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细胞因子分子量还原型SDSPAGE测定标准操作规程.doc

细胞因子分子量还原型SDSPAGE测定标准操作规程

Miranda永霞
2017-10-13 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《细胞因子分子量还原型SDSPAGE测定标准操作规程doc》,可适用于综合领域

细胞因子分子量还原型SDSPAGE测定标准操作规程深圳培训网wwwtopcom细胞因子分子量还原型SDSPAGE测定标准操作规程依据:《中华人民共和国药典》年版第三部。范围:适用于细胞因子蛋白质分子量测定。目的:测定待检品分子量是否符合《中华人民共和国药典》年版要求原理:SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是利用丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成大分子凝胶后再进行电泳。因此它兼具了分子筛效应与电泳效应。其催化系统为过硫酸铵TEMED系统。而SDS这种阴离子表面活性剂的加入它能使蛋白质氢键、疏水键打开并按一定比例与蛋白质分子结合成带负电的复合物其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷因而掩盖了不同种类的蛋白质间原有的电荷差别。这样就使电泳的迁移率只取决于分子量大小这一因素从而达到分离不同组分的蛋白质的目的并在还原剂巯基乙醇的存在下(定量的巯基乙醇可以使蛋白质分子内的二硫键彻底还原以使SDS定量的结合到蛋白质分子上去使蛋白质具有相同的构象)可以检测到是否有蛋白质聚合体的产生。内容:材料(样品:经二人复核批号无误后检测(试剂甲醇CHOH分析纯无水乙醇CHOH分析纯浓盐酸HCl分析纯甘油CHO分析纯硝酸银AgNO分析纯重铬酸钾KCrO分析纯正丁醇CHOH分析纯深圳培训网wwwtopcom甲醛HCHO分析纯丙烯酰胺CHCHCONH分析纯甲叉双丙烯酰胺(CHCHCONH)CH分析纯过硫酸铵(NH)SO分析纯TEMED(四甲基乙二胺)(CH)N(CH)N(CH)分析纯甘氨酸CHNO分析纯SDS(十二烷基硫酸钠)CHOSNa分析纯乙酸CHCOOH分析纯碳酸钠NaCO分析纯β巯基乙醇HSCHCHOH分析纯溴酚蓝CHBrOS分析纯(分子量标准品:法玛西亚公司。(注射用水:符合《中华人民共和国药典》年版要求(设备扭力天平上海第二天平仪器厂垂直板状电泳槽北京东方仪器厂恒温恒流电泳仪法玛西亚公司快速电泳槽BIORADUSA全自动扫描仪CS日本岛津TS型摇床(器皿:ml瓶、ul移液器、ml吸管、ml吸管、ml三角瓶、平皿、ml烧杯、ml烧杯以上器皿经本室洗刷组处理。方法(准备工作((工作环境:控制区确认场地清场合格摘下“清场合格”标志牌挂上“使用中”标志牌。((调试仪器设备(((恒温恒流电泳仪工作状态良好已经挂“备用”标志牌。(((全自动扫描仪工作状态良好已挂“备用”标志牌。(((扭力天平工作状态良好已挂“备用”标志牌。深圳培训网wwwtopcom((摘下扭力天平“备用”标志牌挂“运行”标志牌。((配液:以下溶液的配制完成后均需经二人复核无误后在瓶外贴标签注明溶液的名称、浓度、体积、批号及配制日期。(((聚丙烯酰胺凝胶母液ml用扭力天平准确称取丙烯酰胺g,甲叉双丙烯酰胺g加ml注射用水溶解后定容至ml过滤置于棕色瓶中二人复核贴签标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期冰箱放置。一般不超过,个月。(((分离胶缓冲液ml用扭力天平准确称取Trisg溶于ml注射用水中溶解后加浓盐酸调节pH补加注射用水至ml置于ml瓶中二人复核贴签标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期冰箱放置。(((浓缩胶缓冲液ml用扭力天平准确称取Trisg溶于ml注射用水中溶解后加浓盐酸调pH补加注射用水至ml置于ml瓶中二人复核贴签标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期冰箱放置。(((SDSml用扭力天平准确称取SDSg溶于ml注射用水中溶解后置于棕色瓶中二人复核贴签标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期常温保存。(((TEMEDml用吸管准确吸取TEMEDml溶于ml注射用水中二人复核贴签标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期冰箱放置。(((过硫酸铵ml用扭力天平准确称取过硫酸铵g溶于ml注射用水中二人复核贴签标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期冰箱放置。(((电极缓冲液ml用扭力天平准确称取Trisg、甘氨酸g、SDSg溶于ml注射用水中补加注射用水至ml置于ml三角瓶中二人复核贴签标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期常温贮存。(((固定液ml用量筒准确量取甲醇ml乙酸ml补加注射用水至ml置于ml瓶中二深圳培训网wwwtopcom人复核贴签标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期常温贮存。