荚膜红假单胞菌产类胡萝卜素的培养基优化实验*
摘要对荚膜红假单胞菌产类胡萝卜素的培养基组成进行优化研究,结果
表
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明,荚膜红假单胞菌产类胡萝卜素的最优培养基组成为:柠檬酸钠319 g、NH4Cl 014 g、KH2PO41136 g、酵母膏011 g、无水MgSO4013 g、FeSO49mg、蒸馏水1 000 mL,pH 714。该配方在30e,500 lx光照下,类胡萝卜素的产量为1107 mg/g菌体湿重,较优化前产量的0145 mg/g(菌体湿重)提高了1倍多,而培养基成分减少了6种。
关键词光合细菌,培养基,优化,类胡萝卜素
类胡萝卜素(carotenoids)是四萜类化合物,普遍存在于动
物、植物、真菌、藻类和细菌中,含有呈黄色、橙红色或红色的
色素。除可预防VA缺乏症外,还具有抗癌、抗心血管病、抗白
内障等功能[1]。目前已被国际权威机构FAO和WHO等国
际组织认定为A类营养色素,并在50多个国家和地区获准作
为营养、着色双重功能的食品添加剂。
近年来,采用微生物发酵提取类胡萝卜素的研究已经有
一些报道,比如红酵母、三孢布拉式霉菌、胶质红假单胞菌等。
但是对荚膜红假单胞菌产类胡萝卜素的研究,国内未见报道。
文中以荚膜红假单胞菌为材料,以经典的培养基为基础,
研究培养基组成对菌体生长和类胡萝卜素产量的影响,进行培
养基优化实验,为光合细菌类胡萝卜素色素研制做基础工作。
1 材料与
方法
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111 光合细菌
荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsulatus),本研究
室选育保存菌种。
112 光合细菌全成分培养基
乙酸钠310 g,NaCl 110 g,(NH4)2SO4013 g,MgSO4012
g,CaCl250 mg,酵母膏011 g,MgSO4215 mg,蛋白胨10 mg,
KH2PO4015 g,K2HPO4013 g,FeSO45 mg,谷氨酸012 mg,蒸
馏水1 000 mL,pH 714。
113 主要仪器设备
JY92-2D超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有
限公司)、BECKMAN Allegra 64R高速冷冻离心机、岛津UV-
1700全波长扫描仪、SP-1105型紫外可见光分光光度计(上海
光谱仪器有限公司)、生化培养箱(广东省医疗器械厂)、Model
JD)3光强测定仪(上海市嘉定学联仪表厂)、奥立龙Model
868 pH计。
114 光合细菌培养方法
将保藏菌种接入液体培养基,在(30?015)e,500 lx下
静置培养30h,然后以10%的接种量将菌液移接到装有200
mL发酵培养基的三角瓶中,同上述条件培养。实验中采用稳
压电源来减少光照强度的波动。
115 培养基优化方法
以光合细菌全成分培养基为基础,通过固定其他成分,分
别改变培养基中的碳源、氮源等形成新的配方,并采用正交设
计等
方案
气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载
研究新培养基对菌体生长( OD660 nm)和色素生成
(OD484 nm)的影响。
116 类胡萝卜素的提取
光合细菌发酵液在4 800 r/min下离心15 min,去掉上清
液后用生理盐水洗涤菌体并再次离心,反复3次,得湿菌体。
湿菌体中加入体积比为8B1的丙酮、甲醇溶液,采用超声波法
破碎细胞(破碎功率200 W,时间8 min)。破碎液放置1 h后
在9 000 r/min下离心10 min得粗提取液。向其中加入等体
积的10%的NaOH-甲醇溶液,混和液在分液漏斗中摇匀并静
置皂化2~3 min,然后继续加入跟粗提取液等体积的石油醚
溶剂,振荡并静置1 min后弃去下层溶液,蒸馏水冲洗石油醚
层,直至清亮为止,得到纯类胡萝卜素的石油醚溶液。
117 类胡萝卜素鉴定
硫酸显色反应[2]:将纯色素的CH3Cl溶液倒入装有浓
H2SO4的试管中,在两相交接处观察颜色的变化。
118 类胡萝卜素含量计算[3]
类胡萝卜素提取液没有浑浊且在没有其他非类胡萝卜素
色素的干扰下,其大致含量可以使用下列公式计算:
总胡萝卜素含量(mg)=光密度值(最大吸收峰的波长下
