2 x Sybr Green qPCR Mix
使 用 说 明 书
包 装 量：
产品组成、储存、浓度：
储存：－20 ℃ 避光保存至少 6 个月，使用前充分融解混匀。短期使用可放在 4 ℃，避免反复冻融。
制品说明：本制品本制品是采用 SYBR® Green I 嵌合荧光法进行 Real Time PCR 的专用试剂。已经将热启动 HotMaster Taq DNA
聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液、BSA 和 SYBR® Green I 等试剂预混成一种适合 Real Time PCR 反
应检测用 2×Premix Type 试剂，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。使用时只需加入
模板
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和引物和水，便可
在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对目的基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。本品采用全新的
Hotmaster Taq DNA 聚合酶，该酶不同于一般 Hot-start 酶之处在于，一般的 Hot-start 酶只在第一步温度升高之前封
闭酶的活性，而 Hotmaster Taq DNA 聚合酶是利用抑制剂通过温度调节方式封闭 Hotmaster Taq DNA 聚合酶的底物结
合位点，温度低于 40℃时，形成非活性的酶-抑制剂复合物，当温度升高至引物特异性的退火温度时，结合平衡向模
板-特异性引物复合物形成方向移动，因此最大限度的减少 PCR 扩增全程中的非特异性扩增产物产生，大大提高了荧
光定量 PCR 反应的精确性。
注意事项：
1. 本制品不含参比染料ROX，客户并根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加ROX参比染料，用于消除信号本底以及校正孔与孔
之间产生的荧光信号误差，配套ROX产品货号为1538 Rox Reference Dye。
2. 本制品含SYBR® Green I 强光下易分解，降低敏感度，使用时避免长时间强光照射本制品。
3. 建议在冰上配制PCR反应液，再放入PCR仪器中扩增。可以提高扩增特异性，减少背景。
4. 本制品含有4 mM MgCl2（反应体系终浓度是2 mM Mg
2+），可用25mM MgCl2 优化Mg
2+浓度。
建议PCR条件(以50 μl反应体系为例，反应液配制请在冰上进行)
Components Volume Final Concentration
2 x SYBR qPCR Mix 25 μl 1×
DNA Template 2 μl as required
Forward Primer (10 μM) 1 μl 0.2 μM each
Reverse Primer (10 μM) 1 μl 0.2 μM each
ddH2O to final volume 50 μl Not applicable
目录编号 包装单位
153301 50次
153302 200次
组成 153301 153302
2 x SYBR qPCR Mix 1.25 ml 1.25 ml x 4
PCR 循环（三步法）
94℃ 2-3 min
94℃10-20 sec
55-65℃ 10-20 sec 35-45 cycles
72℃ 20-60 sec
72℃5-10 min
荧光定量 PCR 实验常见问题和解决
方案
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A1: 无信号值出现
Q1：
1. 反应循环数不够。一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至 45cycles），但高于 45 个循环会增加过多的背
景信号。
2. 检测荧光信号的步骤有误。一般 SG 法采用 72℃延伸时采集，Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
3. 引物或探针降解。可通过 PAGE 电泳检测其完整性。
4. 引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
5. 模板量不足。对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
6. 模板降解。避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
A2: CT 值出现过晚
Q2：
1. 扩增效率低，反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
2. PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足。
3. PCR 产物太长。一般采用 80-150bp 的产物长度。
A3: 标准曲线的线性关系不佳
Q3：
1. 加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
2. 标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
3. 引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针。
4. 模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
典型扩增曲线和融链曲线图
扩增曲线 融链曲线
浙公网安备 33021202002483