天然药物化学实验

天然药物化学实验 实验一 大黄中蒽醌苷元的提取、分离与鉴别 一、实验目的 1.掌握从大黄中提取和分离游离蒽醌的方法。 2.掌握用pH梯度萃取法分离不同酸性的羟基蒽醌类化合物。 3.掌握蒽醌类化合物的主要检识方法。 4.熟悉蒽醌类化合物的色谱检识方法。 5.了解用柱色谱法分离蒽醌类成分。 二、实验原理 1.大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄R.tanguticum Maxim. ex Baill.的干燥根及根茎。大黄中含有大黄蒽醌及其苷。 Reg.和药用大黄R. officinale (1)大黄酸(rhein) 分子式CHO，分子量284.21。黄色针状结晶(升华法)，mp.321,1586 322?，330?分解。能溶于碱水、吡啶，溶于乙醇、氯仿、乙醚和石油醚，几不溶于水。 (2)大黄素(emodin) 分子式CHO，分子量270.23。橙色针状结晶(乙醇)，mp.256,15105 257?，能升华。易溶于乙醇、碱水，微溶于乙醚、氯仿，几不溶于水。 (3)芦荟大黄素(aloe-emodin) 分子式CHO，分子量270.23。橙色针状结晶(甲16105 苯)，mp.223,224?。易溶于热乙醇，可溶于乙醚和苯，并呈黄色;溶于碱液呈红色;氨水及硫酸中呈绯红色。 (4)大黄酚(chrysophanol) 分子式CHO，分子量254.23。橙黄色六方形或单斜15104 结晶(乙醇或苯)，mp.196,197?，能升华。易溶于沸乙醇，可溶于丙酮、氯仿、苯、乙醚和冰醋酸，极微溶于石油醚、冷乙醇，几不溶于水。 (5)大黄素甲醚(physcion) 分子式CHO，分子量284.26。砖红色单斜针状结晶，16125 mp.203,207?，溶于苯、氯仿、吡啶及甲苯，微溶于醋酸及醋酸乙酯，不溶于甲醇、乙醇、乙醚和丙酮。 大黄酚 R=CH R=H OHOOH132 大黄素 R=CH R=OH 132 大黄酸 R=COOH R=H 12 大黄素甲醚 R=CH R=OCH 1323R2R1芦荟大黄素 R=CHOH R=H 122O 2.本实验是根据大黄中的羟基蒽醌苷经酸水解成游离羟基蒽醌，而游离羟基蒽醌不溶于水，可溶于氯仿、乙醚等亲脂性有机溶剂的性质，用氯仿从水解液中将游离羟基蒽醌提取出来，再利用各游离羟基蒽醌的酸性不同，采用pH梯度萃取法将其分离。其中大黄酚和大黄素甲醚的酸性十分近似，用pH梯度萃取法难以分离，可利用两者的极性不同，采 用硅胶柱色谱法进行分离。 三、实验仪器与试剂 1.索氏提取器，500、100、10ml烧杯，1000、500ml分液漏斗，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，水浴锅，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯(仪)，玻棒，牛骨匙，脱脂棉，显色剂喷瓶，小型空压机，层析柱(Ф1.5cm) 60,90?)，氯仿，20,硫酸，pH82.大黄粗粉，滤纸，pH试纸，乙酸乙酯，石油醚( 缓冲液，pH9.9缓冲液，浓盐酸，5,碳酸钠，5,氢氧化钠，丙酮，10,氢氧化钠，0.5%醋酸镁乙醇试剂，薄层用硅胶H，0.2%CMC-Na，甲醇，大黄酸、大黄素、芦荟大黄素对照品，展开剂:石油醚(30,60?)-乙酸乙酯-甲酸(15?5?1)上层溶液，浓氨水。 四、实验步骤 1. 