(((洗液ml用量筒准确量取无水乙醇ml乙酸ml补加注射用水至ml置于ml三角瓶中二人复核贴签标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期常温贮存。(((重铬酸钾溶液ml用扭力天平准确称取重铬酸钾g加注射用水至ml加浓HNOml摇匀溶解置于棕色瓶中二人复核贴签标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期常温保存。(((硝酸银溶液ml用扭力天平准确称取硝酸银g加注射用水至ml置于棕色瓶中避光保存二人复核贴签标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期限当次试验使用。(((显色液ml用扭力天平准确称取NaCOg加注射用水至ml溶解后加ml甲醛置于ml三角瓶中二人复核贴签标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期常温贮存。(((终止液ml用吸管准确吸取乙酸ml溶于ml注射用水中置于ml瓶中二人复核贴签标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期常温贮存。(((样品处理液(还原型)ml用扭力天平准确称取Trisg、SDSg、溴酚蓝g溶于ml注射用水中加入甘油mlβ巯基乙醇ml浓HClml加注射用水定容至ml二人复核贴签标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期冰箱放置。((样品准备:将样品自冰箱内拿出放置室温溶化后将样品与样品处理液按:(VV)的比例混匀沸水处理,分钟待用。(操作过程(((分离胶()制备聚丙烯酰胺凝胶母液ml,分离胶缓冲液ml,SDSml注射用水ml过硫酸铵mlTEMEDml制成胶量ml。(((浓缩胶()的制备聚丙烯酰胺凝胶母液ml,,浓缩胶缓冲液ml,注射用水mlSDSml过硫酸铵mlTEMEDmlpH成胶量ml。深圳培训网wwwtopcom(((灌胶灌胶时先将电泳槽阳极侧用透析纸包上在电泳槽内加满水靠水压封住阳极侧缝隙以免胶溶液漏出在两玻璃板间加分离胶加胶完毕后用注射器沿玻璃板在液面上覆盖一层(约cm高)正丁醇待胶凝固后将电泳槽内注射用水及胶表面的正丁醇倒掉并用滤纸吸干向电泳槽内加入电极缓冲液、在浓缩胶位置插上梳子在分离胶上加浓缩胶待胶凝固后抽去梳子。((加样:将处理后样品按每孔不少于ug的蛋白量加入样品槽内同时在另一测加入分子量标准品作对照。((电泳:打开电泳仪摘下“备用”标志牌挂“运行”标志牌调定电流起始电流mA待指示线跑至分离胶处改电流为mA电泳时间约为小时待指示剂至底线处停止电泳,关闭电泳仪摘掉“运行”标志牌,挂“备用”标志牌。((染色电泳完毕后取下胶片置于倍胶体积的固定液内h(或室温振荡分钟)洗液洗三次每次分钟摇床内振荡取ml重铬酸钾母液加入ml注射用水中将胶片置其中,避光,振荡分钟用注射用水洗数次至黄色本底变白加入新配制的AgNO溶液白炽灯下照射分钟水洗五次显色液ml中加甲醛ml待样品蛋白带及分子量蛋白带清晰后弃去显色液加入终止液。((扫描(((打开扫描仪,摘下“备用”标志牌,挂上“运行”标志牌。(((对胶片进行扫描,同时记录下扫描结果。(((关闭扫描仪,摘下“运行”标志牌,挂“备用”标志牌。((摘下场地“使用中”标志牌,挂“待处理”标志牌。结果判定(制作标准蛋白泳动曲线:以各标准蛋白质的相对迁移率为横坐标蛋白质分子量的对数为纵坐标在半对数坐标纸上作图可得到一条标准曲线。(计算检品的Rf值蛋白质样品移动距离×染色前胶长Rf=脱色后胶长指示剂移动距离在标准蛋白质分子量的泳动曲线上查得LogMW查反对数表即得待检品的蛋白质分子量。深圳培训网wwwtopcom(判定标准所得的检品蛋白质分子量结果与理论值进行比较误差不超过为合格。IFNαb理论值:KDIFNαb理论值:KDIFNαa理论值:KDIL理论值:KDGMCSFb理论值:KD(判定结果填写记录。清场(需要低温贮存的液体放入冰箱避光的液体放入阴暗处。(称药之后将药品瓶盖盖紧放回药品柜。(关闭扭力天平清洁干净后放回原处挂“备用”标志牌。(清洁工作台面用专用抹布擦净地面用专用拖布拖净。(用过的玻璃器皿用纯化水冲洗干净后返回洗刷组。(填写清场记录。(清场后由车间工序负责人或质量监督员检查合格后,摘下待处理标志,挂“清场合格”标志牌。注意事项(本实验所用SDS需高纯度SDS,如不纯需重结晶。(样品必须经沸水处理分钟,以免有亚稳聚合物存在。引用文献(参考标准:《中华人民共和国药典》年版。(《生化实验技术和方法》张龙翔主编高等教育出版社。(医用实验病毒学。附:SDSPAGE(快速电泳)准备工作同前。制胶(分离胶制备:()聚丙烯酰胺凝胶母液ml,分离胶缓冲液ml,SDSml注射用水ml过硫酸铵mlTEMEDml制成胶量ml。深圳培训网wwwtopcom(浓缩胶的制备()聚丙烯酰胺凝胶母液ml,浓缩胶缓冲液ml,注射用水mlSDSml过硫酸铵mlTEMEDmlpH成胶量ml。(灌胶:先将分离胶液加入制胶器内上面加一薄层正丁醇待胶凝固后在浓缩胶位置上插梳子在分离胶上加浓缩胶待胶凝固后抽去梳子。预电泳:打开电泳仪摘掉“备用”标志牌挂上“运行”标志牌。恒定电压V时间分钟。上样将处理后样品按每孔不少于ug的蛋白量加入样品槽同时在另一侧加入分子量标准品作对照。电泳恒定电流mA电泳时间h。指示剂至底线处停止电泳。关闭电泳仪摘掉“运行”标志牌挂“备用”标志牌。其余步骤同前。

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