【DOC】均匀设计法优化乳酸氧化酶提取工艺

【DOC】均匀设计法优化乳酸氧化酶提取工艺 均匀设计法优化乳酸氧化酶提取工艺 食品研究与羿发科学研究 均匀设计法优化乳酸氧化酶提取工艺 王艳.周林.张蓝之.姚丽丽 (中南大学化学化工学院,湖南长沙410083) 摘要:采用均匀设计法对耻垢分枝杆菌AS1.05622种细胞破碎方法进行了研究,得到超声波法和冻融法提取乳 酸氧化酶的最佳工艺条件.实验结果表明,超声波法的优化工艺条件为:超声功率100w,超声时间8min,磷酸盐缓 冲液pH7.8;冻融法的优化工艺条件为:冻融次数4次,解冻时间25min,解冻温度37?,磷酸盐缓冲液pH7.4.在优 化工艺条件下,超声波法提取效果要优于冻融法. 关键词:均匀设计;乳酸氧化酶;提取 0PnMIZETHEEXTRACTl0PR0CESSOFTHELACAI’E0XIDASEF’R 0MyGOC7E尺 SEG朋SBYTHEUNIF0RMDESIGN WANGYan,ZHOULin,ZHANCLan—zhi,YAOLi-li (SchoolofChemistryandChemicalEngineering,CentralSouthUniversity,C hangsha410083,Hunan,China) Abstract:ThispaperdiscussestwonormalmethodsofextractingLactateOxid asefromMycobacteriumSm— egmatisbytheUniformDesign.rnleoptimalextractingconditionsofultrasonicprocessingareasfollows:the out-putpowerofultrasonic100W,thetotahreatmenttimeofultrasonic8min,thepHofphosphatebuffer7.8. Theoptimalextractingconditionsoffreezingandthawingmethodareasfollows:thefreezingandthawingtimes4, thethawingtime25min,thethawingtemperature37oC,thepHofphosphatebuffer7.4.,nleultrasonicprocessing iSmoresuitabletoextractLactateOxidasethanthefreezingandthawing. Keywords:Unifol’InDesign;LactateOxidase;extraction 乳酸氧化酶(EC1.1.3.2)能催化乳酸氧化成丙酮 酸,丙酮酸是一种重要的医药中间体和化工产品,可作 为工业上氨基酸生产的原料,一些农药和植保产品合 成的有效起始物质,动物细胞培养基的添加物,还可用 作者简介:王艳(1969一),女(汉),副教授,博士,研究方向:酶工程与 生物转化. 来合成一种无公害的制冷剂,乳酸氧化酶固定化后,在 转化乳酸生产丙酮酸的过程中不需要外源辅酶,可大 大降低生产成本,也不存在丙酮酸与辅酶分离的问题, 因此乳酸氧化酶生物转化乳酸生产丙酮酸的研究成为 了当前的研究热点之一.此外乳酸氧化酶可作为医疗 诊断试剂,用来测定血液中乳酸浓度,对早期诊断和处 理高乳酸血症和乳酸中毒具有非常重要的临床价值[31. ???? haviourofstaphylococcus~reusduringsufuproductionatlaborato- ryscale.FoodControl,2005,16:243~247. [19】ResslandE.,AndersenBorgeG.I.,LangsrndT.andrhaugT.Inhi- bitionofBacilluscereusbystrainsofLactobacillusandLactococcus inmilk.InternationalJournalofFoodMicrobiology,2003,89:205- 212 【20】InghamS.C.,Su~-CandSpangenbergD.S.Survivalofsalmonella typhim~riumandEscherichiacol015~H7incheesebrines.Inter- nationalJournalofFoodMicrobiology,2000,61:73~79. [211Ricke,S.C.Perspectivesontheuseoforganicacidsandshortchain fattyacidsasantimicrobials.PoultryScience,2003,82(4):632, 639. [22】Gon~alvesL.M.D.,RamosA.,AlmeidaJ.S.,XavierA.M.R.B.