皿中 。 41 ( ) ( ) 用也逐步被科学家们发现共 6 只 鼠 。 2 对 照 组 G2 : 将 雪 旺 细 胞 1 × 10。我们将激活态雪旺细胞 个/ ml , 种入培养皿中 ,共 6 只鼠 。2 组均在培养的第 3放置于硅胶管内 , 去修复同体 SD 大鼠周围神经的缺 天 ,第 5 天 ,第 7 天 ,第 9 天 ,第 11 天及第 13 天进行功 损 ;结果发现 , 神经的再生和相应支配肌肉肌力的恢 能检测 。 复 ,均优于新鲜神经移植段组和正常雪旺细胞放置于 2 二 、雪旺细胞的培养方法硅胶管内组。然而 ,对于激活态雪旺细胞的生长规 1 . 激活态雪旺细胞的培养方法 : 首先用 75 % 酒 律目前还缺乏了解和探索 。为此 ,我们在本实验中 ,应 精将预处理大鼠的 1 侧上肢消毒 3 次 ,取下长 1 cm 的 用改 良 的 雪 旺 细 胞 培 养 法 体 外 培 养 激 活 态 雪 旺 细 (上臂段预激活态尺神经 ;放入组织培养液 培养液中加 3 胞,绘制激活态雪旺细胞的生长曲线 ;并作 Lowry 蛋 ) 入 10 % 的小牛血清; 在放大 16 倍的手术放大镜下 , 34 白测定 ; H2 胸腺嘧啶核甙测定; 从三方面了解激活清除神经外膜及周围神经的结缔组织 ,并将神经仔细 地分成单束 ,进行机械性刺激 。然后将 12 , 16 个单 态雪旺细胞在细胞培养下的生长情况 。 束 ,剪成长约 0 . 5 mm 的小组织块 ;放入 0 . 25 % 的胰蛋 材料与方法() ( ) 白酶 2 ml和 0 . 03 % 的胰蛋白酶 2 ml 中消化 ,消化 条件为 37 ?水浴 ,时间 80 , 90 min 。然后用培养液终 一 、动物与分组 止 反 应 , 用 金 属 筛 过 滤 , 滤 出 液 用 1 500 r/ min 离 心 成年 SD 大鼠 12 只 ,均为雄性 ,体重 100 , 120 g 。 5 min ,其底 部 的 沉 淀 物 即 为 提 取 到 的 激 活 态 雪 旺 细 将大鼠进行预激活后 ,取出其上臂段尺神经 1 cm 。按 胞 。然后稀释到 1 ml ,并计数. 将激活态雪旺细胞 1 × 4 10个/ ml 种入培养皿中 。放入二氧化碳培养箱 ,温度 ( ) 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 30170965; 国家 973 创伤 为 37 ?, 二氧化碳浓度为 5 % 。每 5 , 7 d 更换 1 次 ( ) 基础研究基金资助项目 G1999054202; 国家教委优秀青年教师基金资 培养液 。助项目 ;上海市曙光 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 资助项目 ,国家教育部留学归国人才基金资助 项目作者单位 :200040 上海 , 复旦大学华山医院手外科 2 . 正常雪旺细胞的培养方法 : 用 75 % 酒精将大 结果 鼠 1 侧上肢消毒 3 次 ,取出上臂段尺神经 1 cm ;放入组 ( ) 一 、细胞的生长曲线 织培养液 培养液中加入 10 % 的小牛血清; 在放大 ( ) 培养后每个时间段的雪旺细胞数见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1 。1激 16 倍手术放大镜下 ,清除神经外膜及周围神经的结缔 活态雪旺细胞在培养后第 3 天 ,平均每个培养皿中的 组织 ,将 12 , 16 束单束神经 ,剪成长约 0 . 5 mm 的小 4 ( ) 细胞数增长到 4 . 9 ? 0 . 8×10个/ ml , 以后不断增 () 组织块 ;放入 0 . 25 % 的胰蛋白酶 2 ml和 0 . 03 % 的胰 4 (() ) 长 ,到第 13 天达到 470 . 3 ? 12 . 5× 10个/ ml 。2正( ) 蛋白 酶 2 ml 中 消 化 。消 化 条 件 为 37 ?水 浴 , 时 间 常雪旺细胞在培养后第 3 天 ,平均每个培养皿中的 细4 80 , 90 min 。然 后 用 培 养 液 终 止 反 应 ; 用 金 属 筛 过 () 胞数增长到 1 . 8 ? 0 . 