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亚油酸及亚油酸甲酯的抗炎作用的研究.doc

亚油酸及亚油酸甲酯的抗炎作用的研究

孙山美
2017-09-20 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《亚油酸及亚油酸甲酯的抗炎作用的研究doc》,可适用于高等教育领域

亚油酸及亚油酸甲酯的抗炎作用的研究西南交通大学硕士学位论文亚油酸及亚油酸甲酯的抗炎作用研究姓名:赵敏申请学位级别:硕士专业:微生物与生化药学指导教师:喻凯西南交通大学硕士研究生学位论文第页摘要目的:在用细胞培养方法,探明亚油酸甲酯能有效抑制白细胞炎症性细胞因子表达的基础上,本研究拟通过制备小鼠耳廓肿胀模型和大鼠佐剂性关节炎模型,考察亚油酸和亚油酸甲酯对急、慢性炎症的防治作用,为抗炎新药的研发奠定一定基础。方法:对小鼠右耳预防性涂擦给药天后,使用巴豆油混合致炎剂制备小鼠右耳的急性炎症模型,观察小鼠的一般情况,最后称重比较左右耳片重量差异,计算肿胀度抑制率,同时比较受试药物对耳片组织中几、和表达水平的影响,考察亚油酸及亚油酸甲酯对急性炎症的预防作用。采用弗氏完全佐剂制备大鼠佐剂性关节炎大鼠模型,通过灌胃和涂擦给药治疗,天后检测并比较各组大鼠的关节肿胀度、体重、胸腺指数、脾脏指数、血清中一和盯表达水平的变化,考察亚油酸及亚油酸甲酯对慢性炎症的治疗作用。结果:急性抗炎研究结果显示:涂擦亚油酸和亚油酸甲酯会造成小鼠耳片出现皮肤发红、发干、增厚的现象,但是对巴豆油所致小鼠耳肿胀有明显的抑制作用,并观察到亚油酸和亚油酸甲酯组肿胀组织中、口、绝对数值均低于模型组,但无统计学意义。亚油酸甲酯对皮肤的刺激性稍弱。慢性炎症研究结果显示:亚油酸和亚油酸甲酯可降低血清中细胞因子和的水平,能明显改善大鼠的关节炎症状、减轻滑膜炎症,而且没有地塞米松所导致的体重减轻、抑制全身免疫功能的副作用。低剂量的亚油酸或亚油酸甲酯的效果会更好一些。结论:亚油酸和亚油酸甲酯能降低炎症相关因子几、【和的水平,对急、慢性炎症均有明显的改善作用,但局部给药时,两者对皮肤均有一定的刺激作用,可造成局部皮肤发红、发干、增厚,但亚油酸甲酯的刺激性比亚油酸稍弱。关键词亚油酸亚油酸甲酯炎症因子耳肿胀关节炎第页西南交通大学硕士研究生学位论文::,,,,,,,’,,’,,,,,【::,,,,,,:盯,,,第页西南交通大学硕士研究生学位论文丽:,,一,,,:西南交通大学硕士研究生学位论文第页缩略表:,脂多糖一:,白细胞介素一:,白细胞介素师:,肿瘤坏死因子【:,核转录因子:,激活受体仪,共轭亚油酸:,巨噬细胞炎性蛋白,中性粒细胞趋化因子:一:一,环氧酶:,白三烯吖:,干扰素,血小板活化因子:,前列腺素:,前列腺素过氧化合成酶::,磷脂酶,转化生长因子:,血栓素:,细胞毒性淋巴细胞:,多形核白细胞,氧自由基::,活性氮自由基:,一氧化氮:,一氧化氮合成酶,下丘脑垂体一肾上腺:,促肾上腺激素::,非甾体抗炎药,乙酰水杨酸:西南交通大学硕士研究生学位论文第页:,糖皮质激素叫:,肌肉骨骼超声:,改变病情抗风湿药,佛波酯::酶联免疫吸附测定:二甲基亚砜’,完全弗氏佐剂:,佐剂性关节炎大鼠:,类风湿性关节炎:,内皮细胞蝴:,血管细胞黏附分子:,血小板内皮细胞黏附分子:,蛋白激酶西南交通大学硕士研究生学位论文第页第章绪论课题背景简介亚油酸是一种功能性的多不饱和脂肪酸,能降低血清胆固醇水平及抑制动脉血栓的形成,具有防癌抗癌作用,参与人体心血管疾病的控制、机体免疫调节、细胞生长与凋亡等【圳。这类不饱和酯已有较多研究,涉及到对细胞因子和其他炎性介质的影响及对血小板活性和血栓形成的影响【。还有研究认为和能增加组织因子的表达,而亚油酸和亚麻酸能抑制组织因子的表达【,,。另外可将这类脂肪酸用于治疗炎症和疼痛的研究将亚麻酸、海藻等混合制成外用药,治疗关节、肌肉的炎症和疼痛【】。油酸和亚油酸对不同的慢性炎症有影响,能改变一系列免疫细胞的功能,参与免疫调节过程【每。近年也有研究发现亚油酸可促进伤口愈合,并且在伤口愈合过程中能减少炎症细胞的数量,可明显降低炎症因子、、以及等的含量【,即抑制炎症因子的水平。本实验室在抑制基因表达的植物成分的研究【】中发现,从植物中提取的亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯能有效抑制细胞中基因的表达,而是一种重要的炎症介质。我们还初步探讨了亚油酸和亚油酸甲酯对佐剂性关节炎大鼠的治疗作用,发现它们能降低血清的水平,减轻关节炎症反应。因此,我们将针对亚油酸和亚油酸甲酯抗炎作用做进一步研究,考察二者对急、慢性炎症的预防和治疗作用,并探讨它们抗炎作用的可能机理,为抗炎新药的研发奠定基础。亚油酸和亚油酸甲酯简介亚油酸亚油酸,顺顺十八碳二烯酸,分子式,分子量,是一种含有个碳原子和个双键的不饱和脂肪酸,为无色油状液体。其结构式为:西南交通大学硕士研究生学位论文第页。二。一一,,亚油酸是体内必需脂肪酸的一种,而且是一种功能性多不饱和脂肪酸。在我们的日常食用液体植物油中普遍存在,其中半干性和干性油中含量较爹】。