& LarrondoM.J.T.Elucidationofthemechanismoflacticacidgrowth inhibitionandproductioninbatchculturesofLactobacillusrham— nosus.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,1991,48:346-350. 【23]RussellJ.B.Anotherexplanationforthetoxicityoffermentation acidsatlowpH:anionaccumulationversusuncoupling.Journalof Appliedbacteriology,1992,73:363-370. 收稿日期:2006—01—24 科学研究餐晶研究与并发2oo6.v0|.27.NO.1o 目前,国内外关于利用乳酸氧化酶制作酶电极和生物传 感器的研究是另一个研究热点.因此,乳酸氧化酶的 研究具有很好的实际意义和应用前景. 乳酸氧化酶是胞内酶,文献报道【6卅该酶热稳定比 较差,温度高于65qC时,酶蛋白会变性失活,如何将其 尽可能提取出来并使酶活损失最小是需要解决的一个 关键性问题,而细胞破碎方法和提取工艺条件直接影 响到该酶提取的效果.本实验以耻垢分枝杆菌(My— cobacteriumSmegmatis)AS1.0562为原材料,采用均匀 设计法分别考察了超声波法和冻融法在不同工艺条件 下提取乳酸氧化酶时对该酶酶活性的影响,以期达到 优化乳酸氧化酶提取工艺的目的. 1材料和方法 1.1菌种 耻垢分枝杆菌(AS1.0562),购自中科院微生物研 究所. 1.2培养基 1.2.1斜面培养基 简化琼脂培养基?,pH7.4. 1.2.2发酵培养基 甘油30g,蛋白胨4g,DL一乳酸10g,VB10.05g, KH2P04”H200.5g,MgS04~7H200.5g,Fe(NH4)2(so4)2’ 6H200.1g,蒸馏水定容至1000mL,用4mol/L的 NaOH溶液调pH至7-4. 1.3主要试剂和仪器 DL一乳酸(长沙南方化工试剂厂,分析纯),2,4一二 硝基苯肼(国药集团化学试剂有限公司,分析纯),其它 试剂均为分析纯.722型分光光度计(上海精密科学仪 器有限公司),SPX一100生化培养箱(湘仪离心机仪器 有限公司),TGL一20M台式高速冷冻离心机(湘仪离心 机仪器有限公司),超声波细胞粉碎仪(宁波新芝股份 有限公司). 1-4培养和实验样品制备 挑取斜面菌种一环接入装50mL培养液的250mL 三角瓶中,37qC静置培养4d.发酵液4000r/min离 心15min,用蒸馏水洗涤2次,收集湿菌体.准确称取 0-3g湿菌体,加入50mL不同pH值的磷酸盐缓冲液 混匀后得到实验用样品,样品在不同细胞破碎方法和 不同工艺条件下破碎后,12000r/min离心15rain,测 上清液酶活力. 1.5酶活测定方法 取试管加入磷酸缓冲液0.5mL,20mmol/L乳酸 溶液0.2mL,酶液0-3mL(空白管不加),37qC水浴保 73 温10min,然后加入1mmol/L2,4一二硝基苯肼0.5mL, 37qC水浴保温20min,加入0.04mol/LNaOH溶液 5mL终止反应(空白管此时补加0-3mL酶液),520rim 比色,通过 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线计算酶活[ttl.酶活单位规定:1 min催化乳酸生成1nmol丙酮酸的酶量为1个酶活力 单位(U). 2结果与分析 2.1均匀设计法优化超声波提取工艺 2.1.1 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 与结果 应用均匀设计安排多因素多水平实验,较正交设 计可以大大减少实验次数,节省大量时间和成本.还能 保证实验点在实验范围内充分均匀分散,通过多元回 归分析确定最优化模型. 固定超声波频率为20kHz的条件下,考察了超声 功率,超声时间,磷酸盐缓冲液pH3个因素对乳酸氧 化酶酶活力的影响,选择均匀设计表U(8x4)来安排 实验(见表1),各实验均重复3次,取平均值为乳酸氧 化酶的酶活力. 表1超声波法实验方案表 注:x超声功率(w);xz超声时间(min);x,磷酸盐缓冲液pH;Y酶 活力(U/mL);下同. 2.1.2回归分析 表1均匀实验结果经多元线性回归统计处理[121, 复相关系数R=0.984,回归方程:Y=62.807—0.075XI+ 1.191x2+0.434X3,方差分析见表2,F,---40.9>F?I(3,4)= 16.69,回归方程极其显着,该回归方程是可信的. 