早孕小鼠胚胎着床前后子宫内膜microRNAs差异表达及miR106b表达规律的研究（可编辑）

早孕小鼠胚胎着床前后子宫内膜microRNAs差异表达及miR106b表达规律的研究（可编辑） 早孕小鼠胚胎着床前后子宫内膜microRNAs差异表达及 miR106b表达规律的研究 . 分类号: : 密级: 重庆医科大学 硕士学位论文 早孕小鼠胚胎着床前后子宫内膜差异表达 论文题目 及.表达规律研究 作者姓名 鲁之中 指导教师姓名职称、单位名称 刘学庆 副教授 重庆医科大学公共卫生学院 重庆市渝中区医学院路号 士 学科、专业名称 遗传学 申请学位级别 硕 论文答辩年月 年月 年月重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果.据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 ,与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意. 申请学位论文与资料若有不宴之处,本人承担一切相关责任. 学位论文作者签名: 日期: 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的 规定 关于下班后关闭电源的规定党章中关于入党时间的规定公务员考核规定下载规定办法文件下载宁波关于闷顶的规定 ,即:研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学.本人保证毕业离校后,发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学.学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅.学校可以公布学 位论文的全部或部分内容保密内容除外,可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文. 纱 论文作者签名: 涿汐‘ 指导教师签名: 参学历 日 瓤..型&盏翊堡旦目 录 符号说明?. 中文摘要. 英文摘要??。 论文芷文:早孕小鼠胚胎着床前后子宫内膜差异表达及 表达规律研究? 前言..。?..?.. 第一部分早孕小鼠胚胎着床前后子宫内膜差异表达材料 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ... 结果. 讨论? 第二部分早孕小鼠胚胎着床前后子宫内膜表达规律. 材料? 方法? 结果? 讨论??。.. 全文小结与展望参考文献 附且目??. 文献综述:正常和疾病状态下子宫内膜的特征和调控功能??。. 蛋蜜谢??。?.。攻读硕士学位期间发表的学术论文??’。’。。’?。。?。?。 ??。。。。??。??。’。’??。?’’’??’ ?’。。。。’。’。。’。。。’。。。。。。。’’’。。’’’。。。。。。’’。’。’。。。’。。’。’。。’。。’’’。。?。’? ’’’”?。。??。。??。??’。??’’???????。???????一?? 『 重庆医科大学硕士研究生学位论文 符号说明 中文全称 英文缩写 英文全称 央又芏杯 ? 微小 核糖核酸信使核糖核酸 互补脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷三磷酸腺苷 埘 核糖核酸酶 焦炭酸二乙酯实时荧光定量聚合酶链式 反应 微米 ? 微升 岬小时 .詈 .蓦 分钟秒 ? 哦 磷酸盐缓冲液 . 耐热聚合酶 ? .蛔 微量离心管 ’. ’端非编码区 . 诱导的沉默复合物 三羟甲基氨基甲烷?一 ?一、 ..? 『 重庆医科大学硕士研究生学位论文 早孕小鼠胚胎着床前后子宫内膜差异 ’ 表达及一表达规律研究 摘要 目的: 应用芯片筛选早孕小鼠胚胎着床前后子宫内 膜差异表达,进行实时荧光定量验证,运用靶基因预测 数据库预测差异表达调控的靶基因,为研究其在早孕小鼠胚 胎着床过程中的作用打下基础;通过数据库的筛选,对靶基因指向与 胚胎着床子宫内膜增殖相关的在早孕小鼠胚胎着床前后子宫 内膜表达规律进行研究,为研究在胚胎着床过程中对子宫内 膜的作用机制打下基础。 