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[考试]大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化.doc

[考试]大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化

天涯湘草小童鞋
2017-10-20 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《[考试]大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化doc》,可适用于初中教育领域

考试大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化一、目的了解感受态细胞生理特性及制备条件掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。掌握质粒DNA转化大肠杆菌的方法了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA的原理。二、原理(一)大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后细胞生理状态会发生改变出现各种蛋白质和酶负责供体DNA的结合和加工等。细胞表面正电荷增加通透性增加形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA(重组质粒)引入大肠杆菌就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。在细菌中能发生感受态细胞是占极少数。而且细菌的感受态是在短暂时间内发生。目前对感受态细胞能接受外来DNA分子的本质看法不一。主要有两种假说:、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁使DNA分子能通过质膜进细胞。证据有:()发芽的芽孢杆菌容易转化()大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染却能受噬菌体DNA转化()适量的溶菌酶能提高转化率。、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点使DNA分子能进入细胞。证据是:()蛋白质合成的抑制剂如氯霉素可以抑制转化作用()细胞分裂过程中一直有局部原生质化但感受态只在生长对数期的中早期出现()分离到感受态因子能使非感受态细胞转变为感受细胞。目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论但是许多实验室一直进行探索试图从实验中获得明确回答。有人根据pBR质粒DNA对EcoliK――X菌株的转化结果认为:近来在许多研究室都发现CaCl对受体菌处理可提高转化效率几十倍通常把细胞悬浮在pH的mmolLCaCl中在冰浴条件下放置过夜转化率转高但一过小时转化率测恢复为原来的水平。(二)重组DNA的转化原理我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞接下的实验是把重组的DNA引入受体细胞使受体菌具有新的遗传特性并从中选出转化子。作为受体的大肠杆菌C或DHα必须不同外来DNA分子发生遗传重组通常是rec基因缺陷型的突变体同时它们必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株。这样外来的DNA分子不会受其限制酶的降解。保持外来DNA分子在受体细胞中的稳定性。制备的大肠杆菌细胞就具有这三种缺陷(rkmkrec)同时此受体细胞还是氨苄青霉素敏感(Ap)。在体外构建好的重组分子上具有分解氨苄青霉素(Ap)基因存在当它导入受体细胞后就赋于这些受体细胞新的特性即Ap抗性。同时载体质粒上具有乳糖操纵的β一半乳糖苷酶基因(lacZ)我们可以利用外源基因插入载体β一半乳糖苷酶基因(lacZ)使其失去β一半乳糖苷酶活性的原理来选择新构建的重组子。因pUC带有Ampr基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pUCDNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。pUC上带有β半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β半乳糖苷酶N端个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。EcoliDHα菌株带有β半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pUC和DHα编码的β半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pUC和DHα融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α互补。由α互补产生的Lac细菌较易识别它在生色底物Xgal(溴氯吲哚βD半乳糖苷)存在下被IPTG(异丙基硫代βD半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段TGFβ插入到pUC质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的氨基酸片段失去α互补能力,因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α互补现象筛选。