毕赤氏甲醇酵母谷胱甘肽代谢工程的研究 pdf

毕赤氏甲醇酵母谷胱甘肽代谢工程的研究 pdf 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所博士后士学位论文毕赤氏甲醇酵母谷胱甘肽代谢工程的研究姓名王绍校申请学位级别博士后士专业生物技术指导教师张世明吴祥甫20050401摘要根据不同来源的一谷氨酰半胱氨酸连接酶基因的同源性比较采用—和技术从毕赤氏甲醇酵母中克隆了编码一谷氨酰半胱氨酸连接酶的序列。它的全长是编码一个含有个氨基酸的多肽该多肽的计算分子量是。它的推导氨基酸序列与已知的来源于酵母、小鼠和人的一谷氨酰半胱氨酸连接酶的氨基酸序列有较高的相似性。在毕赤氏甲醇酵母中敲除该基因使成为谷胱甘肽自养型菌株。在毕赤氏甲醇酵母中加强该基因的表达可以使细胞内谷胱甘肽含量的增加。重组菌株在甲醇诱导过程中胞内谷胱甘肽含量为为目前报道的胱甘肽含量最高的酵母菌株之一。根据不同来源的甲硫氨酸合成酶基因保守序列从毕赤氏甲醇酵母中克隆了该基因的一段保守序列应用技术进一步克隆了两端序列得到的该基因的全序列其推导的多肽含有个氨基酸残基分子量为。与酿酒酵母的甲硫氨酸合成酶基因有的同一性。甲硫氨酸合成酶由两个结构域组成活性位点在端的结构域中。端结构域参与酶和底物、也一。?的结合。功能互补试验表明在酿酒酵母甲硫氨酸合成酶缺陷型菌株中引入该基因可以使该菌株在基本培养基中恢复生长。关键词一谷氨酰半胱氨酸连接酶甲硫氨酸合成酶基因敲除毕赤氏甲醇酵母 —— 。 — 上 】 尸 打丽 — 第一部分前言研究背景代谢工程十九、二十世纪是物理学、化学大发展时期随之带来的科技进步推动了工业的大发展使得人们的衣食住行基本得到解决。随着生产的高速发展人类对环境的破坏也越来越严重造成了巨大的损失产生了极其严重的后果。如环境污染、人口爆炸、资源枯竭等。人们才逐渐认识到人类盲目的、无远见的生产和社会活动最终将危害人类自身。因此保护人类赖以生存的环境已经成为当今全人类都极其关心的热点。于是在可持续发展战略指导下的环境友好化学、零排放工业等相继提出。由于生物合成法较之化学合成法有环境友好性、化学选择性和分子多样性等优势。在过去的二十年中人们做了许多努力用生物合成 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 替代化学合成工艺。许多工业产品都能够通过生物合成工艺获取。由于微生物菌种遗传特性的限制通过优化发酵条件难以大幅度提高产物的产率因此造成生产成本较高。随着对微生物生理研究的深入及重组技术的日臻完善人们不仅可以通过基因克隆技术改变微生物代谢途径的某些关键步骤从而可以大幅度地提高产物的产率而且还可以通过基因重组技术改变微生物的代谢途径以生产传 统发酵工业无法获得的新产品。这一新兴的研究领域人们称之为代谢工程细胞中有上千种酶同时催化着各种各样的反应构成一复杂的反应网络。而另人惊奇的是这众多反应竟能如此协调的组织在一起使细胞维持正常的生命活动而且这种调控完全是通过一种内部 机制 综治信访维稳工作机制反恐怖工作机制企业员工晋升机制公司员工晋升机制员工晋升机制图 自发完成的。