复方银耳鱼肝油微生物限度检查方法研究

复方银耳鱼肝油微生物限度检查方法研究 复方银耳鱼肝油微生物限度检查方法研究 1848CHINATROPICALMEDICINEVo1.8No.10October2008中国热带医学2008年第8卷第1O期 [检验医学] 复方银耳鱼肝油微生物限度检查方法研究 ObservationonthedeletionlimitofmicroorganismsincompoundYinercodliveroil.WANG Xiao — wei.(HainanQingshaciPharmaceuticalCo.Ltd.Haikou570311,Hainan,P.R.China) 王,j,卫 摘要:目的验证复方银耳鱼肝油微生物限度检查方法的专属性和有效性.方法采用乎皿法和薄膜过滤法 对复方银耳鱼肝油进行验证试验,并测算茵回收率.结果复方银耳鱼肝油采用平皿法和薄膜过滤法检查,大肠埃 希菌,金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌,白色念珠菌,黑曲霉菌回收率均;k-t-70%;乙型副伤寒沙门茵以平皿法或薄膜 过滤法可检出.结论复方银耳鱼肝油可以用平皿法或薄膜过滤法进行微生物限度检查.综合考虑,在生产检验 中选择采用平皿法. 关键词:复方银耳鱼肝油;微生物;限度检查;验证 中图分类号:R一33文献标识码:B文章编号:1009—9727(2oo8)10—1848—02 复方银耳鱼肝油是由鱼肝油和银耳糖浆等制得的一种糖 浆剂,为淡黄色透明或半透明粘稠液体J.复方银耳鱼肝油为 维生素类非处方药品,所含维生素A和D是人体生长发育的 必需物质,对于上皮组织的完整性,视力,血钙和磷的恒定,骨 骼,牙齿的生长发育等有重要作用,主要用于预防和治疗人体 维生索A和D缺乏症.为保证药品的质量,按照中国药典 2005版的要求,对其微生物限度检查方法进行研究. 影响微生物限度检查的因素比较复杂J.试验时要保持 一 个相对洁净的环境.本次验证在本公司微生物限度检查室 进行.该功能间为本公司GMP体系的一部分,环境洁净度达 到万级,操作区域为百级的单向流空气区域(百级工作台). 检验环境符合规定. 1实验材料 1.1培养基营养琼脂培养基(批号200606156),玫瑰红钠 琼脂培养基(批号200603084),胆盐乳糖培养基(批号 20060221),改良马丁琼脂培养基(批号20060120),MUG培养 基(批号20060502),四硫磺酸钠亮绿培养基(批号 200605116),胆盐硫乳琼脂培养基(批号200603102),麦康凯 琼脂培养基(批号200603022).均购自广东环凯微生物科技 有限公司. 1.2菌种大肠埃希菌[CMCC(B)44102],枯草芽孢杆菌 [CMCC(B)63501],金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003],乙型 副伤寒沙门菌[CMCC(B)50094],白色念珠菌[CMCC(F) 98001],黑曲霉菌[CMCC(F)98003],均购自中国生物制品检 定所. 1.3稀释液pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液. 1.4样品复方银耳鱼肝油(海南青鲨赐药业有限公司,批号 080405,080406,080407). 2方法 2.1供试液制备从2个包装中取样品10ml,加入pH7.0无 菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100ml,直接混匀,制成1:10供试 液. (1)分别取大肠埃希菌,枯草芽孢杆菌,金黄 2.2菌液制备 色葡萄球菌35,37?;乙型副伤寒沙门菌35,37~C培养18, 24h的营养肉汤培养物lml,加9ml0.9%灭菌氯化钠溶液分别 l0倍稀释成1O,一1O菌液,选择50—100cfu/ml的菌液浓度 备用.