一般植物油中亚油酸的含量为左右,也有高达~的,如红花籽油、葵花籽油、棉籽油、大豆油、玉米油、芝麻油中含量较为丰富,其含量为一。亚油酸具有促进新陈代谢、调节内分泌、减缓衰老以及软化心脑血管、促进血液循环、降脂降压等重要作用,正因为如此亚油酸被称为“血管清道夫”。亚油酸与胆固醇结合生成酯,并促使其降解为胆酸而排出,进而使得血液中胆固醇水平降低还可通过改变胆固醇在体内分布,减少脂质在血管壁的沉积,从而使血管壁的功能得到维持和改善:并能降低血中低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白及甘油三酯水平,使高密度脂蛋白水平升高。正因为亚油酸有降低血清胆固醇和甘油三酸酯的作用,故对防止心脑血管疾病、延长人类寿命起着积极的作用【。在目前的研究与使用中并未发现其有明显的副作用,有非常高的安全性,并且被用作评价食用油营养价值的指标之一。亚油酸:为必需脂肪酸,它在体内的代谢后可产生对人体有重要生理功能的。亚油酸是一系列有特殊生物活性的化合物类二十烷酸的前体,是一种能影响血压、血管反应性、凝血以及免疫系统的脂肪激素引。共轭亚油酸是一种新型的功能性的脂肪酸,能改变物质代谢,增强肌体免疫力、改善脂肪代谢具有降脂减肥、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病、抑制皮肤癌、胃癌、肠癌、抑制合成的作用:还能促进淋巴细胞及也的生成,激活过氧化物酶体增生因子受体,诱导肿瘤细胞系过氧化物酶体增生因子受体响应的的积累,等重要生理功能。等人【】提到能抑制骨吸收、促进骨形成,增加松质骨的密度调节的激活与表达,影响炎症因子,还能促进钙的吸收,可抑制和改善关节炎症,所以很有希望将作为类风湿性关节炎的候选药物。亚油酸还能抑制肠道病原菌,具有防癌抗癌、抗氧化作用,并参与人体心血管疾病的控制、增强机体免疫能力、促进骨组织代谢、调节细胞生长与凋亡等【刮。有研究西南交通大学硕士研究生学位论文第页认为和能增加组织因子的表达,这种组织因子能引发血液在血管内皮细胞表面凝结而形成血栓,亚油酸和亚麻酸能抑制组织因子的表达【’~。也可将这类脂肪酸用于治疗炎症和疼痛的研究将亚麻酸、海藻等混合制成外用药,治疗关节、肌肉的炎症和疼痛【~。油酸和亚油酸对不同的慢性炎症有影响,能改变一系列免疫细胞的功能,参与免疫调节过程【’”。另外近年有研究发现亚油酸可促进伤口愈合,在伤口愈合过程中能减少炎症细胞的数量,可明显降低炎症因子也、、【和巨噬细胞炎性蛋白的浓度,减弱的活性【。亚油酸甲酯亚油酸甲酯,浅黄色液体。分子式:,结构式为:亚油酸甲酯对空气敏感,对皮肤有刺激性。等人研究脂肪酸的刺激性发现:小鼠对不饱和的碳脂肪酸油酸、亚油酸、亚麻酸表现出高频率舔反应,对碳脂肪酸棕榈酸、花生四烯酸有低舔行为,对饱和脂肪酸硬脂酸、花生酸和脂肪酸衍生物亚油酸甲酯并没有明显的反应。但是小鼠对低浓度的亚油酸和亚麻酸无反应,说明亚油酸和亚麻酸有一定的刺激性,而亚油酸甲酯刺激性很小。较多的研究表明亚油酸甲酯类,涉及到对细胞因子和其他炎性介质的影响及对血小板活性和血栓形成的影响【。有研究认为和能增加组织因子的表达,这种组织因子能引发血液在血管内皮细胞表面凝结而形成血栓,亚油酸和亚麻酸能抑制这种组织因子的表达【】。而这种抑制可能是通过抑制的表达而实现的,可以将这类脂肪酸用于治疗炎症和疼痛的研究。另外本实验室在抑制基因表达的植物成分的研究【】中发现,从植物中提取的亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯能有效抑制细胞中基因的表达。西南交通大学硕士研究生学位论文第页炎症炎症是一种十分常见但又很重要的基本病理过程。作为最重要的基本病理过程之一,会引起各类炎症反应,而各种炎症性疾病在人类疾病谱中占据极为重要的地位【引。在临床体征上,炎症的一般表现是红、肿、热、痛和功能障碍而从病理生理角度分析,热和红是血管扩张和血流增加的表现,痛是局部热、机械和化学感受器受到刺激的结果水肿表示血管渗透性增加、血浆外渗和细胞游走功能紊乱是有毒的细胞产物或者特异蛋白酶造成组织破坏或者更复杂的损伤所致【。化学、物理学以及生物学病因引起的急性炎症反应可引起白细胞募集,也就是白细胞快速地、部位导向地到达身体的靶区域,这也是损伤部位产生有效宿主防御的首要步骤,第二步是白细胞利用自身特异的机制,可有效的消除外来的有害物质或者宿主损伤的组织细胞。同时通过牵制机制,来预防白细胞破坏潜力所导致的组织损伤的失控。最后,是组织的修复和损伤的痊愈。可以说,炎症是具有血管系统的活体组织对各种损伤因子所产生的防御反应和修复。炎症介质炎症的发展是一种逐渐扩大的级联反应过程,需要白细胞在损伤部位募集,涉及细胞自身的变化,细胞之间的相互作用以及细胞的迁移,需要一些化学活性物质介导或放大这些反应。这些化学物质称为炎症介质,但并不是所有的化学物质都是炎症介质。在整个炎症过程中,伴随着病理生理学变化,会发生很多生物化学和分子生物学的变化。在分子水平上,有多种炎症介质生成,诱导多种细胞因子、趋化因子、激肽以及它们的相关受体、粘附因子、炎症酶如诱导的、诱导的表达,具有促进和调控炎症发展的作用【引。