方法: .样本的准备:分别收集孕天和孕天的小鼠子宫内膜组织。 .芯片分析:提取小鼠子宫内膜组织的总,总 用,使用按照 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 标记。标记的用 ,扫描仪和 .软件 进行杂交。通过 , ,进行图像扫描和数据分析。 .荧光定量检测部分差异表达:根据成熟 奉课题是重庆市科委白科基套,’重庆市教委白科基金资助项目 重庆医科大学硕士研究生学位论文 序列 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 特异性的反转录引物进行反转录,设计 上下游引 物进行实时荧光定量,采用作为内参,进行归一化。 .生物信息学分析:应用目前常用靶基因预测网站 、、来检索差异表达的预测靶基因。 .原位杂交原位杂交检测在胚胎着床前后子宫内膜的 表达量和表达部位。 结果: .芯片结果显示:孕天比孕天上调倍及以上的 有个;下调倍及以上有个。实时荧光定量 结果显示芯片数据可靠。通过、、等数 据库筛查,初步获得差异表达的部分多指向与增殖、凋亡和 抗凋亡相关的靶基因。 .芯片、实时荧光定量和原位杂交显示: 在孕天的表达高于孕天倍以上,且主要表达在小鼠子宫内膜基 质细胞,在腔上皮细胞和腺上皮细胞没有表达。提示可能通 过调控其靶基因而调控早期妊娠子宫内膜基质细胞的生长、增殖、分 化和凋亡。 结论: .本研究结果显示孕天与孕天相比,存在差异表达的 ,提示可能在胚胎着床前后子宫内膜中起重要的调控 作用。 .利用实时荧光定量进一步验证了部分差异表达的 气 ? ? ‘ ? 重庆医科大学硕士研究生学位论文 ’ ,对这些在孕天和孕天子宫内膜组织的表达量进 行定量检测,验证了芯片结果的可靠性。 .利用生物信息学方法,预测差异表达的的靶基因,推 测这些可能通过调节增殖、凋亡和抗凋亡相关的靶基因来调 控胚胎着床。 .实时荧光定量检测在胚胎着床前后子宫内膜存 在差异表达,提示其可能通过调控相关靶基因进而调控胚胎着床。原 位杂交检测主要表达在小鼠子宫内膜基质细胞,根据数据库 和相关文献分析,提示可能通过调控、和陋? 等靶基因的表达,进而调控早期妊娠子宫内膜基质细胞的生长、增殖、 分化和凋亡,最终调控胚胎着床过程。 关键词:,胚胎着床,子宫内膜,,表达规律 重庆医科大学硕士研究生学位论文 小 . ? 咿 : , , , ; ,,, . : . :. 重庆医科大学硕士研究生学位论文 .: , . ,,. ., . .: , . . :, . . : . : ., ?. ? , . , ,重庆医科大学硕士研究生学位论文 , , ?. . , , ., , . : . , ,. .,. ., . . 重庆医科大学硕士研究生学位论文.,。, ,,. :?, ,, , 重庆医科大学硕士研究生学位论文 早孕小鼠胚胎着床前后子宫内膜差异 表达及. 表达规律研究 前言 是由生物体基因组编码的一组内源性非编码小 。成熟的长度在.左右,来自细胞核内基因 组的初始转录产物.。在家族的作用下,裂解生 成长约.带有茎环结构的前体,然后在/. 作用下从细胞核转运到细胞质,并在胞质中被另一个酶作用剪切出 :‘双连结构,最后这个双链结构被解旋酶打开,其中一条链 和诱导的沉默复合物. ,结合发挥生物学 功能。近年来的研究表明,主要是降解靶和抑制靶的翻译, 在转录后水平发挥调控作用。降解靶的方式与的作用方式相似,直接 作用于靶,导致表达水平下降。翻译抑制主要是通过与靶的’ 端非翻译区’.不完全匹配结合,抑制靶翻译过程,使靶基因的蛋 白质表达水平下降。现已证实在人类大约有三分之一的编码基因受的调控。 近年的研究发现表达与动植物的发育、细胞生长分化和凋亡、脂肪代 谢等生命活动过程密切相关。如果表达失调可以导致人类疾病,如肿瘤。 许多肿瘤细胞的表达谱发生改变,它们可以发挥原癌基因和肿瘤抑制基因 的作用。目前,检测表达的芯片技术和技术都已比较成熟,为深入研 究的生物学功能奠定了基础。 在生物体发育过程中具有表达时空特异性和种属之间保守性两个特 点,并在动植物的发育过程中发挥重要的调控作用。