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RANK嵌合体的构建及其在研究破骨细胞分化中的意义.doc

RANK嵌合体的构建及其在研究破骨细胞分化中的意义.doc

上传者: 喜爱西艾 2017-09-27 评分 4.5 0 58 8 262 暂无简介 简介 举报

简介:本文档为《RANK嵌合体的构建及其在研究破骨细胞分化中的意义doc》,可适用于人文社科领域,主题内容包含RANK嵌合体的构建及其在研究破骨细胞分化中的意义DOC格式论文,方便您的复制修改删减TNFRRANK嵌合体的构建及其在研究破骨细胞分化中的意义(作符等。

RANK嵌合体的构建及其在研究破骨细胞分化中的意义DOC格式论文,方便您的复制修改删减TNFRRANK嵌合体的构建及其在研究破骨细胞分化中的意义(作者:单位:邮编:)作者,许多荣,罗绍凯,童秀珍,李娟【摘要】【目的】构建肿瘤坏死因子受体(TNFR)膜外部分和核转录因子NFκB受体激动剂,RANK,跨膜及膜内部分相结合的嵌合体,探讨其在破骨细胞(OC)分化中的意义。【方法】克隆TNFRRANK嵌合体的cDNA,用platE将其包装成逆转录病毒,通过感染将这种逆转录病毒转染到敲除TNFRR基因的小鼠(TNFRR)骨髓巨噬细胞(BMM)中,用TNFɑ刺激,分别观察OC的分化及骨的重吸收能力,用WesternBlot方法证实TNFRRANK是通过NF资B、JNK、P和ERK蛋白的磷酸化来调节OC的分化和功能。【结果】在TNFɑ刺激下,BMM能分化成OC,而且分化出的OC能明显地导致骨质破坏。TNFɑ刺激BMMmin后磷酸化的NF资B、JNK、P和ERK蛋白的表达明显增强。【结论】TNFRRANK嵌合体具有完整的分子结构和生物功能,可作为研究DOC格式论文,方便您的复制修改删减RANK结构、功能及其信号途径的一个简便、有效的生物工具。【关键词】TNFRRANK嵌合体,破骨细胞,分化,克隆破骨细胞(osteoclast,OC)的分化受两个重要细胞因子的调节,单核巨噬细胞集落刺激因子(monocytemacrophageclonestimulatingfactor,MCSF)和核转录因子NFκB受体激动剂的配体,ligandofreceptoractivatorofnuclearfactorkappaB,RANKL,。MCSF主要维持OC的生长,RANKL则促进OC的定向分化。RANKL必须与其受体RANK结合,再通过NF资B、JNK、P和ERK蛋白的磷酸化来调节OC的分化和功能,所以RANK是起作用的关键环节。正常的骨髓巨噬细胞(BMM)中存在内源性RANK,但很难直接在机体活细胞内研究其结构和功能。为了克服这一难题,我们成功地构建了一种新的肿瘤坏死因子受体核转录因子NFκB受体激动剂(tumornecrosisfactorreceptorreceptoractivatorofnuclearfactorkappaB,TNFRRANK)嵌合体(chimera),其膜外部分由TNFR膜外部分组成、膜内部分由RANK跨膜和膜内部分组成,它具有完整的分子结构和生物功能,完全可以替代内源性RANK的作用,现报道如下。材料和方法材料野生型Ch小鼠购于美国HarlanIndustriyinIndianapolis,肿瘤坏死因子受体基因敲除小鼠,TNFRR,购于美国theJacksonLaboratory(BarHarbor,ME),质粒pBluescriptSK、质粒DOC格式论文,方便您的复制修改删减PMXpuro、包装细胞PlatE、MCSF、GSTRANKL:由美国阿拉巴马大学伯明翰分校(UniversityofAlabamaatBirmingham)病理实验室XuFeng教授提供,抗体IκBα、PhosphoIκBα、SAPKJNK、PhosphoSPAKJNK、PMAPKinase、PhosphoPMAPKinase、PMAPkinase、PhosphoPMAPkinase及磷酸酶抑制剂和磷酸酶抑制剂购于美国CellSignaling公司。用于扩增TNFR膜外部分,TNFRExt,的cDNA引物序列为(美国Sigma公司合成),P:′TCTAGAATGGGTCTCCCCACCGTGCCTGGCCTGCTG′,P:′TCTAGAACCTGAGTCCTGGGGGTTTGTGACATTTGC′,两端酶切位点均为Xba,。用于扩增RANK跨膜、膜内部分(RANKTMRANKCyt)cDNA引物序列为,P:′TCTAGAATGGGTCTCCCCACCGTGCCTGGCCTGCTG′,P:′TCTAGAACCTGAGTCCTGGGGGTTTGTGACATTTGC′,P的′含Spe,P的′含BamH、stopcode和mLu,。方法细胞培养CH小鼠、TNFRR小鼠的BMM和包装细胞PlatE培养参考。质粒PMXTNFRRANK的克隆TNFRRANK主要由两个部分组成,TNFR膜外部分,TNFRExt,、RANK跨膜和膜内部分,RANKTMRANKCyt,。