不同类型的炎症有不同的细胞参与一生物胺:比如组胺、羟色胺二激肽:比如缓激肽等三补体系统:包括一系列协助进行抗原抗体免疫反应的血清蛋白四类脂质介质:包括前列腺素、白三烯、血小板活化因西南交通大学硕士研究生学位论文第页子等五细胞因子:白介素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子等六趋化因子:包括一系列不同结构的化学吸引肽。几种类型炎症介质的简介一前列腺素:前列腺素类物质包括前列腺素和血栓烷素,以前列酸分子为基本骨架,是一类有个碳原子的不饱和脂肪酸,如花生四烯酸通过还氧酶,代谢的中间产物。可由多种细胞产生,当机体受多种因素刺激时,体内有多种细胞可以合成这些物质,同时迅速释放出来。通常以旁分泌或外分泌的方式作用于临近的组织或者外周组织,以此来维持内环境的稳态,并能抵御外界应激可能对机体的损伤。它们不储存,当细胞受到机械损伤或者特异的细胞因子、生长因子作用或者其他的刺激而被激活时,利用从膜释放的花生四烯酸进行合成。的合成需要一系列酶的参与,主要有,和有关合成酶。的生物学作用:炎症期内源性的合成增加:在未发生炎症的组织内,的含量一般是很低的,而急性炎症一旦发生,的含量迅速增加,这种现象无论在实验性关节炎模型还是在人的炎症性疾病中均可以观察到外源性引起炎症变化:例如,在人的皮内注射入,在内引起红斑和肿胀,这些体征是通过增加血流和血管通透性引起的,并导致水肿,这提示在炎症过程中涉及血管扩张在调节免疫和过敏中的作用。二自三烯:白三烯,是花生四烯酸的代谢产物,也是重要的炎症介质。通过一系列酶促作用生成、、、。并不长期储存于细胞中,而是当细胞受到刺激迅速合成【】。和另一类代谢产物,它与相反,主要由炎症细胞,如中性粒细胞。巨噬细胞和肥大细胞产生,广泛参与生物体的生理病理过程,如炎症、哮喘、脑缺血再灌注损伤、癫痫、脑肿瘤急性肺损伤、肾损伤、创伤、肝损伤等。与炎症密切相关性首先表现在,各种炎症部位有大量的存在。在人的实验性炎症模型和人的炎症疾病中,均含有大量的【。,:是由两种酶三血小板活化因子西南交通大学硕士研究生学位论文第页和乙酰基转移酶共同作用于细胞膜甘油磷酸胆碱而生成的一种生物活性磷脂,是目前发现的作用最强的脂质类炎症介质,它广泛存在于人体各种组织中,广泛的参与血小板的活化、急性炎症、过敏性哮喘、内毒素血症及心脑血管系统损害等病理生理过程【。是一种重要的炎症介质,它不仅引起血管通透性增加,还能广泛激活炎性细胞并引起炎性细胞的聚集以及各种炎性介质的释放,从而形成复杂的网络。多种拮抗剂能抑制这种反应,使炎症减轻。也可通过、、等因子介导和调节细胞凋亡及细胞的杀肿瘤效应【】。的生物学作用:最初发现生物学功能是强效的血小板聚集和释放作用,之后不断发现与很多疾病的病理生理过程密切相关,如急性呼吸窘迫综合征、哮喘、关节炎、肾小球肾炎等。炎症部位的:多数实验表明,在炎症部位的含量明显偏高,如气管炎患者的气道内血小板活化因子含量高于正常人,佛波酯诱发大鼠胸膜炎后积液中含量增加,抗原致敏的嗜碱性粒细胞可释放与炎症有关的作用:包括对微血管的作用可明显增加血管通透性,其强度为组胺的~倍和对细胞的作用趋化作用、分泌功能、粘附作用。四细胞因子:在某些刺激因素的作用下,免疫细胞细胞、细胞、细胞、单核巨噬细胞以及某些非免疫细胞如纤维母细胞等可合成和分泌的一类生物活性物质,这类物质即称为细胞因子。细胞因子多为分子量为的多肽或糖蛋白,并作为细胞问信号传递分子在介导和调节慢性炎症反应中起重要作用】。细胞因子通过与细胞特异的膜受体结合而起作用,并能改变分泌细胞自身或其他细胞的行为或性质。根据细胞因子功能的不同,对细胞因子有不同的分类方式,在感染及炎症反应中某些细胞因子主要促进炎症反应,称之为前炎症细胞因子或促炎症细胞因子【。明显促进炎症的细胞因子,即为前炎症细胞因子能抑制前炎症细胞因子活性的细胞因子,则为抗炎细胞因子。例如:巨噬细胞移动抑制因子可刺激、、、一的分泌,间接引起炎症,同时它还可刺激滑膜成纤维细胞增殖和新生血管的形成【】。而、和是淋巴细胞的激活剂,但同时也是强效的抗炎剂,因为它们有抑制前炎症细胞因西南交通大学硕士研究生学位论文第页子如、和趋化因子的基因表达的能力。干扰素吖是另一个多效性的细胞因子,像【、一样,吖具有抗病毒活性。丫也是导致细胞毒细胞途径的激活剂,但同时又被认为是一个前炎症细胞因子,因为它增加的活性和诱导。前炎症细胞因子介导的炎症过程涉及一些基因产物的级联反应,其一是在炎症中上调小分子介质编码基因。例如,、和等前炎症基因,这些基因编码的酶,可以增加,和的合成另一类是趋化因子的前炎症基因,产物是一类小肽,其作用是使白细胞易于脱离血循环而进入组织,是中性粒细胞的趋化因子,它也有激活中性粒细胞的作用,从而引起细胞脱颗粒和组织损伤和是皮内细胞粘附因子的诱导剂,能促进白细胞与内皮细胞的粘附,是白细胞游走到组织的基础,细胞因子和在刺激这些基因表达中有特殊的作用。抗炎细胞因子阻断这个过程或者至少抑制这个级联反应的强度,如、、和转化生长因子等细胞能够抑制、、趋化因子和血管粘附分子的生成。