3× 10个/ ml , 以后不断增 长 ,4 () 到第 13 天达到 49 . 6 ? 3 . 5× 10个/ ml 。 滤 ,滤出液用 1 500 r/ min 离心 5 min ,其底部的沉淀物 在每个检测时间段激活态雪旺细胞生长繁殖的能 即为所提取到的雪旺细胞 。然后稀释到 1 ml ,并计数 ; 力 ,要比正常雪旺细胞强数倍 。激活态雪旺细胞与正 4 将雪旺细胞 1 ×10个/ ml 种入培养皿中 。放入二氧化 常雪旺细胞的数量 ,每个时间段相比差异均有非常显 碳培养箱 ,温度为 37 ?, 二氧化碳浓度 5 % 。每 5 , ( ) 著性意义 P < 0 . 001 ,表 1。 7 d 更换培养液 1 次 。 二 、Lowry 蛋白含量 三 、测定项目 每个检测时间段的 Lowry 蛋白含量见表 2 。激活 态雪旺细胞在培养后第 3 天 ,平均每个培养皿激活态 1 . 生长曲线测定 , 在培养后的第 3 , 5 , 7 , 9 , 11 和- 3() μ雪旺细胞的蛋白含量为 25 . 6 ?2 . 0×10 g/ ml ,第 13 d ,分别取 6 个培养皿检测 。先吸出培养液 ,加胰酶 消化数分钟 。吸出消化液再把原培养液倒回 ,吹打培 养液底部将细胞制成悬液 ,计算出每 ml 细胞数 ,并绘 - 3 成曲线图 。 ( μ) 7 天时每个为 60 . 0 ? 2 . 6×10 g/ ml ,达最高点 。 - 3 2 . Lowry 蛋白的测定 : 培养后的第 3 ,5 ,7 ,9 ,11 和(μ) 第 13 天时则降至最低为 15 . 0 ? 1 . 4×10 g/ ml 。13 d 测定 。先配制不同浓度的 BSA 标准溶液制作标 正常雪旺细胞在培养后第 3 天 ,平均每个培养皿 - 3 准曲线 。弃去培养孔内营养液 ,用 0 . 15 mol/ L Nacl 洗 (μ) 雪旺细胞的蛋白含量为 4 . 0 ? 0 . 4×10 g/ ml ,第 - 33 次 。然后加入 0 . 25 mol/ L NaDH 置室温下 30 min ,移 (μ) 5 天为 11 . 5 ?1 . 2×10 g/ ml ,达最高点 。第 13 天 时 - 3人试管内 ,再加等量 0 . 25 mol/ L Hcl 中和 。加人 Lowry (μ) 则降至最低为 0 . 7 ? 0 . 1×10 g/ ml 。 试剂 摇 匀 后 置 室 温 下 30 min , 用 紫 外 线 光 谱 仪 在 每个时间段激活态雪旺细胞的 Lowry 蛋白含量均 750 nm光段测读数 ,绘制曲线图 。高于正常雪旺细胞的含量 。在每个检测时间段两者相 33 3 . H2胸腺嘧啶核甙的测定 : 利用同位素 H标记 ( ) 比 ,差异均有非常显著性意义 P < 0 . 001 ,表 2。 3 胸腺嘧啶核甙后测定 。H标记胸腺嘧啶核甙可作为 3 三 、H 2 胸腺嘧啶核甙的含量 DNA 合成物 ,检测量为雪旺细胞增殖的活力 。测试日 4 3 ( )表 1 各时间段每个培养皿细胞的平均数量 x ? ? s , × 10/ ml 期也是培养后的第 3 ,5 ,7 , 9 ,11 和 13 d 。配制并将 H 数量 激活态雪旺细胞数 正常雪旺细胞数 标记胸腺 嘧 啶 核 甙 培 养 液 加 于 培 养 皿 内 , 置 37 ?含 组别 t 值 P 值 ( )( ) ( ) G1 G2 培养皿 5 % CO的 培 养 箱 内 4 h , 弃 去 培 养 皿 内 液 体 用2 0d 组 44 个 1 . 0 ? 0 . 0 ?0 . 0 1 . 0 - - 22 . 3 0 . 000 3d 组44 个4 . 9 ? 0 . 81 . 8 ?0 . 30 . 15 mol/ L Nacl 洗 1 次 。加人 0 . 25 mol/ L Nao H 置室 99 . 3 0 . 000 5d 组44 个12. 1 ? 0 . 71 . 9 ?0 . 3温下 20 min 以 溶 解 细 胞 , 并 移 入 试 管 内 。用 等 量 约 44 . 2 0 . 000 7d 组44 个37. 1 ? 5 . 04 . 2 ?0 . 6 0 . 