提取与分离 大黄粗粉100g 加20,硫酸200ml，300ml， 加氯仿500ml，回流3h，稍冷，过滤 氯仿提取液 药渣 水洗余酸至中性 氯仿提取液 (1)加pH8缓冲液150ml萃取或(2)5%碳酸氢钠溶液萃取数次 碱水液 氯仿提取液 20%盐酸调pH3，静置，滤过 (1)加pH9.9缓冲液300ml萃取或(2)5%碳酸钠溶液萃取数次 沉淀(水洗至中性) 冰醋酸精制 氯仿提取液 碱水层 大黄酸 (1)5,碳酸钠 (2)0.25,氢氧化钠 20%盐酸调pH3，滤过 -5,氢氧化钠 萃取数次 沉淀 (9?1)540ml萃取 丙酮精制 大黄素 氯仿提取液 碱水层 5,氢氧化钠200ml分两次萃取 20%盐酸调pH3，滤过 沉淀 碱水层 氯仿提取液 醋酸乙酯精制 20%盐酸调pH3，滤过 芦荟大黄素 沉淀 硅胶柱色谱 大黄酚 大黄素甲醚 2(检识 (1)碱液试验 分别取各蒽醌化合物结晶少许，置试管中，加1ml乙醇溶解，加数滴10,氢氧化钠试剂振摇，观察颜色变化，羟基蒽醌应显红色。 (2)乙酸镁试验 分别取各蒽醌化合物结晶少许，置试管中，加1ml乙醇溶解，加数滴0.5,乙酸镁乙醇试剂，观察颜色变化，羟基蒽醌应显橙、红、紫等颜色。 (3)薄层色谱检识 薄层板:硅胶H-CMC-Na 试 样:自制大黄酸、大黄素、芦荟大黄素的乙醇溶液。 对照品:上述各成分对照品乙醇溶液(约1mg/ml)。 展开剂:石油醚(30,60?)-乙酸乙酯-甲酸(15?5?1)上层溶液。 显 色:在可见光下观察，记录黄色斑点的位置。然后再用浓氨水熏蒸或喷雾5,乙酸镁甲醇溶液，斑点应显红色。 五、基本操作注意事项 1.大黄中蒽醌类化合物的种类、含量与大黄的品种、采集季节、炮制方法及贮存时间均有关系，实验用药材应注意。 2.为了验证分离所采用的萃取液是否合理，作如下缓冲纸色谱试验:取层析滤纸3 cm×12 cm，距下端2 cm处划一起始线，向上每隔1.5 cm划一平行线，在各条带上依pH由低至高顺次涂布实际所用的各缓冲液及碱液，涂布完后，将湿滤纸夹在两片干滤纸中吸至半干。取样品总蒽醌苷元氯仿提取液点在起始线上，用氯仿上行展开，将结果绘制在下面图中，并确定选择的萃取剂是否合理。 3.pH梯度萃取法分离羟基蒽醌，是利用羟基蒽醌的酸性不同，可溶于不同pH的碱液中，在分离时，应注意萃取的次数不宜过多，否则被分离的成分间回游混杂，最好同时用薄层对照。所用碱液的pH值分别如下:5%碳酸氢钠为8，5%碳酸钠为10-11，0.5%氢氧化钠为12以上。一般萃取大黄酸用pH7,8范围的，萃取大黄素用pH9.5,11范围的。 4.若用缓冲液进行萃取时，采用一次性加入的方法，实验证明，如将缓冲液分次萃取，分离效果不理想。 5.本实验也适应于以虎杖为原料的提取，但虎杖中不含大黄酸，故直接由大黄素开始分离。 6.硅胶柱色谱分离大黄酚及大黄素甲醚 装柱:用石油醚,乙酸乙酯(9.8:0.2)浸泡200,300目硅胶约20 g，搅拌均匀，尽量赶出气泡。一次性倒入1.8 cm * 28 cm 的层析柱中，轻轻敲打使硅胶均匀下沉，至硅 胶界面不再下降为止。 上样:将离大黄酚和大黄素-6-甲醚的混合物用乙醇加热溶解，伴入少量硅胶，水浴60?左右烘干，加到已装好的硅胶柱顶端，最后在样品带上盖上一层硅胶或棉花，以保护样品界面不受干扰。 洗脱:先用100 ml石油醚,乙酸乙酯(9.8:0.2)洗脱，至第一条黄色色带洗下来，再换用100 ml石油醚,乙酸乙酯(9.5:0.5)洗脱下第二条色带。先洗脱下的化合物为大 CMC-Na板，氯仿,醋酸乙酯(8?黄酚，后洗脱下的化合物为大黄素甲醚。各流分经硅胶- 2)展开，用大黄酚和大黄素甲醚作对照，合并斑点相同流分，分别浓缩、放置析晶，即可获得大黄酚及大黄素甲醚。 六、思考题 一、大黄游离蒽醌的提取分离方法还有哪，同时注意实验成本、仪器、安全、环保等多因素思考。 二、(1)大黄中5种羟基蒽醌化合物的酸性和极性大小应如何排列,为什么, (2)pH梯度萃取法的原理是什么,适用于哪些中药成分的分离, (3)蒽醌类化合物及其苷的薄层色谱用什么作吸附剂、展开剂和显色剂, (4)蒽醌类与乙酸镁显色反应的必要条件是什么,其颜色反应与羟基所在的位置 有何关系,