目前研究很清楚的和. 在线虫幼虫的发育中具有重要作用,.在幼虫的后期表达,与 的’ .互补结合下调其蛋白的表达水平,使线虫幼虫由期向期转化。.在线 虫的早期表达较少,在早期和成虫期表达较高,调控线虫幼虫向成熟转化。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 此外,有研究发现突变的小鼠胚胎不能发育成熟而死亡,这提示在小 鼠胚胎发育过程中可能具有周要的调控作用。 的研究是目前生物和医学领域非常热门的课题,特别是在肿瘤研究方 面,而在生殖方面的研究却较少。有研究表明在人类组织中,女性生殖轴子宫 颈、子宫和卵巢是一些特定的最高表达部位,如.;最近, .对环氧化酶 等研究发现,在胚胎植入过程中 具有调控作用【】。也有研究表明在小鼠植入过程中,着床点和着床旁存在 差异表达,并且.对具有调控作用。 胚胎着床是人类和哺乳动物生殖过程中的重要步骤,是决定妊娠成功与否的 关键。如能控制此环节,就有可能找到新的生殖调控手段。着床是一个极其复杂 的过程,其机制尚不清楚。长期以来胚胎着床是遗传学与发育生物学、生殖医学 的研究热点和前沿,研究其机制将有助于解决这些领域中所面临的诸多重要问题, 如不孕症的诊断和治疗、提高辅助生育的成功率以及寻求新的生殖调控手段等。 着床的机制涉及胚胎与母体子宫之间及其复杂而精细的多因素协同作用。以 往的研究表明,在胚胎着床过程中,母体子宫表达各类特异性调控因子,以协调 子宫内膜与胚胎之间的同步化发育而促进胚胎着床,这些因子主要包括:细胞因 子、细胞间粘附分子、糖复合物、激素及核转录因子等,并已成为胚胎着床的标 志性分子。胚胎着床是一个复杂的生命活动过程,子宫内膜的正常改变对于胚胎正 常着床具有重要意义。而子宫内膜的一系列改变依赖于蛋白质的差异表达。如曾 兰等【研究发现妊娠小鼠子宫内膜组织哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的表达 较未妊娠的子宫内膜组织显著增加,着床窗期表达最高。董艳玲等【研究表明早孕 小鼠子宫内膜钙网蛋白的表达明显高于未孕小鼠。根据可以对基因进行转 录后调控的功能,我们推澳对胚胎着床前后子宫内膜蛋白差异表达有调控 作用。本研究应用芯片筛查了胚胎着床前后子宫内膜组织差异表达的 ,并验证部分差异表达的,预测其靶基因,为进一步研究其在胚 胎着床过程的分子机制中的作用打下基础。也为了解人类生殖过程提供了理论依 据。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 第一部分早孕小鼠胚胎着床前后子宫内膜 差异表达 材料 .实验动物模型的建立及组织的获取 清洁级小鼠,~周龄,体重 ,雌雄兼用,由重庆医科大学实 验动物中心提供【合格证号:渝,按照光照小时,黑暗小时 饲养于实验室动物房,严格控制温度、湿度,自由摄食。购回后饲养周,开始 实验。选择性成熟的雌鼠,按雌:雄比例:与雄鼠合笼交配,次晨发现有阴栓者 为妊娠第一天,依次计算妊娠天数。随机将孕鼠分为组【分别记为孕天和 孕天】。每组只,脱颈处死,无菌条件下取小鼠子宫内膜备用。 .主要仪器与耗材 .超净工作台苏州净化设备厂、.?超低温冰箱美国、 公司、 电子天平上海天平仪器厂、 .超纯水系统、实时荧光定量仪美国、低温高速 离心机、电子恒温水浴锅江苏太仓实验设备厂、移液器德国、 自动台式灭菌器山东新华。 .主要试剂 .. 芯片试剂 一,、 、 .、,。 ..实时荧光定量.试剂 美国、、抑制剂大连、逆转 重庆医科大学硕士研究生学位论文 『 录引物、引物上海生、?逆转录酶美国、 大连、、’ 刑大连。 方法 . 芯片检测孕天和孕天子宫内膜表达 ..组织总的提取 将匀浆器、管.%水处理等实验器材预置于冰上。 取清洁级子宫内膜组织,加入到加有 的匀浆器中每只匀浆 器事先加入 于冰上,并放入约 组织,匀浆,冰上裂解 。 ,? /离心 裂解后样品于.?孵育分钟,以便核酸蛋白复合体完全解离。每 的试剂匀浆的样品中加入.的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体 秒后,.