这种神秘的和谐诱使人们思考细胞这种代谢网络是怎样形成的具有怎样的一种结构如何进行调节由于生物化学和细胞生理学的发展人们逐渐搞清了细胞内各种物质的分解及合成路径如糖酵解、三羧酸循环等对控制各反应的酶及其调控行为也有了较详细的了解并通过胞外的测量 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 积累了大量酶动力学数据。在此基础上就有可能对整个代谢网络进行定量的分析对细胞内不同状态下各代谢路径的通量分布作出描述从而采取一些改进措施调节其分布以得到更多的目的产物。通过改变代谢途径以改善微生物培养特性和提高微生物某种代谢产物产量的方法很早就存在了。这种方法主要是通过化学突变和创造性的筛选方法产生和分离鉴定高产菌株。将这项技术应用于氨基酸、抗生素、和维生素的生产菌株的改造已经取得了成功。尽管这项技术已经被人们广泛的接受并且取得了很多成功但是突变过程却是随机的想达到某一特定的结果是非常困难的。七十年代发展起来的基因工程技术为人们对细胞代谢结构进行调整提供了一种有利的工具。初期的基因工程技术只是将一个或少数几个基因引入细胞内使其具有合成某种新物质或利用新的底物的能力尤其是用于生产基因表达的直接产物如疫苗、激素、细胞因子等。代谢工程的实质在于对代谢流量及控制进行定量分析并在此基础上进行代谢改造最大限度地提高目的代谢产物的产率。与传统的诱变育种技术不同它是一种有目的、有理性的改造涉及生理学、分子生物学、生物化学及生物途径工程学等多门学科。代谢工程研究的目的在于构建具有新的代谢途径能生产特定目的代谢产物或具有过量生产能力的工程菌应用于工业生产。根据微生物不同代谢特性常采用改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种。改变代谢途径一般有以下几种方式。一、加速限速反应。将编码限速酶的基因通过基因扩增增加拷贝数在宿主中表达以实现目的产物产率的上升“。首先必须确定代谢途径中的限速反应及其关键酶。然后将编码限速酶的基因通过酶切等手段制得特定片段连接在高拷贝数的载体上再导入宿主中去表达。二、改变分支代谢途径流向雎。提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力使其在与另外的分支代谢途径的竞争中占据优势可以提高目的代谢产物产量。三、构建代谢旁路。。高密度培养技术在发酵生产中是比较热门的课题。为实现大肠杆菌的高密度培养必须阻断或降低对细胞生长有抑制作用的有毒物的产生。大肠杆菌糖代谢末端产物乙酸达到一定浓度后明显造成细胞生长受抑制人们应用代谢工程的方法将枯草杆菌的乙酰乳酸合成酶基因克隆到大肠杆菌中构建新的代谢支路结果明显改变细胞糖代谢流使乙酸处于较低水平以实现高密度培养目的。四、改变能量代谢途径…。除了通过相关代谢途径的基因操作改变代谢流这种直接方法外改变能量代谢途径或电子传递系统也可以有效改变代谢流。扩展代谢途径在宿主菌中克隆、表达特定外源基因可以延长代谢途径生产新的代谢产物提高产率畸。构建新的代谢途径克隆异于自身次级代谢产物的基因可生产具新结构的代谢产物哺。从世纪年代开始兴起代谢工程至今已有年的发展历史无论是理论上还是应用上都得到了长足的进步。