本实验是把外来重组分子和感受态细胞在低温下混合使其进入受体细胞。DNA分子转化的原理较复杂:、吸附――完整的双链DNA分子吸附在受体菌表面。、转入――双链DNA分子解链单链DNA分子进入受体菌另一链降解。、自稳――外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA。、表达――供体基因随同复制子同时复制并被转录和翻译。对DNA分子来说能被转化进受体细胞的比率极低通常只占DNA分子的改变条件提高转化率是很有可能的一些研究表明下列因素可以提高转化率:()受体菌细胞与DNA分子两者比例在×细胞:毫微克DNA分子(Kb)左右转化率较好()DNA分子与细胞混合时间为小时最佳()铺平板条件会影响转化率()对不同转化菌株热处理(效应不一致)。除上述因素外转化试验还注意如下问题:、连接DNA反应液与受体细胞混合时一定保持在冰浴条件下操作如果温度时高时低转化效率将极差。、热处理分钟后要迅速加进毫升LB以使表型表达延迟加LB将使转化率迅速降低。、在平板上涂布细菌时。注容避免反复来回涂布因为感受态细菌的细胞壁有了变化过多的机械压涂布将会使细胞破裂。影响转化率。三、材料(一)仪器与器皿恒温振荡器分光光度计电动沉淀离心机旋涡混合器恒温培养箱隔电热恒温水浴锅恒温摇床普通冰箱Eppendorf管转液管平皿涂布棒微量取样器微波炉三角烧瓶试管刻度离心管保温瓶酒精灯等(二)菌种大肠杆菌C或DHα(rkrecmk)(三)培养基与试剂LB液体培养基(蛋白胨酵母粉NaClpH。)、mmolLCaCl氨苄青霉素溶液(毫克毫升)DNA连接反应液Xgal储液(mgml):用二甲基甲酰胺溶解Xgal配制成mgml的储液,包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏,储存于。IPTG储液(mgml):在μl蒸馏水中溶解mgIPTG后,用蒸馏水定容至ml,用μm滤膜过滤除菌分装于eppendorf管并储于。含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至左右,加入Amp储存液,使终浓度为μgml,摇匀后铺板。含Xgal和IPTG的筛选培养基:在事先制备好的含μgmlAmp的LB平板表面加mlXgal储液和μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于下放置小时,使培养基表面的液体完全被吸收备用。四、实验步骤(一)大肠杆菌感受态细胞制备、将受体大肠杆菌接种于LB斜面上活化置于恒温培养箱中培养过夜。、取一环上述大肠杆菌培养物菌落接种于毫升LB试管中于恒温振荡器上振荡培养过夜(约小时)必要时在显微镜下镜检菌细胞是否形态一致有无杂菌污染。、用移液管无菌条件下取过夜培养液毫升接种于新鲜的LB中(毫升LB毫升三角瓶接种量按菌液浓度而定一般在左右)于恒温振荡器上培养―小时。、取毫升培养液以未接种的LB作空白对照在分光光度计上测OD的光密度值约为―左右。无菌条件下将上述毫升菌液倒入毫升EP离心管中(离心管应带盖并高压灭菌过)每组支。、带菌液的离心管置于冰上分钟冷却菌液平衡好置于台式低速离心机上rmin离心分钟。、无菌条件下倒去上清LB倒斜离心管让LB流干留下沉淀菌体加入预冷的mmolLCaCl溶液微升用微量取样器轻轻吸冲底部沉淀菌体使其悬浮后把支管转为支摇匀后于冰浴中放置分钟。、重新将CaCl菌悬浮液置于台式低速离心机上rmin离心分钟小心侧倒掉上清CaCl留沉淀菌体。、再把菌体悬浮在微升mmolLCaCl的溶液中置于冰上作为转化的受体菌液。此制备的感受态细胞应在此步后小时至小时内使用效率比较高。在事先制备好的含μgmlAmp的LB平板表面加mlXgal储液和μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于下放置小时,使培养基表面的液体完全被吸收备用。(二)重组DNA转化取ml大肠杆菌感受态细胞在无菌条件下加入到连接液的Eppendorf管混匀置冰浴中分钟。冰浴后将正在转化反应的细胞悬浮液加入已调好的的恒温水浴槽内保温分种。热冲击处理后的细胞易死亡应迅速倒入LB培养液毫升(无抗菌素LB液有助于基因表达)马上置水浴小时每分钟翻转次。用移液器取毫升的转化菌液直接涂布含μgmlAmp、mlXgal储液和μlIPTG储液LB固体平皿上共涂布三个培养皿。用移液器取未经转化的受体大肠杆菌感受态菌液毫升直接涂布于含μgmlAmp、mlXgal储液和μlIPTG储液LB固体平皿上作为受体菌对照。将第、步涂布培养皿先放室温分钟左右使涂布上的菌液干燥不会流动。然后倒置放于恒温箱中培养过夜。第二天取出培养皿观察对照平皿和转化平皿菌落情况。对照平皿因受体菌对Amp敏感故不能在含Amp的培养基上生长。转化平皿是否有兰色和白色菌落生成,如果长出兰色菌落说明自连的载体pUC质粒已转入受体菌但目的基因没有接入载体。如果长出白色菌落说明目的基因已接入载体重组质粒的转化子因此丧失了β半乳糖苷酶活性,在xgal和ITPG存在的生色诱导培养基上只能形成白色菌落。五、结果和讨论比较对照平皿和转化平皿讨论转化成败原因

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