孵育到分钟。,,×离心分钟。离心后混合液体将 分为下层的红色酚氯仿相,中间层核上层的无色的水相。全部被分配于水相 中。水相的体积大约是匀浆时加入的试剂的%。 将水相转移到新离心管中,每处理得到的水相中加入.异丙 醇,混匀后.孵育分钟,于,,×离心分钟。 移去上清液,每试剂匀浆的样品中加入至少的%乙醇, 清洗沉淀。振荡后,,离心分钟。 去除乙醇溶液,空气中干燥沉淀.分钟。溶解时,先加入 无酶的水用枪反复吹打几次,然后.?孵育分钟。并用紫外分光光 度计测定的、值,计算/值,判定纯度及计算其浓 度。注:按组织多少确定水的量。 取部分总甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察,以确定其完 整性。 .?保存备用。 ..标记 重庆医科大学硕士研究生学位论文 除了酶之外的所有试剂置于冰上溶解分钟。振荡混匀后轻微离心: 按下表配制反应液,充分混匀: 成分 体积山 . . 水 用水补足至. ?孵育分钟; 将反应液放入终止酶反应及使变性后立即将反应管置于冰上, 放置.分钟,轻微离心: 按下表配方向反应液反应管中添加标记试剂,充分混匀: 成分 体积斗 第四步中的反应液.?孵育小时; 孵育分钟以终止标记反应,轻微离心后标记产物放置于以备后 续杂交反应使用。 .. 芯片杂交 按下表配方配制杂交溶液: 成分 体积“ . 标记产物. ? . 总体积 孵育分钟,孵育过程需避光; 重庆医科大学硕士研究生学位论文 孵育后冰上放置分钟,最多分钟; 使用公司的热收缩杂交袋杂交过夜;杂交温度为?,杂交转速 为转/分: ..洗片 于洗分钟; 杂交后,将芯片从杂交袋中取出,用 用 于室温轻轻的洗芯片; 用 于室温洗芯片分钟; 用 于室温洗芯片分钟; 用水清洗芯片: 离心分钟以甩干芯片,芯片干燥后立即扫描。 ..芯片扫描 打开扫描仪; 扫描芯片前,打开 .软件,预热扫描仪; 打开扫描仪舱门,放入芯片,芯片正面朝下; 关上扫描仪舱门; 打开扫描仪参数设置框,设置以下扫描参数: 。%% “ 扫描芯片,扫描完毕后保存图像; 使用 .提取数据并导入。 ..数据分析 用每个探针的原始信号值减去该点的前景值得到每个探针的修正值; 选取一批次实验中在每张芯片上修正值都:的非探针做标准化, 重庆医科大学硕士研究生学位论文 以这部分探针中值作为标准化因子对整张芯片的点做标准化处理。 . .法检测孕天和孕天子宫内膜的表达 ..组织总的提取 见.. .. 逆转录及引物序列 参照等的方法,成熟的的引物包括一条带茎环结构的 逆转录引物以及相应的一对引物。.、.和引物的序 列见表,同时采用小核 ,的 作为内标, 进行归一化。逆转录及引物均由上海生工生物工程有限公司合成。 表 实时荧光定量引物序列 ’’? .: 』虹 .. ?反应 ... 合成 逆转录反应体系为:重庆医科大学硕士研究生学位论文 立即冰浴, 试剂 浓度 体积 终浓度 . × / . / .. / . 抑制剂 . /. . / / 土 ?, 上 。, 破坏. ?保存 ...构建反应体系,放入定量仪进行操作 反应总体积为,在反应管内依次加入: 试剂 浓度 体积 终浓度 × . 上游引物 / ./ 下游引物上/ ./ 模板 . . 南土 ? 预变性 ?变性 ? 退火、延伸 收集荧光信号,读板 .生物信息学分析 虽然现在已经找到了上千个,这些通过作用于相应的靶 参与细胞增殖、凋亡、分化代谢、发育等多种生物学过程,发挥着重要的调 节作 用,但是至今为止,真正确认功能的还是微乎其微。寻找调控的基 因以及的靶基因,揭示具体的作用机制是非常重要的。研究人员从 已知的与靶基因的相互作用中得出这样的结论,序列’端的位 核苷酸几乎无一例外地与靶序歹完全互补。因此,这一特点被各种 靶基因预测方法广泛采用,同时结合与靶基因形成二聚体的热力学稳定 性和二级结构分析软件,如、、以及的’端与靶 基因的互补情况等作为其他限制条件来进行靶基因预测。我们利用了这一 资源,对前面实验得出的的靶基因进行检索和研究。 算法:是等开发的用来预测哺乳动物靶基因的软 重庆医科大学硕士研究生学位论文 件,是最早出现的靶基因预测软件之一。