代谢工程作为一种有目的、有理性的代谢改造技术应用前景十分广阔它在医药、环境阳、发酵工业阳等方面已有许多成功的实例。随着分子生物学、细胞生物学、生理学等生物学科不断发展以及化学工程、数学理论及分析检测和信息控制 技术等外源学科的发展大大推动了代谢工程的发展。特别是基因识别、基因扩增、基因分离及基因功能分析技术的逐步发展使代谢工程有目的、有理性的改造更加可行和应用自如。总之代谢工程作为一门全新的技术与生物学科及多门交叉学科息息相关。随着该理论的不断完善其应用必将越来越广泛。酵母含硫氨基酸代谢硫元素可以以一到各种化合态与其他元素形成稳定的化合物。所有的这些化合物都是整个地球中硫循环的一部分。在岩石层中无机硫主要以硫酸盐和和硫化物形式存在。在海洋中无机硫主要以硫酸盐的形式存在。另外在岩石层中还有大量的其他形式的无机硫如硫代硫酸盐、连二硫酸盐、连多硫酸盐以及硫磺。岩石层和大气层之间也存在硫循环。主要是通过火山爆发、生物组织的腐烂、人为因素等由地面释放的含硫气体如硫化氢。和二氧化硫。在空气中硫化氢和二氧化硫很快氧化为硫酸盐并以酸雨的形式降落到底面以及以气态沉积到海洋“…。作为地球硫循环的一个主要组成部分在生物体中含硫化合物的代谢过程也形成了一个生物硫循环。由于在生物体中硫元素以多种氧化态韵形式存在因此生物硫循环更加复杂。在微生物中通过两种途径参与生物合成反应。一是在呼吸系统中作为最终的电子受体。二是通过硫化物和硫原子的氧化产生能量而作为能源。硫酸盐通过同化作用被还原生成有机化合物进入新陈代谢也可以作为呼吸链的一部分被还原为亚硫酸盐和硫化物不进入新陈代谢直接排除体外。绝大多数真核微生物只能同化还原硫酸盐而不能异化还原硫酸盐。对于所有的微生物来说含硫氨基酸的合成都要求该微生物具有从培养基中积累硫原子的能力、以及在体内将硫原子转化成还原态一的能力。由于体内大量的转运及其他生化活动的需要酿酒酵母可以广泛利用各种无机甚至有机硫源。 蛳嚼酬攀。研究表明由于酵母菌拥有各种各样的酶系统它几乎可以代谢岩石圈内所有的含硫化合物。其中主要是硫酸盐的还原代谢。酵母菌也能利用硫代硫酸盐硫烷磺酰化合物硫化物和亚硫酸盐也能利用连多硫酸盐和硫磺作为唯一的硫源““。妒 —— 灿一?州?岫洲一一瑚”。—一一眦鳓掣、。铀。芒 与其他的有硫酸盐还原能力的真核微生物一样在酵母中硫酸盐主要用于合成含硫有机代谢产物这其中包括了含硫的氨基酸——甲硫氨酸半胱氨酸高半胱氨酸和它们的衍生物腺苷甲硫氨酸一卜腺苷高半胱氨酸—谷胱甘肽等有经济价值的化合物。蛋氨酸代谢转甲基作用与蛋氨酸循环蛋氨酸中含有甲基可参与多种转甲基的反应生成多种含甲基的生理活性物质。在腺苷转移酶催化下与反应生成一腺苷蛋氨酸。中的甲基是高度活化的称活性甲基称为活性蛋氨酸。垤淌协蝴一一…一刚出日舯枫帕忡?、 订、 一。艇翟舻一姗删 可在不同甲基转移酶的催化下将甲基转移给各种甲接受体而形成许多甲基化合物如肾上腺素、胆碱、甜菜碱、肉毒碱、肌酸等都是从中获得甲基的。是体内最主要的甲基供体。耋忡卿删懈目锵詈募营阿越雌麟氯簟艨馨鼍氲薹一?瞽辩戤尊赫熬瞳嘲锻半腿蕾蕞转出甲基后形成一腺苷同型半胱氨酸 水解释出腺苷变为同型半胱氨酸 。同型半胱氨酸可以接受甲基再生成蛋氨酸形成一个循环过程称为蛋氨酸循环。