表2超声波法方差分析结果 由回归方程可知:X.的系数为负,表明超声波提 742oo6,V0|27,NO,1o食品研究与开发科学研究 取功率对乳酸氧化酶酶活力是负相关影响,x:,的系 数为正,表明超声提取时间和磷酸盐缓冲液pH对乳 酸氧化酶酶活力是正相关影响.究其原因,超声波对菌 悬液主要产生独特的机械振动作用和空化作用.空化 作用是在有相当大的破坏应力作用时,液体内形成空 化泡的现象,空化泡在瞬间迅速涨大并破裂,破裂时把 吸收的声场能量在极短的时间和极小的空间内释放出 来,形成高温和高压的环境,同时伴随有强大的冲击波 和微声流,从而破坏细胞壁结构,使其在瞬间破裂,乳 酸氧化酶得以释放,直接进入磷酸盐缓冲液并充分混 合.超声功率越大细胞破碎效果越好,但是由于乳酸氧 化酶蛋白在高温下容易变性失活,因此在剧烈条件下 实际提取效果并不理想,乳酸氧化酶酶活力比较低.而 在温和的提取条件下,适当延长提取时间有利于提高 乳酸氧化酶酶活力. 对各偏回归系数标准化,3个标准化偏回归系数 分别为:Px.=0.991,Pra=0.154,Px3=0.011,可见3个因 素的主次顺序为:X>x:>x3,即超声功率>超声时间> 磷酸盐缓冲液pH.依据回归方程和实际经验,选择超 声波法的优化工艺条件为:超声功率100W,超声时 间8min,磷酸盐缓冲液pH值7.8. 2.1_3验证实验 按上述优化的工艺条件超声波提取耻垢分枝杆菌 乳酸氧化酶,实验重复3次,得到乳酸氧化酶平均酶活 力为63.8U/mL,与表1中的1号实验结果很接近,说 明实验重现性良好. 2I2均匀设计法优化冻融提取工艺 2.2.1方案与结果 用不同pH(6.8,7.0,7.2,7.4,7.6,7.8,8.0)的磷酸盐 缓冲液配制实验用样品菌悬液,菌悬液经4cC冰箱预 冷30rain,放人一10cC的冷冻箱中,冷冻2h后取出,置 于不同温度(25,28,31,34,37,40,43oC)的恒温水浴锅 中解冻不同的时间(10,15,20,25,30,35,40min),反 复冻融数次(2,3,4,5,6,7,8次),各实验均重复3次, 取平均值为乳酸氧化酶酶活力. 根据以上实验因素和水平,选择均匀设计表U,(7) 来安排实验,见表3. 2.2I2回归分析 表3均匀实验结果经多元线性回归统计处理?, 复相关系数R---0.7685,回归方程:Y=217.2133+1.8945X, - 0.9765X2—19.8079X3—0.1671X4,方差分析见表4, Ft=0.7214<Fn05(4,2)=19.25,回归方程不显着,该回归 方程不可信.考虑可能存在因素间的相互作用,改用二 次多项式逐步回归处理,结果见表5,二次多项式逐步 表3冻融法实验方案表 注:x-冻融次数;x2解冻时I’~q(min);x缓冲液pH;X4解冻温度(?); Y酶活力(U/mL);下同. 回归方程为:Y一82.4304+0.0378X1X2+0.3847X1X4+ 0.2653XvX,复相关系数R=0.9593,显着水平P= 0.0139,Ft=25.03>Fn晒(4,2)=19.25,回归方程显着,该 回归方程可信. 表4冻融法方差分析结果 表5冻融法二次多项式逐步回归法处理的数据结果 从表5各变量显着性检验P值的大小,可以知道 对耻垢分枝杆菌乳酸氧化酶提取效果的影响大小为 xX>x3X>xX:.从回归的结果可知,因素之间存在交 互作用,其原因是乳酸氧化酶的酶活力容易受到温度, 酸碱度,金属离子等因素的综合影响,所以如果用单因 素法是很难得到一个较优方案的,均匀设计法是一种 较好的寻优方案.依据回归方程,选择冻融法的优化工 艺条件为:冻融次数5次,冻融时间25min,磷酸盐缓 冲液pH值7.4,解冻温度34cC. 2.2_3验证实验 将冻融法优化后的工艺参数进行微调后,按表6 进行验证实验,各实验均重复3次,取平均值为乳酸氧 化酶酶活力. 表6冻融法验证实验方案 实验号冻融次数(次)解冻时间(min)pH解冻温度(?)酶活力(u/mL) l 2 3 4 5 5 257.437 257.437 257.434 54.9 56.1 55.7 由表6可知,各验证实验结果都很接近,综合考虑 食品开发食品l并究与羿发 金银花功能性酸奶的研究 刘凤珠,梁萌,王利晓 (郑州轻工业学院,河南郑州450002) 摘要:由金银花和鲜牛奶为主原料,研制出了集金银花和酸奶的保健功能于一体的新型保健饮料一金银花功能性酸 奶.采用正交实验筛选出最优组合,结果表明:金银花汁:牛奶=0.05:1,接种量为5%,加糖量为8%,发酵时间7h为 最佳的工艺条件,得到的酸奶品质最好. 