先培养正常小鼠BMM,再从BMM中提取总RNA,用RTPCR分别获得带有酶切位点的TNFRExt片段和DOC格式论文,方便您的复制修改删减RANKTMRANKCyt片段。利用Xba酶切位点将TNFRExt片段克隆到质粒pBluescriptSK上,再用Spe和BamH酶切位点将RANKTMRANKCyt片段克隆到质粒pBluescriptSK上。这样,整个TNFRRANK的cDNA就被克隆到质粒pBluescriptSK上。然后再利用Not和EcoR切下含TNFRRANK的cDNA并亚克隆到质粒PMX上,最后完成PMXTNFRRANK的构建,图,。重复实验次以上,直至所有克隆序列最后都经测序证实是正确无误的。表达PMXTNFRRANK的逆转录病毒的包装在上述准备好的PlatE细胞培养盘中加入μg构建好的质粒PMXTNFRRANK,利用脂质体PlusTMReagent(InvitrogenCatNo:)、LipofectamineTMReagent(InvitrogenCatNo:)将质粒PMXTNFRRANK转入包装细胞PlatE中,连续d收集含逆转录病毒的细胞培养液,并用直径μm滤膜过滤备用。逆转录病毒感染BMM及其感染效率的鉴定向培养好的BMM培养盘(mmmm)中加入mL含病毒悬液、mLα培养液、μLpolybrene,SigmaH,终浓度为μgmL,和MCSF(终浓度为ngmL)。第天用puromycin,SigmaP,终浓度为μgmL,筛选出病毒感染的阳性细胞。分别收集个未感染(unifected)BMM和感染后的(infected)BMM,作直接免疫荧光标记(DirectImmunofluorescenceLabeling)实验以鉴定TNFRRANK的逆转录病毒能否感染BMM,以及感染后DOC格式论文,方便您的复制修改删减TNFRRANK蛋白能否表达在BMM的细胞膜上。破骨细胞形成实验将感染和未感染的BMM,,分别加入孔培养孔中,加入mLα培养液,再分别加入ngMCSF、ngMCSFngRANKL、ngMCSFngTNFа不同组合的细胞因子。每隔d更换培养液及各细胞因子次,观察OC形成并进行TRAP染色。骨重吸收实验用切片机将鲸鱼牙片制成约cmcm大小的薄片,放入PBS溶液中高压灭菌后备用。在选择孔培养板中的培养孔中,每孔加入一块牙片,磷酸缓冲液浸泡h后除去缓冲液,然后再向孔中个感染后的BMM,并加入ngMCSF、ngMCSFngRANKL、ngMCSFngTNFа不同组合的细胞因子,放入、的CO培养箱中,进行培养。每两天更换培养液及细胞因子一次。当OC出现高峰后~d取出骨片,用molL氢氧化氨清除骨片上残留细胞,晾干。液氮下镀金h。最后,在电镜下观察骨吸收情况,并摄片。Western免疫印迹检测NF资B、JNK、P和ERK蛋白的磷酸化。结果逆转录病毒感染TNFRR小鼠的BMM及其效率的鉴定直接免疫荧光标记实验结果发现,感染后的阳性细胞所携带的荧光明显增强,其峰值明显右移(图)。这表明嵌合体TNFRRAMK蛋白不仅能成功地表达,而且表达在BMM的细胞膜上。DOC格式论文,方便您的复制修改删减OC形成实验证实TNFRRANK具有诱导OC分化的功能OC形成实验结果表明,未感染组和感染组BMM单独在MCSF刺激下不能形成OC,但在MCSFRANKL刺激下两组均出现了OC,这正说明了内源性RANK能诱导OC形成,重要的是,在MCSFTNFɑ刺激条件下,感染的BMM出现大量的OC,而阴性对照未发现OC,表明这个外源性的TNFRRANK嵌合体能诱导BMM分化成OC。骨吸收实验证实TNFRRANK具有调节骨的重吸收功能骨吸收实验结果表明,感染后的BMM不仅能分化成OC,而且分化出的OC具有骨的重吸收能力,图,。TNFRRANK通过NFkB、JNK、P和ERK蛋白的磷酸化调节OC的分化和功能在本实验中,我们用RANKL刺激感染后细胞,UninfectedBMM,作为阳性对照组、TNFα刺激未感染细胞,UninfectedBMM,作为阴性对照组,然后用TNFα刺激感染后细胞作为观察组进行westernblot实验,观察IкB、JNK、ERK、P蛋白磷酸化的情况,图,。结果证实,在阴性对照组中,pIкB、pJNK、pERK、pP在、、min无变化趋势。重要的是观察组和阳性对照组一样,在受刺激min后,磷酸化的蛋白明显升高。这表明,TNFRRANK嵌合体中的外源性RANK和内源性RANK一样,也能激活I资B、JNK、ERK、P蛋白的磷酸化。讨论DOC格式论文,方便您的复制修改删减在BMM中构建TNFRRANK嵌合体的重要性RANK主要分布在骨髓巨噬细胞、激活的T淋巴细胞表面,在肾性骨病、风湿性关节炎和多种恶性肿瘤的骨损害方面起着重要的作用。要想知道RANK在OC生成、激活和分化中的作用,首先必须清楚RANK具有功能的结构部分。由于BMM存在内源性RANK的干扰,往往给我们研究其结构和功能带来很大困难。