此循环的生理意义在于蛋氨酸分子中甲基可间接由其它非必需氨基酸提供以防蛋氨酸的大量消耗。?孽一是一篙沿臻瞳岔一萝斡一同型半胱氨酸甲基转移酶的辅酶是甲基。维生素缺乏会引起蛋氨酸循环受阻。临床上可以见到维生素缺乏引起的巨幼细胞性贫血。由于维生素缺乏引起甲基缺乏使甲基转移酶活性低下甲基转移反应受阻导致时酸以。一。地形式在体内堆积。这样其它形式的叶酸大量消耗以这些叶酸作辅酶的酶活力降低影响了嘌呤碱和胸腺嘧啶的合成因而影响核酸的合成引起巨幼细胞性贫血。也就是说维生素对核酸合成的影响是间接地通过影响叶酸代谢而实现的。虽蛋氨酸循环可生成蛋氨酸但体内不能合成同型半胱氨酸只能由蛋氨酸转变而来所以体内实际上不能合成蛋氨酸必须由食物供给。同型半胱氨酸还可在胱硫醚合成酶 催化下与丝氨酸缩合生成胱硫醚 再经胱硫醚酶催化水解生成半胱氨酸一酮丁酸和氨。一酮丁酸转变为琥珀酸单酰通过三羧酸循环可以生成葡萄糖、所以蛋氨酸为生糖氨基酸。肌酸的合成肌酸和磷酸肌酸 在能量储存及利用中起重要作用。二者互变使体内供应具有后备潜力。肌酸在肝和肾中合成广泛分布于骨骼肌、心肌、大脑等组织中。肌酸以甘氨酸为骨架精氨酸提供脒基、供给甲基、在脒基转移酶和甲基转移酶的催化下合成。在肌酸激酶 催化下将中柳转移到肌酸分子中形成磷酸肌酸储备起来。由两种亚基组成即亚基肌型与亚基脑型。有三种同工酶即删型在骨骼肌中型在脑中和型在心肌中。心肌梗塞时血中型活性增高可作辅助诊断的指标之一。《辩曩腻旋捌甘氨酸肿岛氮棘胍五魏科。一一一乞品黻唆一鞠静最栽囊觏嚣 肌酸和磷酸肌酸代谢的终产物是肌酸酐简称肌酐。正常成人每日尿中肌酐量恒定。肾功能障碍时检查血或尿中肌酐含量以帮助诊断。半胱氨酸和胱氨酸的代谢半胱氨酸和胱氨酸的互变半胱氨酸含巯基一胱氨酸含有二硫键—一二者可通过氧化还原而互变。胱氨酸不参与蛋白质的合成蛋白质中的胱氨酸由半胱氨酸残基氧化脱氢而来。在蛋白质分子中两个硼眦熙乜严登蛾泌帆霹半胱氨酸残基间所形成的二硫键对维持蛋白质分子构象起重要作用。而蛋白分子中半胱氨酸的巯基是许多蛋白质或酶的活性基团。掣广铲心音秘?—。毕胱氮歉旒摄教半胱氨酸分解代谢人体中半胱氨酸主要通过两条途径降解为丙酮酸。一是加双氧酶 催化的直接氧化途径或称半胱亚磺酸途径另一是通过转氨的一巯基丙酮酸途径。活性硫酸根代谢含硫氨基酸经分解代谢可生成。。氧化成为硫酸。半胱氨酸巯基亦可先氧化生成亚磺基然后再生成硫酸。其中一部分以无机盐形式从尿中排出一部分经活化生成’磷酸腺菅一磷酸硫酸’一一 即活性硫酸根。的性质活泼在肝脏的生物转化中有重要作用。例如类固醇激素可与结合成硫酸酯而被灭活一些外源性酚类亦可形成硫酸酯而增加其溶解性以利于从尿于排出。此外也可参与硫酸角质素及硫酸软骨素等分子中硫酸化氨基多糖的合成。弘一删一一删一一眦嘲一删啡帚甘氨酸—半批氮藏备氯骥符胎嚣肤怕一蹬匐谷胱甘肽的合成谷胱甘肽 是一种含一酰胺键的三肽由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。谷胱甘肽的合成通过一谷氨酰基循环—由提出又称为循环。一谷氨酰基循环有双重作用一是谷胱甘肽的再合成二是通过谷胱甘肽的合成与分解将外源.