关键词:金银花;酸奶;保健 PREPARAT10NOFIHEH0NEYSUCKLEHEAI’HCAREYUGHUr LIUFeng—zhu,LIANGMeng,WANGLi—xiao (ZhengzhouUniversityofLightIndustry,Zhengzhou450002,Henan,China) Abstract:Takethehoneysuckleandfreshmilkasthemainrawmaterials,afer mentedhoneysuckleyoghurt—a newtypeofhealthycaredrinkwaedeveloped.Theoptimumconditionsofproc essingtechnologywereobtained throughorthogonaltest:theratioofhoneysucklesolutiontomilk0.05:1,5%totalinoculationconcentration,8% canesugarand7hoursfermentation. Keywords:honeysuckle;yoghurt;healthcare 作看简介:刘凤珠(1963-),女(汉j,副教授,硕士,讲究方向:生物工程. 通讯作者 各方面因素,选取冻融法的最适工艺条件为冻融次数 cation-stabilizedLactateOxidaseinaSilicaSol-GelasaBiosens一 4次,解冻时间25min,磷酸盐缓冲液pH值7.4,解冻 orPlatformMicrochimAca142,1,5(2003)? 温度37oC.【]S.Suman,Rahuli”gal,AiL.sharma,et?DP.”ofalac- tatebiosensorbasedonconductingcopolymerboundlactateoxidase [J]Se-nsorsandActuatorsB107(2005):768~772. 3结论 【6]Gibe11..A,C.llinsMD,D.mingueaL.App1Envir0nMicmbi.11999,65. 3.1超声波法提取乳酸氧化酶的最佳工艺条件为:超f1o1:4346, 4350. 声功率100W,超声时间8min,磷酸盐缓冲液pH7.8. 【7]B.Lillis,C.Grogan,H.Berney,eta1.Investigationintoimmobilization 3.2冻融法提取乳酸氧化酶的最佳工艺条件为:冻融 oflactateoxidasetoimprovestability[J].SensorsandActuatorsB68 次数4次,解冻时间25min,解冻温度37?,磷酸盐缓(20?:09,4? 冲液pH7.4【]Hr0akMi”gaw,HiK.k0.Effeof.”.”i.” 3.3验结果表明,采用超声波法和冻融法提取耻垢t … abinh咖ox鹪..Bimhnd.gyrs000: 分枝杆菌中乳酸氧化酶是可行的,超声波法提取效果 【9]HikiKan.ko,HirotakaMinagawa,JiroShimada.Rti.ald..i.fth. 要优于冻融 法.m.stablelactate.xidasebyaIIalyzingquatemarystmctureaIldpre- ventionofdeamidatior{J]BiotechnologyLetters(2005)27:1777~1784. 参考文献:【1o]匡铁吉,宋萍,王利平,等.分枝杆菌简化琼脂培养基的 研究[J].微 【1]Ji”gs0”gGu,PingXu,Yinb.Qu.Abi.catalystforpymvat.prepam一生 物,1995,35(4):298,302? ti0nfromDL一1actate:1actate0xidaseinaPseud0m0nasspfJ1.Journalf11]谷劲松,曲音波.丙酮酸的酶法转化及乳酸氧化酶的研究进展[J]. 0fM01ecu1arCatalvsiaB:Enzvmatic.18(2002):299,305.微生物学通 报,2003,30(1):86,90. 【2]谷劲松,许平,李铁林,等.乳酸氧化酶转化乳酸产丙酮酸[J].应用 【12]李云雁,胡传荣?实验设计与数据处理【M].北京:化学工业出版 与环境生物,2001,7(6):617,620.社,2005:51,56? 【3]吕邦泰,于本章,杨昌国,等.乳酸氧化酶法测定血浆中乳酸[J].临 【13]唐启义,冯明光.实用统计分析及其DPS数据处理系统【M]?北 床检验杂志,2000,18(3):129,130.京:科学出版社,2002:294,311. 【4]JamesA.C0x.PatrickM.Hens1ey,Chery1L.Loch.Evaluati0n0fPoly一 13 @~:2006—07—