为了排除这种干扰,我们设计了TNFRRANK这个嵌合体,当它被转染到TNFRTNFR基因敲除小鼠的BMM中后,再用TNFa刺激,其本身内源性的RANK就不再起作用,起作用的是TNFRRANKchimera这个外源性RANK。在分子生物学的研究中,改变一个外源性基因的结构通常比改变其内源性基因结构更为容易、简便。因此,我们根据实验的需要,通过改变这个外源性RANK的结构,然后将其感染到BMM中,再观察其功能,就可很容易找出RANK具有功能的结构部分及其在OC分化中的传导途径。另外,近年来多位学者对RANK和TRAF之间的关系作了很多研究,但他们之间的结果存在很大的争议,究其原因发现他们的研究大多在、Hela等细胞系或酵母菌中进行,这些细胞或细菌本身不能分化成OC,和生理条件相差很远。我们在能分化成OC的BMM中研究RANK信号传导,模拟更接近生理环境,得出更准确结论。构建的TNFRRANKchimera结构和功能的正确性在TNFRRANKchimera构建的过程中,所有的克隆都经测序证实其cDNA序列是完全正确的。直接免疫荧光标记法也证实了DOC格式论文,方便您的复制修改删减TNFRRANK蛋白能成功表达在BMM细胞膜上,用TNFɑ和MCSF刺激表达TNFRRANK的BMM,不仅诱导出了OC,而且证实这些OC和内源性的OC具有相同的吸收骨的能力。同时,我们还证实,TNFRRANK嵌合体中的外源性RANK也和内源性RANK一样,通过I资B、JNK、ERK、P蛋白的磷酸化调节OC的分化和功能。所以,我们构建的TNFRRANKchimera具有完整的结构和功能,可为研究RANK在OC形成、分化及其信号传导中的作用提供一个有效的生物工具。【参考文献】YASUDAH,SHIMAN,NAKAGAWAN,etalOsteoclastdifferentiationfactorisaligandforosteoprotegerinosteoclastogenesisinhibitoryfactorandisidenticaltoTRANCERANKLJProcNatlAcadSciUSA,,():KONGYY,YOSHIDAH,SAROSII,etalOPGLisakeyregulatorofosteoclastogenesis,lymphocytedevelopmentandlymphnodeorganogenesisJNature,,():KODAMAH,YAMASAKIA,NOSEM,etalCongenitalosteoclastdeficiencyinosteopetrotic(opop)miceiscuredbyinjectionsofmacrophagecolonystimulatingfactorJJExpMed,DOC格式论文,方便您的复制修改删减,():INOUEJ,ISHIDAT,TSUKAMOTON,etalTumornecrosisfactorreceptorassociatedfactor(TRAF)family:adapterproteinsthatmediatecytokinesignalingJExpCellRes,,():XUD,SHIZ,MCDONALDJ,etalDevelopmentofachimacricreceptorapproachtostudysignalingbytumournecrosisfactorfamilymembersJBiochemJ,,():,许多荣,余学清,方荸荠PTH在体外对破骨细胞分化及骨重吸收能力的影响J中华肾脏病杂志,,():ROATOI,GRANOM,BRUNETTIG,etalMechanismsofspontaneousosteoclastogenesisincancerwithboneinvolvementJFASEBJ,,():ICHIKAWAH,MURAKAMIA,AGGARWALBB′acetoxychavicolacetateinhibitsRANKLinducedosteoclasticdifferentiationofRAWmonocyticcellsbysuppressingnuclearfactorkappaBactivationJMolCancerRes,,():DOC格式论文,方便您的复制修改删减WONGBR,JOSIENR,LEESY,etalTheTRAFfamilyofsignaltransducersmediatesNFKappaBactivationbytheTRANCEreceptorJJBioChem,,():DARNAYBG,NIJ,MOOREPA,etalActivationofNFkappaBbyRANKrequirestumornecrosisfactorreceptorassociatedfactor(TRAF)andNFkappaBinducingkinaseIdentificationofanovelTRAFinteractionmotifJJBiolChem,,():

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