白细胞介素是一类分子量为~的细胞因子,包括和两种类型,它们具有的氨基酸序列同源性,并能够结合同一种受体。可由多种细胞合成和分泌,而最主要的是由活化的巨噬细胞产生。具有多种免疫学功能,包括刺激细胞的增殖和分化、促进抗体产生,促进细胞增殖,增加、吖和的表达,并协同、丫诱导产生,增强细胞的活性】。作为一种重要的促炎性细胞因子,还能刺激各种免疫细胞核炎症细胞,尤其是中性粒细胞,释放炎症介质,引起单核细胞、内皮细胞合成,诱导内皮细胞表达粘附分子,对中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞有趋化作用,大量分泌并进入血流可引起发热【。诱导若干转录因子,可诱导的转录,对的产生没有影响【。白细胞介素,主要由炎症状态下或免疫反应中的单核巨噬细胞产生,具有调节免疫细胞功能、促进造血、引起发热等功能,是介导炎症反应的关键成分【,。促炎性细胞因子为体内作用最强的炎症介质之一,主要由参与炎症的细胞产生,其生物学效应也呈现出多效性,是局部和全身西南交通大学硕士研究生学位论文第页炎症反应中起核心作用的炎性细胞因子【瑚】。可通过诱导黏附分子,如细胞间黏附分子增加白细胞黏附还可以导致脑水肿,还可以作用于口,加重对内皮细胞的损害作用促进炎症细胞在损伤区聚集,加重中枢神经系统炎症反应【’。是一种强有力的致痛物质对神经根直接刺激或增强缓激肽的敏感性【,如在类风湿性关节炎的关节腔内就发现有较高浓度的。肿瘤坏死因子的生物学作用包括:介导白细胞粘附于血管内皮细胞,首先是中性粒细胞,随后是单核细胞和淋巴细胞激活炎性白细胞杀死微生物刺激单核细胞和其他细胞产生细胞因子,包括、、等,刺激细胞和细胞产生抗体诱导血管内皮细胞核成纤维细胞合成集落刺激因子,杀伤或抑制某些肿瘤细胞大量进入血流引起发热【。主要由巨噬细胞产生,是较强的刺激剂,细胞核天然杀伤细胞在某些刺激作用下也可分泌仅主要由活化的细胞产生,刺激剂为抗原或者丝裂原。是强有力的炎性细胞因子,它可诱导内皮细胞表达黏附分子,促进白细胞与血管内皮黏附、渗透,从而导致局部炎症可作用于血管的内皮细胞,进而诱导血管内皮细胞产生其它的炎症介质,这些炎症介质与等共同引起局部的炎症反应【。是细胞因子网络的启动因子,具有促进炎症反应、血栓形成和收缩血管及神经毒性作用,是参与炎症反应和组织损伤的关键因子。可促使其它炎性介质如仆及的快速生成,造成细胞因子的激联放大反应,导致“瀑布效应”,从而使机体处于一种高代谢状态,并激发机体产生一系列病理生理改变,如发热、低血压、乳酸酸中毒和不可逆性休克‘。仅能刺激释放氧自由基和蛋白分解酶,合成并释放,诱导产生白三烯、血栓素。损伤部位产生的还可刺激血管内皮细胞的合成、并表达同时可以作用于仅。趋化因子趋化因子是一类~个氨基酸的碱性蛋白,分子量范围,结构、功能相似,大部分由细胞分泌,少数在细胞表面表达的。趋化因子的作用是控制西南交通大学硕士研究生学位论文第页和调节白细胞的趋化运动、以及免疫功能,因而它在机体的免疫调节中起重要的作用。绝大多数趋化因子在一级结构上包含有个保守的半胱氨酸残基,根据趋化因子端保守的半胱氨酸的数量及排列方式,将它们分为,,及为半胱氨酸,为任意氨基酸个亚类‘。。炎症趋化因子仅仅在特定的条件下被炎症细胞因子特异地诱导表达,一般来讲,、和【,广泛诱导各种类型细胞表达炎症趋化因子,而其他炎症介质诱导更特异的反应。趋化因子与细胞的趋化作用有关,浓度较高时它可由诱导细胞表达其载体,趋化因子的受体具有跨膜区域,以类似与粘附分子的方式引起粘附和游走,大部分趋化因子是分泌型的,这些碱性蛋白通过与负电荷的葡糖胺聚糖作用固定在细胞或者细胞外基质表面。而且特异的趋化因子以不同的亲和力结合不同类型的葡糖胺聚糖。葡糖胺聚糖的类型能随着细胞的类型部位和炎症状态而变化,因此,这种选择性可能是一种调节方式,它决定趋化因子在某些组织或炎症状态下的不同功能。因此,在靠近炎症和游走刺激部位存在高浓度的趋化因子,吸引白细胞向这个部位移动。研究表明:趋化因子的分泌与表达涉及多种细胞,它与细胞表面的趋化因子受体结合,从而介导炎性细胞的定向迁移募集炎性细胞的同时,表达并分泌大量、多种趋化因子,进一步加剧炎症损伤【】。粘附分子白细胞游走到宿主防御部位,是自细胞募集的重要步骤。白细胞游走依赖于白细胞和内皮细胞之间复杂的相互作用,最终引起内皮细胞粘附分子的表达和启动内皮细胞分泌炎症介质。白细胞募集的分子机制是多样性的,主要与炎症刺激剂、被募集白细胞的类型、所在组织、被激活的情况、粘附分子和炎症介质的类型有关。在急性炎症期间,多形核白细胞受到刺激后在数分钟到数小时内发生游走,而单核细胞在大约的延迟聚集在损伤部位【。微生物侵入和组织损伤引起的急性炎症反应是与组织巨噬细胞、肥大细胞或其他组织细胞如损伤的成纤维细胞释放炎症介质相联系的,可溶性介质像组胺、和激活毛细血管后静脉内的内皮细胞,诱导粘附分子的表达和分泌可溶性介质,引起白细胞内皮细胞相互作用。粘附分子的多样性和特异性组成了炎症期间白细胞定向移动的分子基础。核因子西南交通大学硕士研究生学位论文第页是一种序列特异性转录因子,几乎在所有的细胞内都有表达,在炎症反应中居于中心环节地位。