的OD值)@总体积(mL)@稀释倍数@10A2500
2 结果与讨论
211 荚膜红假单胞菌类胡萝卜素的提取及鉴定
21111 荚膜红假单胞菌菌体生长与色素生成曲线
以全成分培养基为基础,测定荚膜红假单胞菌菌体生长
(OD660nm)和色素生成(OD484nm)的曲线。结果(图1)表明,菌
体生长与色素生成呈同步关系。为此,后续的研究多采用色
素OD484 nm曲线进行探讨。
21112 类胡萝卜素的鉴定
将提取到色素的石油醚溶液倾入装有浓H2SO4的试管
中,两相交接处呈现蓝色,说明有类胡萝卜素存在。
212 荚膜红假单胞菌产类胡萝卜素的培养基优化
类胡萝卜素发酵是一个复杂的生理生化过程,不同的培
养条件(如温度、培养基成分、pH、通气量等)直接影响菌体代
谢,从而影响类胡萝卜素产量[6]。本文仅从培养基方面对荚
研究简报
2005年第31卷第5期(总第209期)167 图1 菌体生长与色素变化曲线膜红假单胞菌产类胡萝卜素的条件进行优化。
21211 单一碳源
分别以蔗糖、乳糖、柠檬酸钠、草酸钠代替全成分培养基
中的乙酸钠,添加量为013%,研究不同碳源对类胡萝卜素产
量(OD484nm)的影响,所得结果见图2。
图2 单一碳源对类胡萝卜素产量的影响
由图2可以看出,柠檬酸钠做碳源产色素最多,醋酸钠次
之,乳糖做色素较低,草酸钠和蔗糖则更差。
213 不同氮源对荚膜红假单胞菌生长和类胡萝卜素积累的
影响
分别以( NH4)2HPO4、NH4H2PO4、谷氨酸、NH4Cl、
NH4NO3、蛋白胨代替全成分中的(NH4)2SO4(添加量为
0103%)进行实验。从结果(图3)可以看出,(NH4)2SO4、
(NH4)2HPO4和NH4Cl均是荚膜红假单胞菌生长和产色素的
较好氮源,但NH4Cl较优于其他2种。
图3 不同氮源对荚膜红假单胞菌产类胡萝卜素的影响
214 生长因子和无机盐的优化
21411 生长因子的优化
以全成分培养基为基础,探讨培养基中的谷氨酸、酵母
膏、蛋白胨的存在与否对菌体产色素的影响,结果如表1。由
实验结果可知,培养基中无谷氨酸、蛋白胨时,色素的产量较
高,但培养基中无酵母膏时色素的产量下降。这表明酵母膏
是必需的生长因子。
表1 生长因子对荚膜红假单胞菌菌体生长
和色素生成的影响
培养基的生长因子OD484 nm
(类胡萝卜素产量)
OD660 nm
(菌体量)
全成分培养基21244 11492
全成分培养基去谷氨酸21516 11658
全成分培养基去酵母膏21228 11451
全成分培养基去蛋白胨21522 11680
21412 无机盐的优化
在上述研究的基础上,以每升蒸馏水中加入柠檬酸钠
310 g、NH4Cl 013 g、酵母膏011 g、NaCl 110 g、MgSO4012 g、CaCl250 mg、MnSO4215 mg、KH2PO4015 g、KH2PO4013 g、
FeSO45 mg为配方进行实验,继续优化培养基中无机盐。
2141211 NaCl的影响
去除上述培养基中NaCl进行实验,结果(表2)表明NaCl
对类胡萝卜素产量影响不大。
表2 NaCl对类胡萝卜素生成的影响
湿重/g#L-1OD484nm
有NaCl 4109 11266
无NaCl 3173 11152
2141212 Fe2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+的影响
根据文献报道[8], Ca2+、Mg2+、Fe2+等对光合细菌的菌
体生长和色素生成的影响较大,为此,试验中研究了Fe2+、
Ca2+、Mg2+、Mn2+几种离子的量对光合细菌产色素的影响,
结果见图4~图7。从实验结果可以知道,Ca2+和Mn2+对菌体起
到了抑制作用。而Fe2+和Mg2+均存在最适浓度,经过实验初步
获得Fe2+为3124@10-5mol/L、Mg2+为3132@10-3mol/L,高于
或低于此浓度时,类胡萝卜素的生成量都会下降。
图4 Fe2+对色素生成的影响
2141213 K、P元素
以上面优化的培养基,即在每升蒸馏水中加入柠檬酸钠
食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
168 2005 Vol.31 No.5 (Total 209)图5 Mg2+对色素生成的影响图6 Mn2+对色素生成的影响
图7 Ca2+对色素生成的影响
310 g,NH4Cl 013 g,MgSO4014 g,酵母膏011 g,KH2PO4015