(2)取经23—28培养1周的黑曲霉菌改良马丁琼脂 斜面培养物,加3ml0.9%灭菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子,取出 菌液用比浊管比浊后,用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释成10,, 10菌液,选择50,100cfu/ml菌液浓度备用.取经23,28? 培养24h的白色念珠菌改良马丁培养物lml,用0.9%灭菌氯 化钠溶液稀释成10..,10菌液,选择50,100cfu/ml菌液浓 度备用. 2.3回收率测定 2.3.1平皿法(1)试验组:取1:l0供试液lml加大肠埃希 菌,枯草芽孢杆菌,金黄色葡萄球菌,白色念珠菌,黑曲霉菌菌 液lml注入平皿后,立即倾注琼脂培养基,平行制备两个平皿. (2)菌液组:取上述试验菌各lml注入平皿后,同法制备两个 平皿.(3)供试品对照组:取1:10供试液lmL注入平皿后,同 法制备两个平皿.(4)同时做稀释液和培养基阴性对照. 2.3.2薄膜过滤法(滤膜孔径0.45)(1)试验组:取1: l0供试液lml加稀释液至2Oral混匀,过滤,以lOOml稀释液分 2次冲洗,再将加有lml大肠埃希菌的稀释液100ml过滤后,将 薄膜正贴于备妥的营养琼脂平板上,平行制备两个平皿.枯草 芽孢杆菌,金黄色葡萄球菌,白色念珠菌,黑曲霉菌菌液照上述 方法分别制备两个平皿.(2)菌液组:取上述已制备好的大肠 埃希菌菌液lml加入lOOml稀释液中,混匀后过滤,同法制备 两个平皿.枯草芽孢杆菌,金黄色葡萄球菌,白色念珠菌,黑曲 霉菌菌液照上述方法分别制备两个平皿.(3)供试品对照组: 取1:10供试液lml加稀释液至20IYll混匀,过滤,以lOOml稀 释液分2次冲洗后,同法制备两个平皿.(4)同时做稀释液, 冲洗液和培养基阴性对照. 2.4细菌总数,霉菌及酵母菌总数检查采用常规法即平皿 法或采用薄膜过滤法. 米作者单位:海南青鲨赐药业有限公司,海南海口570311 中国热带医学2008年第8卷第1O期 CHINATROPICALMEDICINEVo1.8No.1OOctober20081849 2.5控制菌检查 2.5.1平皿法(1)大肠埃希菌检查:取1:10供试液各 10ml,加入到3个100ml胆盐乳糖培养基中.一瓶加入lml大 肠埃希菌液作为阳性对照,一瓶加入lml金黄色葡萄球菌液作 为阴性对照,一瓶作为供试品,均培养18,24h.取上述培养 物做MUG和靛基质试验.(2)乙型副伤寒沙门菌:取供试品 各10g,加入到3瓶200ml营养肉汤培养基中.一瓶加入lml 乙型副伤寒沙门菌作为阳性对照,一瓶加入lml金黄色葡萄球 菌液作为阴性对照,一瓶作为供试品,用匀浆仪混匀,均培养 18—24h.取上述培养物lml接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培 养基中,培养18,24h做划线试验.(3)同时做稀释液,冲洗液 和培养基阴性对照. 2.5.2薄膜过滤法(滤膜径0.45p.m)(1)大肠埃希菌检查: 取1:10供试液10ml3份.一份加稀释液至40ml混匀,过滤, 以100ml稀释液分2次冲洗后,再将加有lml大肠埃希菌菌液 的稀释液100ml过滤,做为阳性对照.一份加稀释液至40ml 混匀,过滤,以100ml稀释液冲洗,再将加有lml金黄色葡萄球 菌液的稀释液100ml过滤,做为阴性对照.一份加稀释液至 40ml混匀,过滤,以10Oral稀释液冲洗,作为供试品.分别将 滤膜投入100ml胆盐乳糖培养基中,培养18—24h,取上述培养 物做MUG和靛基质试验.(2)乙型副伤寒沙门菌检查:取供 试品10g三份,一份加稀释液至40ml混匀,过滤,以100mL稀 释液分2次冲洗后,再将加有lml乙型副伤寒沙门菌菌液的稀 释液100ml过滤,做为阳性对照.