在慢性炎症反应中,作用的靶基因包括:促炎细胞因子、趋化因子、粘附分子、免疫反应的受体、产生炎症介质的酶和调节细胞凋亡的基因。所有这些表达的细胞因子以及化学因子,都在慢性炎症中发挥着重要的作用。某些细胞因子和可以互相诱导和激活,并由此引起的活化,导致其在细胞间互相传导,因而使得炎症反应的区域不断的扩大、炎症持久且慢性化【叫。如可以激活通路介导的炎症介质的转录和表达,并通过通路诱导多种炎症介质在血管内皮细胞和系膜细胞中的表达,形成一个增强的自分泌回路,并借此加重炎症损伤程度,促进炎症的发生及发展叽”。前炎症基因诱导通常是增加了一个转录因子亚类的活性,近年来,它们在开发新的抗炎药中成了有吸引力的靶点,在控制炎症基因表达的转录因子中,在协调表达各种可溶性前炎症介质例如细胞因子和趋化因子和白细胞粘附分子中起着关键的和进化保守的作用。水杨酸和糖皮质激素能抑制的活性,表达针对:活性靶点的药物在临床上治疗炎症相关的疾病是有效的。活性氮自由基活性氮自由基是一氧化氮及其生物体内激发产物的总称。是一种小分子气体,含有一个未配对电子,因而具有自由基性质。是这一种反应性极强的自由基,由一氧化氮合酶催化生成。正常情况下,起着宿主防疫作用,可激活巨噬细胞并杀灭病原微生物及肿瘤细胞的主要效应因子但也是重要的炎症介质,过量的可导致各种慢性炎症的发生,在炎症的发生和发展中起重要作用】。一氧化氮合成酶是一类蛋白质家族,主要有三种亚型,分别有不同的基因编码。三种异构体之间有~的共有序列,其中主要是一些特定的功能区。催化生成的酶之所以称为合酶而非合成酶,是因为在其催化过程中不需要提供能量,而合成酶在该酶催化底物过程中需要供能】。的分类主要三种亚型:神经元型、诱导型和内皮型。西南交通大学硕士研究生学位论文第页其中主要存在于中枢神经细胞和外周神经元中主要存在于巨噬细胞和中性粒细胞中主要存在于血管内皮细胞中。和在细胞生理状态下即有表达,所以又合称为结构型,又因为其酶活性受钙离子信号途径激活,故为钙调蛋白依赖酶。主要位于神经元内,在生理情况下,活性较低,其通过合成发挥调节脑血流,介导神经元兴奋毒性以及炎性损害等多种作用【。在正常状态下不存在于细胞中,只有在受到内毒素或者其他细胞因子、干扰素、因子等的刺激时,心肌细胞、肝细胞、血管平滑肌细胞以及巨噬细胞等细胞内才能诱导的表达,所以,又称为病理性。主要分布在巨噬细胞、肝细胞等,当受到某些细胞因子,如内毒素、白介素、脂多糖及干扰素刺激后而表达,故称,其酶活性不依赖钙调蛋白,主要参与免疫、炎症等反应,某些物质如皮质激素则可抑制其表达。激活造成的升高延续的时间也较长,可以达到数小时乃至数天,开始时,其效应往往是生理功能明显加强,例如免疫功能强化、激素释放增加、细胞分泌增加等。所以的主要功能是:免疫功能、炎症反应、肿瘤等。是一种重要的内源性生物信使分子,类似自由基,含有一个未配对的电子,因其具有脂溶性,可以迅速透过生物膜扩散,因而具有活跃的化学活性。身体中几乎所有的细胞都产生,但是具有不同生物学功能:抑制血小板的黏附和活化,抑制多核粒细胞的聚集,抑制血管平滑肌的增殖作为神经传导递质,参与脑的发育、学习和记忆过程起宿主防御免疫功能,具有抗肿瘤、抗菌和抗其它侵入性微生物的作用。内环境稳定作用都普遍伴随低水平的,但是过多的会导致炎症和免疫紊乱、疼痛、神经疾病、动脉粥样硬化和癌症等【。炎症模型炎症包括以血管通透性为主要改变的急性炎症和以肉芽组织增生为指标的亚急性炎症、免疫性炎症,如类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣、过敏性哮喘等。炎症可见于多种疾病的病理过程。研究药物的抗炎作用,须先复制炎症动物西南交通大学硕士研究生学位论文第页模型,模型的成功与否,关系到对抗炎药物疗效的评价。一般多选用哺乳类动物,根据实验目的选用不同种属动物。致炎剂的选择很重要,所选用的致炎剂应具备以下特点:能精确定量,所致炎症恒定、可靠,炎症持续时间较长。由于炎症过程极为复杂,且动物模型与人体的实际情况毕竟不完全相同,在评价抗炎免疫药物药效时,需要以多种类型的模型进行观察实验。筛选抗炎药物时需要进行急性炎症、亚急性炎症和免疫性炎症模型的试验。一般先选用以血管通透性为主要改变的急性炎症模型,然后选用以肉芽组织增生为特点的亚急性炎症模型及免疫性炎症模型如佐剂性关节炎,进行综合评价。下面介绍几种常使用的炎症模型有急性炎症模型、亚急性炎症和慢性炎症模犁【’。急性炎症小鼠耳部炎症模型化学物质,如巴豆油、二甲苯等,以及炎症介质,如花生四烯酸、等,可引起急性炎症,表现为局部充血、水肿等明显的炎症反应。若将这些致炎物质涂于小鼠耳部,可以诱导其耳部肿胀,使用抗炎药可使肿胀减轻甚至消除。这一模型已成为筛选抗炎药的常规模型之一,因为该模型较易操作,且小鼠价格便宜,所以在实验中经常被选用。另外此法简便,重复性好,取的结果快。左右两侧耳片重量之差作为衡量肿胀程度的指标,抗炎作用强度以抑制率表示【。常用的致炎物质有二甲苯、巴豆油,其主要原理是:致使某些炎症介质如组胺、激肽和纤维蛋白溶解的释放,可引起局部毛细血管通透性增加、炎症细胞聚集浸润,从而造成耳部急性渗出性的炎症水肿。