这一方法基于点考虑:考虑 :靶向基因州片段双链结构的稳定性;在拘’.搜索 与的’端第.个核苷酸被称为“种子序列完全互补的序列,并以 软件计算结合位点的热力学稳定性,最后得到评分最高的序列。此 算法不需要计算配对区的自由能,使靶基因的搜索范围进一步缩小。 ;‘’‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘ 算法川:是等人开发的预测?靶基因的软件,他们搜 索了个脊椎动物物种的基因组和现有的,它对靶基因预测具有较高的准确 性。 算、法【】:由英国中心实验室建立并维 护,它提供的靶基因预测信息是最庞大和完善的,而且更新及时,预测精确, 也 是最常用的靶基因预测网络资源之一。 综合以上各种算法,分析差异表达与胚胎着床子宫内膜相关的靶基 因。 .数据处理 相对定量采用公式:靶差异表达的比值靶心/四, 为孕天组织靶的值,为孕天组织靶的值, 为孕天组织的值,为孕天组织的值。 结果 . 芯片检测孕天和孕天子宫内膜表达结 田 爿 .. 样品鉴定 对每个样品个进行总浓度检测和甲醛变性凝胶电泳。样品总的 :/比值在..之间。甲醛变性凝胶电泳,条带清晰,土条带 亮度接近:,完好无降解,质量符合芯片的质量要求图。 .. 芯片杂交结果 重庆医科大学硕士研究生学位论文 提取的总经过标记后,进行芯片杂交、清洗、扫描,用 芯片扫描仪扫描芯片,获得芯片的图后图,用 .软件提取数据导入进行分析。 ..胚胎着床前后孕天和孕天小鼠子宫内膜芯片差异表 达结果 杂交芯片经过扫描和应用 .提取数据后导.中,经过分析得 到砌蛆表达谱和差异表达。结果显示孕天和孕天小鼠子宫内膜 相比较,下调倍及以上的有个;上调倍及以上的有个表。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 表孕天争孕天子宫内膜差异表达. .. . 。. ?王. . . .. 仉.. 仉 仉 . . . . 仉仉 .。. 舢 仉 . . . .’ . . .吆 , . .鼹 . 一 . . .帕” .. . . ..帅.蛇 . 罩 。 . . ‘ .帅. ???????????????????????????????? ????????????? ???????????????????????????????一 .差异表达的.验证结果重庆医科大学硕士研究生学位论文 采用.的方法检测了芯片中孕天和孕天相比表达下调的 ..’?????? ?.、..和?.在孕天和孕天小鼠子宫内膜中的 表达,并采用进行归一化处理。 .扩增曲线和熔解曲线图, 显示熔解曲线呈单峰,引物的特异性较好。我们又将芯片结果与.结果进行 比较表,结果显示孕天与孕天相比,..、?和 ..表达下调,芯片与.的结果一致,说明本研究芯片结 果真实可靠。 表孕天和孕、和 结果和芯片结果比较 .生物信息学分析结果 通过互联网靶基因预测软件、、,输 入差异表达,得到其与胚胎着床子宫内膜相关的靶基因。根据在胚胎着床 前后增殖、凋亡和抗凋亡相关的基因在调控子宫内膜中起重要作用,我们列 出了 主要相关的靶基因表、、。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 表部分上调蝴增殖相关 ????????????一’ ? ??????? 钿肾 ? 酽. 州哪 . 血曩。? ,. ???????????????????????????????? ????????????????????? 一?????????????????’?。????????????????????????????????????????????? ????一?????????? 重庆医科大学硕士研究生学位论文 裹部分下调靶基因抗凋亡相关 ? .... 仃.町/?州铆 ,???:『‘‘??广/ 五 . , 。, , 《 , 重庆医科大学硕士研究生学位论文 删? 讨论 ?????????? 大多数的哺乳动物具有调节其他基因表达的活性,参与生命过程中一 系列的重要进程,对组织形成、细胞生长、分化、凋亡和代谢等生物学过程 起时 空调控的作用【,】。