g,K2HPO4013 g,FeSO49 mg为1号培养基;去掉KH2PO4、
K2HPO4为2号培养基;去掉KH2PO4、K2HPO4后加入0168
g/L的KH2PO4为3号培养基;去掉KH2PO4、K2HPO4后加入
0168 g/L的KH2PO4以及011 g/L的KCl为4号培养基;去
掉KH2PO4、K2HPO4后加入0185 g/L的KH2PO4为5号培养
基进行实验。结果(表3)表明,培养基中加入0185 g/L的
KH2PO4(5号实验)与加入015 g/L的KH2PO4和013 g/L的
K2HPO4(1号实验)效果相当。
表3 K、P元素对荚膜红假单胞菌菌体生长
和色素生成的影响
项目培养基
1号2号3号4号5号
OD660 nm11342 11248 11252 11216 11346
OD484 nm21428 21260 21316 21260 21422
最终pH 8155 8175 8147 8152 8162
215 正交实验
21511 正交实验
设计
领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计
与
分析
定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析
根据单因素实验的结果,设计了3水平4因素的正交分
析表[9](如表4),实验结果如表5。由表5得最佳培养基为
A1B1C1D1,即最佳培养基为:柠檬酸钠319 g,NH4Cl 014 g, MgSO4013 g,酵母膏011 g,KH2PO41136 g,FeSO49 mg,蒸馏
水1 000 mL,pH 714。
表4 正交实验因素分析表
水平因素
A(柠檬酸钠)/g B(NH4Cl) /g C(K2HPO4)/g D(MgSO4)/g
1 319 014 1136 013
2 310 01
3 0185 014
3 211 012 013
4 015
表5 正交实验方案及结果
实验号A
(柠檬酸钠)/g
B
(NH4Cl)/g
C
(KH2PO4)/g
D
(MgSO4)/g
第1次结果
(OD484nm)
第2次结果
(OD484nm)合计
1 1(319) 1(014) 1(1136) 1(013) 31284 31326 61610
2 1 2(013) 2(0185) 2(014) 31124 31014 61138
3 1 3(012) 3(0134) 3(015) 2131
4 21374 41688
4 2(310) 1 2 3 21590 21734 51324
5 2 2 3 1 21554 2144
6 51000
6 2 3 1 2 21491 21502 41993
7 3(211) 1 3 2 21258 21274 41532
8 3 2 1 3 21262 21342 41604
9 3 3 2 1 21047 11986 41033
K1171436 161466 161207 151643
K2151317 151742 151495 151663
K3131169 131714 141220 141616
从表6可看出,4个因素(A、B、C、D)对实验结果影响均特别显著。
21512 验证实验
对优化后的培养基配方(每升蒸馏水中含柠檬酸钠319
g、NH4Cl 014 g、KH2PO41136 g、酵母膏011 g、无水MgSO4 013 g、FeSO49 mg,pH 714)进行验证实验,并与全成分培养基进行比较,结果见图8。
研究简报
2005年第31卷第5期(总第209期)169 表6 方差分析表
方差来源平方和自由度方差F显著性
A 11517 2 01759 2261230 **
B 01678 2 01339 1011144 **
C 01338 2 01169 501369 **
D 01120 2 01060 171820 **
误差01030 9 01003
总和21683 17
其中F0105(2,9)= 4126 ,F0101(2,9)=8102
图8 优化培养基的色素生成曲线
图9 色素的吸收光谱
含色素的石油醚溶液经过分光光度计扫描(300 ~
900nm),结果(图9)表明,色素在482 nm处有最大吸收波峰, 根据文献报道[4],该色素可能为番茄红素或玫红品。从图9 还可以看出,叶绿素a的吸收峰[5](375,590,805,830~890)