用二甲苯等致炎物质涂抹实验小鼠一侧的耳部,一段时间后用打孔器取双左右耳同一部位的耳片,电子天平称重、并计算两耳片的重量差异、以及肿胀抑制率作为检测指标。还有人使用花生四烯酸来建立小鼠耳肿胀模型,该模型发现:咪唑斯汀可明显抑制这种炎症反应,而组胺受体拮抗剂氯雷他定则不能抑制这种炎症反应,说明不同的药物对不同致炎物质所造的模型有不同的。反应【足跖肿胀模型足肿胀模型可选用选择大鼠或者小鼠,一般大鼠足肿胀模型运用较多,同时小鼠西南交通大学硕士研究生学位论文第页足肿胀模型近年多被选用由于小鼠价格便宜、操作简便、易于测量。大鼠足肿胀模型常用蛋清或者角叉菜胶造模,其中蛋清所致大鼠脚肿胀模型,主要以组织胺、羟色胺为炎性介质,炎症发展迅速、肿胀度可达~,并于明显消退,同时该模型对药物的反应比较灵敏,重现性好。角叉菜胶是一种酸性黏多糖,将其注入大鼠足跖后可引起水肿。还有右旋糖酐等,亦可用于制备大鼠足肿胀模型。小鼠足肿胀模型可采用角叉菜胶、酵母多糖、制霉菌素来制备。酵母多糖能诱导多种炎性介质的释放,包括组胺、、、、、、等制霉菌素主要通过破坏溶酶体膜的稳定性而致炎。大鼠脚肿胀的测量方法有:排水法、采用仪器测量但价格较贵,一般很少采用而小鼠脚肿胀的测量较简便,是因为可以直接将其肿足剪下、并称重即可【,。大鼠角叉菜胶性关节肿:实验采用大鼠,给药组分别为给待测药液、对照组给溶剂,给药一定时间在自大鼠右后足跖皮内注射角叉菜生理盐溶液致炎。致炎局部前列腺素合成增加,与血管活性物质和激肽类共同诱发大鼠足踝水肿,于是针对不同时间,如注射、、、、,测量右后足踝关节圆周,以左右踝关节圆周为空白对照,左右踝关节圆周差作为肿胀程度的指标,以抑制率反应药物抗炎作用强度。该模型的特点是:可用于观察药物对急性炎症过程的影响。大鼠腹腔白细胞游走实验使用羧甲基纤维素建立大鼠腹腔白细胞游走模型,给药组给待测药液、对照组给溶剂,一定时间后腹腔注射羧甲基纤维素钠溶液,后将动物拉颈处死,并在腹腔注射生理盐水,用于洗腹腔内容物,将洗出液置于显微镜下计白细胞总数,与对照组白细胞总数比较,进而计算给药组抑制白细胞游走的百分率。该炎症模型的发病机制是:在血管活性胺或等介质参与下,补体被激活,这样就可以吸引白细胞,致使白细胞脱颗粒,增加血管通透性、使血小板聚集,从而导致血管炎症,表现为局部组织水肿。所以该模型主要反映炎症中期,白细胞的游走趋化过程【】。亚急性炎症和慢性炎症大鼠佐剂性关节炎佐剂性关节炎是一种细胞介导的自身免疫性炎症疾病模型,其滑膜的组织学改变,与人类及其类似。佐剂性关节炎模型的制备,常用的造模剂包括弗氏不完全佐剂西南交通大学硕士研究生学位论文第页和弗氏完全佐剂。其致炎机理是造模剂作为抗原进入机体后,使细胞致敏,当再次接触抗原后,致敏细胞分化增殖,进而释放各种淋巴因子或直接杀伤靶细胞,引起单核细胞的浸润,同时由抗原抗体形成的免疫复合体激活补体,导致白细胞趋化激活,释放一系列致炎因子产生局部和全身炎症反应。大鼠踝关节皮内注射灭活的结核菌后,第左右,产生全身性多发性关节炎,累及尾、四肢各个关节、耳部出现红斑,发病机制和人类类似,常用于筛选抗炎免疫药物唧。实验一般使用雄性大鼠,致炎前给药,并在每只大鼠右后足跖皮内注射结核杆菌混悬液致炎,注射后每测量一次左右踝关节圆周,直至,然后以左右踝关节圆周差作为衡量关节初级损伤的指标,造模型后第开始观察并记录全身关节病变的严重程度、体重变化等。观察药物对多发性关节炎的预防作用,与佐剂注射后一周开始给药,每天一次,连续,如观察治疗作用,于佐剂注射后第开始给药,每天一次,连续。本模型稳定,较可靠,假阳性少【,值得注意的是模型的成败关键是皮内注射技术。大鼠棉球肉芽肿棉球注入大鼠体内后,可引起结缔组织增生,称为肉芽增生。使用乙醚将大鼠浅麻醉后,转移至无菌操作环境,沿着腹部切口,并用无菌小镊子将两个灭菌棉球分别植入大鼠的两侧腋窝部皮下,或大鼠两侧腹股沟皮下,经一周时间后可在该部位产生与慢性炎症相似的临床病理变化肉芽组织增生。另外,还可以使用角叉菜胶、琼脂、塑料环等制备大鼠肉芽肿模型。此模型属于慢性炎症模型,与临床上的某些炎症后期病理改变相似,是评定药物抑制炎症增殖作用的常用方法【。抗炎免疫药糖皮质激素目前用于治疗慢性炎症疾病的抗炎药物中,糖皮质激素是最有效的。合成的糖皮质激素如泼尼松龙或者地塞米松具有天然糖皮质激素的相似的能力。身体的损害,包括炎症、疼痛、感染甚至精神的打击导致激活下丘脑垂体肾上腺玎轴。作用于腺垂体诱导促肾上腺皮质激素的合成与释放,然后促肾上腺激素刺激肾上腺皮质释放糖皮质激素如可的松。糖皮质激素还是强效的内源性免疫抑制剂。西南交通大学硕士研究生学位论文第页环氧酶抑制剂已知非甾体抗炎药如阿司匹林、吲哚美辛、布洛芬,阻断合成,在人的镇痛和抗炎治疗中占据了重要的地位。昔布类选择性抑制剂,塞来昔布和罗非昔布是新型特异性药物,已用于关节炎和疼痛的控制。环氧酶抑制剂和拮抗剂修饰剂或者抗剂由抑制剂受体拮抗剂和组成,临床上用于长时程控制哮喘。是强效的炎症介质,在哮喘发病中起着重要的作用,药物可以通过调节它们的调节作用达到抗炎目的。尽管糖皮质激素是最强的抗炎剂,但它们不抑制在哮喘者气道的生成和释放,因此合成抑制剂或者,拮抗剂在哮喘治疗中可能会补充抗炎作用。