25 mol/ L Hcl 中和反应 ,加入含有 BSA 的 Hepes 2 Mg 235 . 0 0 . 000 9d 组44 个110. 7 ? 2 . 711 . 8 ?1 . 1 11d 组44 个276. 0 ?14 . 631 . 7 ?1 . 4110 . 4 0 . 000 2 Ca 试剂和 10 uPCA ,放置 - 20 ?冰箱过夜 ,次日放于 470 . 3 ?12 . 5 49 . 6 ?3 . 5 239 . 0 0 . 000 13d 组44 个4 ?中 20 min 。用 12 000 r/ min 低温离心沉淀 30 min , - 3 弃去上清液 ,用 0 . 25 mol/ L NanH 溶解沉淀物 。移人测 ( μ) 表 2 每个时间段细胞的平均蛋白含量 x? ?s , ×10 g/ ml 数量 平均蛋白含量 平均蛋白含量 试管内 ,加入闪烁液弃去闪烁测量仪内测试读数 。 组别 t 值 P 值 ( ) ( ) ( ) 培养皿/ 细胞 G1 组/ 细胞 G2 组所得数据用 SPSS 软件 t 检验方法进行统计学处 3d 组 44 24. 8 ?1 . 7 ?1 . 1 5 . 8 67 . 1 0 . 000 44 33 . 8 0 . 000 5d 组22. 3 ?1 . 47 . 5 ?2 . 8理 。 44 61 . 6 0 . 000 7d 组17. 4 ?1 . 62 . 2 ?0 . 35 4 . S2100 蛋白标记:用免疫组织化学的方法 ,用 44 32 . 2 0 . 000 9d 组8. 0 ?1 . 22 . 0 ?0 . 4S2100 蛋白标记每个时间测定点提取出来的细胞 ,细胞 44 30 . 3 0 . 000 11d 组7. 2 ?1 . 21 . 8 ?0 . 3 44 6 . 8 ?0 . 9 1 . 3 ?0 . 4 34 . 2 0 . 000 13d 组呈棕色为阳性 ,表明这些细胞为雪旺细胞 。 3 起到了主导的作用 。 旺细胞组在培养后第 3 天 H2 胸腺嘧啶核甙的含量最- 2 Mapkinase 相关蛋白的表达及 激活态雪旺细胞的 () 高 ,为 24 . 8 ? 1 . 7×10 CPM/ 每个细胞 。第 13 天 的 - 2 细胞周期相关蛋白的表达也是非常重要的 , 我们将进 () 含量最低为 6 . 8 ? 0 . 9×10 CPM/ 每个细胞 。正 常雪 3一步研究 ,通过对激活态雪旺细胞的 Mapkinase 相关蛋 旺细胞组在培养后第 5 天 H2胸腺嘧啶核甙的含 量最() - 2 白 如 CDC 类的表达和细胞周期相关蛋白的表达 ,了 ( ) 高为 7 . 5 ? 2 . 8×10 CPM/ 每个细胞 。第 13 天的含 解在激活雪旺细胞的过程中这些相关蛋白的变化 ,了 - 2 () 量最低为 1 . 3 ? 0 . 4×10 CPM/ 每个细胞 。 每个检测解激活态雪旺细胞进行激活的作用点 ,揭示激活态雪 3时间段激活态雪旺细胞组 H2 胸腺嘧啶 核甙的含量均旺细胞机制 。 高于正常雪旺细胞组的含量 。两者相比 雪旺细胞分泌的促进周围神经再生的神经营养因 ( ) 差异均有非常显著性意义 P < 0 . 001 ,表 3。 我们子 ,这些神经再生因子如 BDNF 和 CNTF 等在周围神经 再生中起到了非常重要的作用 。然而 ,激活态雪旺细 应用了 S2100 蛋白标记 , 发现这些细胞均为 胞所分泌的神经再生因子是否与正常态雪旺细胞分泌 阴性 ,棕色 ,表明这些细胞为雪旺细胞 。的这些神经再生因子不同 ? 是由于分泌的神经再生因 子的量不同 ,还是由于激活态雪旺细胞分泌的神经再 生因子与正常态雪旺细胞分泌的神经再生因子是不同 讨论 的神经再生因子 ,即激活态的雪旺细胞分泌了其所特 ,在培养后每个时 应用改良的雪旺细胞培养方法 有的因子 ,从而使激活态雪旺细胞有非常旺盛的生长 3间段检测细胞的生长能力 、Lowry 蛋白含量和 H2胸腺 繁殖能力和促进神经的再生 ? 如果是 ,那这些特有因 嘧啶核甙的含量 。结果证实激活态雪旺细胞组每个时 子是什么以及其生物化学特性如何 ? 