一份加稀释液至4|DIIll混匀, 过滤,以100ml稀释液冲洗,再将加有lml金黄色葡萄球菌液 的稀释液100ml过滤,做为阴性对照.一份加稀释液至40ml 混匀,过滤,以100ml稀释液冲洗,作为供试品.分别将滤膜投 入200ml营养肉汤培养基中.培养18,24h.取上述培养物 lml接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中,培养18—24h做划 线试验.(3)同时做稀释液,冲洗液和培养基阴性对照. 3结果 经微生物限度检查方法学验证表明,复方银耳鱼肝油以平 皿法或薄膜过滤法检查,大肠埃希菌,金黄色葡萄球菌,枯草芽 孢杆菌回收率均大于70%.以平皿法或薄膜过滤法检查,黑 曲霉菌,自色念珠菌的回收率均大于70%,符合方法学验证规 定.控制菌以平皿法或薄膜过滤法均可检出,方法具有专属 性. 4t 4.1复方银耳鱼肝油可以采用平皿法或薄膜过滤法进行微生 物限度的检查. 4.2平皿法是一种操作相对简便的微生物限度检查方法j. 4.3在生产检验中考虑到经济性及方便操作,选择采用平皿 法. 参考文献: [1]国家药品 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 .WS一10001一(HD一1099)一2002.复方银耳鱼肝 油[s]. [2]中国药典2005年版[s].二部.2005,附录93-99. [3]向东.影响微生物限度检查及方法验证的因素分析[J].现代医药 卫生,201)7,23(15):2329,2330. [4]朱会琴,李奋勇,李凯,等.几种微生物限度检查方法的比较[J].西 北药学杂志,2007,22(6):323—324. 收稿日期:2008—05—15;修回日期:2008—07—17 (上接第1845页) 现肉眼可见的凝集反应.TPPA法检测梅毒抗体的特异性和敏 感性均被业界认同,但其试剂为国外公司生产,试验成本高,且 操作复杂,不适合大规模的人群筛查. TP—ELISA是近年来随着梅毒螺旋体基因工程抗原研究 成功建立的方法,不仅可以检测lsC抗体,还可以检测IgM抗 体.由于梅毒螺旋体感染后机体首先产生IgM抗体,随后产生 IgG抗体,因此该方法对早,晚期梅毒的诊断特异性和敏感性 均较高.在试验中我们发现RPR原液阳性的病人,其TP— ELISA检测的A值较高,提示TP—ELISA方法A值较高的病 人要注意其是否为早期梅毒患者,需密切注意病情发展. 据国内有关报道,TP—ELISA方法在一般人群中有l%的 假阳性,A值为0.10,0.15的标本容易出现假阴性鉴于 以上情况,我们建议对于,I'P—EusA阳性的标本和A值为 0.10—0.15的阴性标本,再用TPPA重测一次,以尽可能提高 检验结果的准确率. 综上所述,TP—ELISA法对于早期和晚期梅毒都有较高的 敏感性和特异性,而且方法简便,通过酶标仪直接读取数据,减 少人为因素和环境的影响,克服肉眼难以判断结果的缺点,如 与TPPA结合使用,尤其适用于大规模的流行病学调查和血站 献血人群的筛查. 参考文献: [1]中华人民共和国卫生部医政司.现代检验医学与临床检验操作规 程[M].南京:东南大学出版社,2001,264. [2]崔秀玲,李钟.宝鸡市483吸毒人员HBV,HCV,HIV,梅毒的感染 状况调查[J].预防医学论坛,2005,11(2):169,170. [3]曾劲峰,蓝欲晓,聂冬梅,等.不同方法检测深圳献血人群梅毒感染 结果分析[J].中国热带医学,2005,5(2):331332. [4]周萍.不同检测方法对梅毒检测结果比较[J].淮海医药,2005,23 (1):51,52. [5]李韶深,刘春莉,刘琳,等.梅毒ELISA和TPPA两种试验方法的血 清质量控制的体会[J].中国皮肤性病学杂志,2005,19(3):183. 收稿日期:2008—06—12