通过生物计算和实验预测人类基因组编码大约个, 调控约%的蛋白编码基因】,这个预测提示有可能所有的细胞通路都被 调控。最近研究表明在敲除的小鼠模型出现表型出现异常,证明它 们作为基因表达调节器的重要作用体。 本研究表明在早孕小鼠胚胎着床前后子宫内膜一些有着明显的差异 表达。即孕天和孕天小鼠子宫内膜相比较,下调倍及以上的有个, 上调倍及以上的有个。说明与着床前后子宫内膜改变有着密切的关系。 等【在研究早孕小鼠天和天子宫内膜表达差异及调控作 ‘?,?,卜?????, 用中发现,有个上调.倍以上,个下调.倍以上,并且 .和.两个共同调控靶基因,可能在胚胎着床过程中 起重要作用。其中上调的中.在我们的芯片结果中也有差异表达。 两者之间表达存在很大差异的原因可能是由于选取的时间点不同和对差 异表达设定的界限不同所致。等研究胚胎着床窗期着床点和着床旁时 发现有个上调倍以上,卜下调倍以上,并且调控靶基 因,在胚胎着床过程中可能起重要的作用。而我们研究的是早孕小鼠胚胎着 床窗期前后子宫内膜差异表达,与空间差异表达有着明显的不同。以上研 ????????? 究结果说明在时间和空间上对早孕小鼠子宫内膜改变的调控,对于胚胎正 重庆医科大学硕士研究生学位论文 常着床具有重要意义。 ;:’?,,????? 在胚胎植入过程中子宫内膜细胞发生凋亡,促进胚泡正常着床【】。本研究应 用、、等靶基因预测工具,对从芯片得到的相关数 据进行检索。初步发现部分多指向与增殖、凋亡和抗凋亡相关的靶基因见 表、和。并且靶基因为抗凋亡基因的孕天与天相比表现为明显下 调,而靶基因为凋亡基因和增殖相关基因的孕天与天相比却明显上调。 这与胚胎着床前子宫内膜发生增殖和凋亡的事实完全相符。表明子宫内膜 对增殖和凋亡相关基因表达的转录后调控可能具有重要作用。 综上所述,本研究首次以芯片技术,对胚胎着床前后子宫内膜 表达谱进行了研究,发现胚胎着床前后子宫内膜一系列上调和下调的对于 胚胎着床可能具有重要作用。而对于专业靶点预测软件得到的与胚胎着床相 关的 靶基因的进行进一步功能性分析,将为今后研究如何调控其靶基 因从而调节胚胎正常着床奠定基础。重庆医科大学硕士研究生学位论文 第二部分早孕小鼠胚胎着床前后子宫内膜 .表达规律 材料 .实验动物模型的建立及组织的获取 见第一部分. .主要仪器与耗材 .超净工作台苏州净化设备厂、冰冻切片机德国、.? 超低温冰箱美国咖。公司、电子天平上海天平仪器厂、 .超纯水系统、实时荧光定量仪美国?、低温高速 离心机、显微照相系统德国、电子恒温水浴锅江苏太仓实验 设备厂、移液器德国、自动台式灭菌器山东新华、原位杂交专 用玻片武汉博士德公司。 .主要试剂 ..实时荧光定量试剂 见第一部分.. ..原位杂交法试剂 原位杂交试剂盒北京鼎国生物技术公司、核固红武汉博士德公司、 . 原位杂交探针和探针,北京中杉、 、柠檬酸三钠、氯化钠上海生、。 方法 . .法检测孕天和孕天子宫内膜一的表达 ..组织总的提取重庆医科大学硕士研究生学位论文 见第一部分.. .. .逆转录及引物序列 具体设计方法见第一部分..。引物序列见表。 表 实时荧光定量手物序列 .. .反应 具体方法见第一部分.. . .表达的原位杂交法测定 ..标本制备 无菌条件下取小鼠的子宫组织经%多聚甲醛固定 ,%蔗糖/ 过夜 脱水,包埋剂包埋组织,冰冻切片机连续切片,取厚 的切片,贴片后室 温风干,.?保存切片待用。 ..主要步骤 从.?冰箱中取出冰冻切片,室温平衡,然后?烤箱干燥 。 用%的多聚甲醛室温固定,然后用×处理洗 ×次。 准备乙酰化溶液,对标本乙酰化,以降低背景。 ×处理洗次。 滴加蛋白酶 ,?消化,及时终止。 处理洗×次。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 预杂交:每张切片滴加滴预杂交液于标本上,。孵育小时湿盒要 保湿,不洗,甩去多余液体。 取稀释好的. /探针加入杂交液,使探针浓度达到 ,。变性探针/杂交液,然后立即冰浴。 每张切片滴加变性后的探针/杂交液于标本上,加盖原位杂交专用盖 玻片,?杂交过夜。 注:不要留有气泡。 揭掉盖玻片,?×洗 ,?×洗 次, ?.