受体拮抗剂虹受体拮抗剂能够有效抑制引起的各种生物效应,对哮喘、内毒素休克、植皮排异反应、急性休克以及急性胰腺炎等疾病有显著疗效。结构非类似物一银杏内酯,一类天然的虹受体拮抗剂,对烧伤、顺铂的肾毒性、多发性硬化症、关节炎有治疗作用,对败血性休克效果很好。细胞因子抑制剂核因子抑制剂:乙酰水杨酸和水杨酸钠可以抑制的激活:糖皮质激素和其他的内皮质激素是最广泛应用的抗炎免疫药物下调基因表达的功能与炎症有关抗炎作用的根子基础是抑制。类风湿性关节炎简介类风湿性关节炎,是一种慢性的,全身性的自身免疫性疾病。以关节滑膜炎为特征,其致病过程中伴随着多种免疫活性细胞的活化,并有西南交通大学硕士研究生学位论文第页细胞因子和炎症介质的共同参与。常伴随着各种炎症细胞的局部释放物,导致软骨和骨损伤,致残率高。类风湿关节炎在国内成人中的患病率约为左右,是风湿病学中国内外备受重视的一种疾病【】。该病患病人数众多,而且相当一部分患者如果治疗不当,骨关节就会遭到破坏、关节功能丧失,甚至导致残废等严重后果【捌】。是由疾病活动、关节损伤和残疾三位一体关联而定义的三者相互关系如图。在疾病活动中疼痛、肿胀、僵直代表有关的炎症过程,关节损伤体现了破坏性的疾病过程,残疾代表包括以生理功能降低和生活质量下降为特征的整个疾病过程。通过炎症细胞因子的直接测定和放射线进展的证明得到,疾病进程和关节损伤是相互关联的【的。一般情况下,易感人群的关节炎,最初是由环境因素触发,继而在细胞、细胞以及巨噬细胞的共同参与下,引发滑膜炎症反应。在致病抗原持续存在的情况下,可引起滑膜损伤和组织抗原的持续释放,导致自身抗原一抗体不断产生,各种细胞因子不断分泌,特别是在、、、等中心炎症因子的作用下,可形成恶性循环,最终导致慢性滑膜炎。的发病以相关基因为核心的、致病性内外抗原驱动的、多种免疫细胞参与。的自身免疫炎性反应,即基因~抗原一免疫细胞一细胞因子,形成的炎症链式反应【滑膜组织细胞的过度增生活化和凋亡不足,是使滑膜炎免疫反应得以继续的原因。现在还不能完全根治,而且会导致软骨和骨损伤。有研究表明,当暴露在吸烟、西南交通大学硕士研究生学位论文第页牙周炎等环境中时,包含共享抗原表位存在甩等位基因有遗传倾向的个体会患。病人常伴有其他并发症的危险,包括癌症感染和心血管疾病。患心血管疾病的几率是正常人的倍,而且心血管疾病的死亡率增加】。患者这一人群中患恶性肿瘤即淋巴癌和白血病、非黑色素皮肤癌和肺癌的几率在上升在病人身上的另一种常见疾病是脂代谢总量水平低下,即高密度脂蛋白和甘油三酯水平的上升,低密度脂蛋白和自由脂肪酸导致的动脉粥样硬化‘删。相关细胞因子类风湿性关节炎的致病原因及机理复杂,至今还不清楚具体的机制。的发病机制与多种因素有关,它涉及遗传因素、细胞凋亡、免疫反应、抗原、巨噬细胞、趋化因子、细胞因子如白细胞介素一等多种因素参与导致软骨和骨的降解,最终关节发生关节畸形和关节强直。尽管一致公认的发病与免疫系统密切相关,而且许多研究也证实细胞、细胞、巨噬细胞、滑膜细胞和许多的炎症因子,例如、、、等,它们在介导组织损伤和慢性炎症的持续反应中都起到了重要作用。但是的发生、迁延以及与上述因素的确切关系仍不确定。滑膜细胞、内膜巨噬细胞以及成纤维样滑膜细胞在滑液和关节组织中,能产生很多细胞因子和前致炎介质,例如几、、、、趋化因子、生长因子、激素、基质金属蛋白酶类、。这些对于炎症的开始起着至关重要的作用,也在病人的病理进程中起着重要的作用。】。炎症因子能激活多重信号通路,比如、和』删通路,这些又能最后激活核因子和。活化的随后进入炎症过程的反馈通路,通过上调多重基因的转录作用,包括、、、、和。这提示抑制过量表达和炎症因子的活性,随后炎症介质的生成减少,进而能改善状况,防止进一步的恶化制。中入侵细胞的生增殖可诱导局部的炎症,导致,旺一、和巨噬细胞源趋化因子的产生。这些炎症介质又能触发和的产生,这就进一步促进了的病理进程【。。一致公认的的一个特征是患者血清中几和盯呈高水平表达,几与在发病中共同起着重要的作用,它们可以刺激滑膜西南交通大学硕士研究生学位论文第页细胞和软骨细胞来合成胶原酶、,趋化、吸引炎性细胞进入关节滑膜,最终导致关节滑膜的持续性炎症反应它们还能破骨细胞活化因子,抑制糖蛋白的合成、加速氨基糖的降解,从而引起骨和软骨被吸收破坏。另外,还促进进纤维细胞的增生、加速血管增生和血管翳的形成,致使关节软骨和骨质被破坏,最终导致关节强直与又是同时合成和分泌的,两者以自分泌的方式而刺激巨噬细胞的产生,还能互相促进对方的合成,这说明和,师在的细胞因子网络中起着中心作用。损伤部位产生的可刺激血管内皮细胞合成、表达而可通过诱导黏附分子,如细胞间黏附分子增加白细胞黏附。同时,几可诱导和的产生。另外,可以通过激活环氧酶促进产生。体外实验证明,人类滑膜中的纤维母细胞在体外培养时无产生。当加入几、【、等细胞因子后可活化其中的,产生大量的。滑膜中,过量表达的可引起滑膜组织损伤和血管的扩张在损伤滑膜组织的同时,将其中的血管壁也一起损伤,这样就使得血管壁的通透性增大而引起渗出,导致了滑膜肿胀、滑膜充血及关节内的白细胞渗出所形成的关节积液【引。