这些问题和因素 间段的繁殖能力较正常雪旺细胞组要强数倍 ,Lowry 蛋 均有待于我们进一步的 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 、发现 、探索和研究 。 3应用组织工程合成人工神经的关键是支架和种子 白含量和 H2胸腺嘧啶核甙的含量均高于正常雪旺细 细胞 , 目前的研究结果是 ,组织工程合成的人工神经 胞组 。每个时间段两组的结果相比差异均有非常显著 仅能代替自体神经 ,而其促进神经再生的能力尚未见 ( ) 性意义 P < 0 . 001。 报道 。激活态雪旺细胞的研制为组织工程合成人工神 激活态雪旺细胞非常旺盛的生长繁殖能力 ,说明 经提高优质的能促进神经再生的种子细胞开辟了新的 激活态雪旺细胞生长和增生的特性都不同于正常态的 方法 。本研究为组织工程合成人工神经提供了理论依 雪旺细胞 。在激活态雪旺细胞培养时 ,我们观察到激 据 ,为在临床上应用激活态的雪旺细胞修复周围神经 活态雪旺细胞的贴壁速度比正常态雪旺细胞要快很 缺损提供实验和理论依据 。 多 ,同时激活态雪旺细胞分裂的增长速度也加快并有 一定的规律性 。为研究上述变化 ,我们准备通过进一 步的观察 ,探索激活态雪旺细胞生长和增生的规律 ,以 了解激活态雪旺细胞与正常态雪旺细胞在形态学上的 异同 。 本组在同体 SD 大鼠动物实验中 , 将激活态雪旺 细胞放置于硅胶管内 , 修复同体 SD 大鼠周围神经缺 损 ,结果观察到其神经的再生和相应支配肌肉肌力的 参 考 文 献 恢复 ,均优于新鲜神经作为神经移植段和应用正常雪 1 Levi ADO , Guenard V , Aebicher P. The Functional charicteristics of 旺细胞置于硅胶管后去修复同体 SD 大鼠周围神经缺 Schwann cells cultured from human peripheral nerve after transplantation 损的效果 。我们认为 ,这一现象完全是由于激活态雪 into a gap within the rat sciatic nerve . J Neuroscience , 1994 , 14 : 13092 1319 . 劳杰 , 熊良俭 , 顾玉东 , 等. 应用激活态的雪旺细胞填充导管修 2 复周围神经缺损的初步研究. 中华手外科杂志 ,2000 ,16 :2362240 . 劳杰 , 熊良俭 , 顾玉东 , 等. 改良成年 SD 大白鼠雪旺细胞培养的 3 实验研究. 中华手外科杂志 ,1999 ,15 :1062108 . 3 ( )表 3 每个培养皿平均 H ]2胸腺嘧啶核甙的含量/ 细胞 x? ?s Wu HT , Hung L K , Lao J . lmproving the rate of shin keratino cyte culture2 G1 组的含量/ 细胞 组的含量/ 细胞 G2 4 数量 appl :cation of a lynphocyte isolation fluid. Chin J Plast Surg Burns ,1998 , 组别 t 值 P 值 - 2- 2 ( ) 培养皿×10 CPM×10 CPM14 :1122114 . 3d 组 44 25 . 6 ?2 . 0 ?0 . 4 4 . 0 70 . 4 0 . 000 Weist APC , Dorfman HD , Maryland B. S2100 protein in humar cartilage 44 102 . 3 0 . 000 5d 组35 . 2 ?1 . 67 . 1 ?0 . 75 () lesions. J Bone Joint Surg Am,1986 ,68 :5212526 . 44 109 . 2 0 . 000 7d 组60 . 0 ?2 . 611 . 5 ?1 . 2 44 84 . 0 0 . 000 9d 组32 . 3 ?1 . 85 . 9 ?0 . 8( )收稿日期 :2002206211 44 118 . 5 0 . 000 11d 组30 . 7 ?1 . 62 . 1 ?0 . 3()本文编辑 :杨小英 44 15 . 0 ?1 . 4 0 . 7 ?0 . 1 65 . 3 0 . 000 13d 组