洗 次。 滴加封闭液?,甩去多余液体,不洗。 滴加滴:稀释的兔抗地高辛.,? ,洗 ×次。注:小心擦拭多余液体。 ,×洗 滴加滴:稀释的一羊抗兔,? ×次,洗,洗。 /显色:每张切片加.滴显色液至标本上,?湿盒中显色 . 根据显色情况来定,自来水冲洗。 滴加.滴核固红至标本上复染,充分自来水冲洗。 梯度乙醇脱水,二甲苯透明,用中性树脂封片保存,光镜观察结果,摄 像。 阳性显色呈蓝色细颗粒状,信号越强,颜色越深,呈蓝紫色或紫黑色。对照 实验用探针代替探针进行阴性对照。 结果 .孕天和孕天子宫内膜的.结果 采用?的方法检测了芯片中孕天和孕天相比表达下调的 ..在孕天和孕天小鼠子宫内膜中的表达,并采用进行归一化 处理。 .扩增曲线和熔解曲线图,显示熔解曲线呈单峰,引 物的特异性较好。我们又将芯片结果与.结果进行比较表,结果显示 孕天与孕天相比,..表达下调,芯片与.的结果 一致。 果和芯片结果比较 .原位杂交结果 .杂交信号阳性产物主要定位于基质细胞胞质中,在腔上皮细胞和腺 上皮细胞中几乎没有表达图.至.。且孕天的.和孕天的相 比表达强度明显降低。 讨论 大多数的哺乳动物具有调节其他基因表达的活性,参与生命过程中一 系列的重要进程,对组织形成、细胞生长、分化、凋亡和代谢等生物学过程起时 空调控的作用。 胚胎成功着床的机制涉及胚胎与母体子宫间极其复杂而精细 的多因素协同作用。尽管着床的机制尚未阐明,但由于生殖方面的诸多疾病如 习惯性流产等给许多妇女带来了困扰,因此胚胎着床的基础研究受到广泛关注。 ??,, 本实验研究发现,早孕小鼠胚胎着床前后子宫内膜组织中.的表达存 在明显差异,孕天组织较孕天组织明显升高,并且其表达部位主要在 子宫内膜基质细胞。 通过生物信息学检索发现,.与胚胎着床子宫内膜相关的预测靶基因 ’’??????.?????一 的主要有坳、殛和。是一个与肿瘤发生直接相关的核仁蛋白。 其生理功能主要有: 为核糖体合成提供从胞核到胞浆转运核糖体成分所必须 ’、 的输出信号和分子伴侣; 与肿瘤抑制因子,. 相互作用从而调控细胞的增殖与凋亡,调节肿瘤抑制途径;在有丝分 裂期维持染色体的稳定性,调控修复和中心体复制。有研究表明‘在胚胎着 ’?? 床窗期着床点和着床旁相比,助坍在着床点的腔上皮下基质细胞高表达,其 表达 部位与.部位一致,说明.有可能通过调的表达,调节胚胎 着床过程。也有其他研究表明与胚胎发育相关,为乒和/ 突变的小鼠中,由于初级红细胞生成障碍产生的严重后果导致在胚胎.天和. 重庆医科大学硬士研究生学位论文 天出现小鼠组织器官的发生障碍和死亡。失活导致中心体无限制的复制和基 因组变得不稳定【们。人蛋白含有与泛素连接酶催化区/相似的端 』 区,但缺乏实现活性所需的半胱氨酸残基:具有转录因子特征的个结合 基元:一个位于区内的亮氨酸拉链,~条与噬菌体入阻遏子螺旋.转.螺旋结构 域相似区,一个锌.半胱氨酸锌指双核簇特征结构域及位于亮氨酸拉链附近 具转录 因子活化区特征的脯氨酸富集区;一个接近蛋白末端的保守序歹区 ;另夕蛋白还具有个潜在的蛋白激酶磷酸化位 点氨基酸、、、、、、,个可能的酪氨酸激酶磷酸化位点氨 基酸、、、、,个可能的.肉豆蔻化位点以及个可能的.糖基 化位点阱。等‘利用定点诱变的方法发现胚胎和成体组织的正常功能维持 需要蛋白的存在,缺陷细胞表现出细胞周期调控缺陷,细胞死亡增 加。另外,蛋白还能通过泛素化作用调控蛋白降解,在蛋白运输、细胞存 活与增殖、表皮细胞分化、甲基化、转录调控、稳定细胞周期蛋白依赖性激 酶抑制因子等方面发挥作用,但其在胚胎着床过程中子宫内膜的表达情况未 见 ‘ 报道。第号染色体同源缺失性磷酸酶一张力蛋白基因 ,是位于人类染色体的的肿瘤抑制 基因,编码一种双特异性的蛋白磷酸化酶,能够脱去丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸残基 的磷酸四。,,.三磷酯酰肌醇是作用的主要底物,脂质位于 细胞膜上,作为细胞内信号传导的第二信使,在细胞的生长调控通路中起重要作 用,它既可以刺激细胞生长,又可以阻断细胞凋亡。