同时,巨噬细胞及中性粒细胞由血液进入组织中,可释放出活性细胞介质如,它们也能损伤滑膜,引起滑膜炎症产丹。细胞和调控细胞在免疫系统中是很重要的,在不同的慢性炎症疾病中,也被证明是一个主要的促炎途径【。主要由细胞和其他细胞类型产生,包括骨髓细胞、上皮细胞和纤维母细胞。几能诱导和参与炎症反应,导致关节僵直、疼痛和肿胀等炎症【】。几产生的辅助细胞,是一种有效的淋巴细胞,在不同的慢性炎症疾病关节炎和牛皮癣关节炎中扮演着重要的角色。从基因观点来说,细胞能促进自身免疫,然而调控能保护自身免疫疾病的发生。在中,细胞通过分泌发挥中心作用,几能激活很多关于发病机理的很多细胞类型,包括滑膜成纤维细胞、单核白细胞、巨噬细胞、软骨细胞和成骨细胞。另外,和前致炎因子的产生是相关的,例如、、。通过阻碍通路进而抑制信号,或者是敲除基因,能显著提高实验动物的关节炎免疫水平【】。药物治疗目前的发病机制还不清楚,治疗尚无特效疗法。早期诊断、选用高效低毒的药物,以及选择有效合理的治疗方案,是改善患者症状、减少致残率的重要措施。超西南交通大学硕士研究生学位论文第页声波可以通过检查腱鞘炎来有效的监控类风湿性关节炎病人的早期疾病活动。肌肉骨骼超声对疾病活动诊断分析和评估是非常有用的,利用法进行风湿类疾病的检测,已经广泛应用于西方国家和日本。因为相比临床检查来鉴定类风湿性关节炎病人的关节损伤,更敏感、更可靠。使用检查患者,可以发现患者经常会伴有滑膜炎、腱鞘炎和骨侵蚀这些主要的关节损伤【】当然需要优先考虑病人的疼痛,有时抗抑郁药物用作辅助药物,来增加一些安慰,帮助睡眠,减少抑郁。对于的治疗分为非药物治疗、药物治疗主要有非甾体类抗炎药、改变病情抗风湿药、糖皮质激素和最新的生物制剂等、外科手术治疗以及干细胞移植等。其中以能够改变病理变化,减少骨质破坏的的应用最为重要。目前,国内外临床应用的各种药物还不能做到完全控制和阻止关节的破坏,仅仅是缓解疼痛、减轻关节症状或延缓炎症的发展。治疗的常用药物有非甾体抗炎药佃、改善病情用抗风湿药趾、糖皮质激素、生物制剂等。非甾体抗炎药物是治疗的一线药物,具有良好的抗炎与镇痛作用,主要是通过抑制环氧化酶的活性,进而阻止前列腺素和一些相关的炎症介质的合成而起到消炎止痛作用。但是,可能会引起某些不良反应,如引起胃肠道副作用,少数有肾脏损害、骨髓抑制、精神障碍等,这限制了其应用。:塞来昔布,是批准的第一个选择性环氧酶抑制药,对受体的选择作用比受体强倍。使用的治疗量时,不会抑制,所以可将用于缓解的各种不适和症状。:美洛昔康,为选择性抑制剂,可作为忌用患者的替补治疗。对缓解症状、关节肿痛、关节功能、骨破坏、关节僵直和关节功能等均有较良好的效果。适用于治疗类风湿性关节炎、关节炎、肌扭伤、劳伤、半月板手术、矫形外科和口腔外科等引起的中度疼痛。西南交通大学硕士研究生学位论文第页慢作用抗风湿药慢作用抗风湿药或称改变病情药是的二线治疗药物。本类药物起效时间长于,作用于类风湿性关节炎病程中的不同免疫组分,其中部分属免疫抑制剂,可能会效控制病情的进展。包括抗疟药、金制剂、青霉胺、柳氮磺胺吡啶和细胞毒类药物如硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、环孢素、环磷酰胺等】。糖皮质激素糖皮质激素是的三线治疗药物,是目前最强的抗炎药物,但不能阻断的病程进展和关节破坏,可以迅速有效地减轻炎症。主要抗炎作用是下调炎症细胞因子和等及抑制白细胞的游走。糖皮质激素适用于有关节外症状或关节炎明显,但有一定的副作用。小剂量、短疗程、早期的应用可通过抗炎、抗过敏作用来减轻症状【蚴。植物药一些治疗的单味或者复方成品制剂,临床实验结果显示对治疗有一定疗效,但是这些制剂否能改善病情或者阻止疾病的发展还需要进一步的考察。由雷公藤多甙片和醋酸乙酯提取物而制备的雷公藤制剂,对生殖系统有一定的毒副作用,因此一般多用于老年患者正清风痛宁通过提取青风藤的有效成份盐酸青藤碱研制而成,其中青藤碱具有镇痛、消炎、免疫调节作用,且毒副作用小:白芍总甙帕夫林是从中药白芍中提取的甙类物质,具有抗炎和双向免疫调节的左右。安全的生物制剂目前已经批准通过治疗生物制剂,包括:抑制剂比如,,和、受体拮抗剂、受体抑制剂、细胞共刺激通路选择性抑制剂、细胞直接作用产生的单克隆抗体,这为传统抗风湿类药物不能有效缓解病情的患者提供了更有效地选择性治疗方法。但是事实上,这些药物是已经引起安全关注的免疫调节剂,需要认真评估临床试验,并加强上市后监测。因为病人可能诱发潜在的肺结核、乙肝或者丙肝或者机会性感染】。西南交通大学硕士研究生学位论文第页抗盯抗体是一种前致炎因子,抑制是治疗的一个主要方法,因为在患者的关节中的高水平表达。在细胞因子中有着重要的作用,刺激其他细胞因子的产生,进而产生免疫作用,导致炎症细胞进入关节。抗抗体和可溶性受体在制备类风湿性关节炎的临床研究中显示出惊人的抗炎潜力。:依那西普,是一种可溶性【受体,通过抑制活性来调节炎症反应过程。将编码人,师受体可溶性部分的与编码段分子的连接,然后在哺乳动物细胞中来表达融合蛋白。这种融合蛋白对师【的亲合

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