在静止期细胞中处于低 水平,受细胞生长因子如胰岛素样生长因子和表皮生长因子等刺激时,细胞内的 磷脂三肌醇激酶被激活的浓度迅速增加,活化其下游的效应子 /;活化的通过促使细胞分裂、增殖以及阻断细胞色素从线粒体中释放 以及使转录因子失活,从而抑制凋亡。作用于/信号传导通 路的中心环节,使向的转化发生逆转,抑带的磷酸化,阻断及其 下游激酶的活性,从而影响细胞增殖、转移、分化和死亡。有报道显示尸豫’?在着 床前后小鼠子宫内膜存在差异表达,并且主要表达在腔上皮细胞和基质细胞,参 与胚胎的植入过程。近年的研究表明,在体外同时具有脂质磷酸酶和蛋白 水解酶的活性,它在胚胎发育、着床,细胞迁移,和细胞凋亡等中发挥重要的 作重庆医科大学硕士研究生学位论文 用‘。胚胎着床和胎盘形成过程会发生一系列的细胞间相互作用,细胞增殖, 侵 入以及细胞凋亡等,导致着床点处组织重建。细胞凋亡可能在胚胎发育和多 余细 ;?????????’?’‘? 胞清除方面起关键性的作用。 综上所述,早孕小鼠胚胎着床前后子宫内膜..可能通过调控其靶 基因,进而影响蛋白水平的改变从而来调控胚胎着床。 ’?..?『 ??? .??????? 重庆医科大学硕士研究生学位论文 全文小结与展望 全文小结 本研究收集了孕天和孕天小鼠子宫内膜组织,采用芯片检测在胚胎 着床前后小鼠子宫内膜组织的差异表达,利用.对差异表达的 进行了验证,通过靶基因预测数据库搜索差异表达的的靶 基因:最后通过.和原位杂交技术检测.在胚胎着床前后子宫内膜的 表达水平和表达部位。 研究结果如下: .早孕小鼠胚胎着床前后子宫内膜组织存在差异表达的,这些差异表 达的可能通过调控如增殖、凋亡和抗凋亡等与胚胎着床相关的靶基因,进 而调控小鼠的胚胎着床过程。 ..在早孕小鼠胚胎着床前孕天子宫内膜组织表达升高,而在胚胎着 床后的孕天子宫内膜组织表达降低,并且.表达在小鼠子宫内膜组织的基 质细胞,在腺上皮和腔上皮细胞没有表达,提示可能通过调控与增殖和 抗凋亡相关的、和尸瞒靶基因来调控小鼠胚胎着床过程。通过以上 研究分析,可能与其他的多种基因和蛋白相互作用,共同调节小鼠胚胎的 着床过程,以维持整个妊娠的正常进行。 展望 随着对研究的深入,我们认为仍然还有一些问题亟待进一步探索,如 筛选出来的差异表达的是否都能够调控小鼠胚胎着床过程差异表达的 是通过调控哪些靶基因进而来调节小鼠胚胎着床过程的是否还存在其 他影响调控小鼠胚胎着床过程的基因和蛋白因而有关在人类生 殖过程的研究是一值得关注的领域,它将有助于了解人类正常生殖过程机制, 为 生殖方面疾病的诊断和治疗提供新的思路和理论依据。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 参考文献 . 【】 , , , :【】.., ’??,???『 一 . , 儿, 【】 . .,:? 【】曾兰,何俊琳,丁裕斌,等.早孕小鼠子宫内膜基因表达增高【】.细胞生 物学杂志.,: 【】董艳玲,何俊琳,刘学庆,等.早孕小鼠子宫内膜钙网蛋白的表达规律】. 细胞 生物学杂志.,:. .【】 , , ,. .,: .】 , , , ??『??『 , ..,:? . , , 】 , . .,: .: 【】 , ., ,. , .,, ., , 【】 , :. .,: ., 】. 叫 .,:?, , 【】 . .., : . . 】 , ,重庆医科大学硕士研究生学位论文 . .,: ?’?, , 【】 , . ’.. , : ., , 【】 , ? .., :? /一 , , 【】 , ..., : , , , 【】 . ..,: , , , 【】 . , , 一..,:? 【 】 , ,玎.川. .,: .? 【】? , , . .,: .【】 , , , ..,: . 【】 , , , . .,:? .. , , 【】 . . ,: . , 】 , , ,. , . ,: .,., 【.重庆医科大学硕士研究生学位论文 ? : 【 ?, ,, ... .,: ’.『?, , 】, . . .,: 重庆医科大学硕士研究生学位论文 『: 附 图 ’ , ’??’‘?????: : 图 和天小鼠子宫内膜总电泳图 . ?????:: 图 和踯天小鼠子宫内膜芯片.