钠钾 ATP酶的信号转导功能新进展
文玉杰 李晓玫 (北京大学第一医院肾脏内科 北京大学肾脏病研究所 ,北京 100034)
摘要 钠钾 ATP酶不仅是主动跨膜转运钠钾离子的载体蛋白 ,而且可能作为内源性洋地黄物质的
受体参与信号转导。它通过在质膜上与小窝蛋白、Src激酶之间的相互作用 ,并在细胞内借助 Src
激酶反式激活上皮生长因子受体 ,组装信号转导的复合物激活信号转导的级联反应 ,从而介导内源
性洋地黄物质增加心脏和血管的收缩性、促进正常细胞肥大或增殖、促进肿瘤细胞的凋亡等作用。
研究内源性洋地黄物质与钠钾 ATP酶结合后激活的信号转导通路将有助于明确它在病理生理条
件下的重要性 ,有可能为治疗高血压和肿瘤提供新思路 ,并深化对细胞内信号转导机制的认识。
关键词 钠钾 ATP酶 ;内源性洋地黄物质 ;信号转导
中图分类号 Q257
钠钾 ATP酶 ,或称钠泵、钠钾离子激活的腺苷 2
5’2三磷酸酶 ,其酶分类命名为 EC 3. 6. 1. 37,存在于
大多数动物细胞的细胞质膜中。近十几年来的研究
发现 :钠钾 ATP酶不仅是主动跨膜转运钠钾离子的
载体蛋白 ,而且可能作为内源性洋地黄物质的受体 ,
通过在质膜上与邻近蛋白之间的相互作用 ,并在细
胞内组装信号转导的复合物 ,引发信号转导的级联
反应 ,从而介导内源性洋地黄物质增加心脏和血管
的收缩性 ,促进正常细胞肥大或增殖 ,促进肿瘤细胞
的凋亡等效应。本文复习近年来研究钠钾 ATP酶
的有关文献 ,并重点综述其在细胞内信号转导中作
用的研究进展。
一、钠钾 ATP酶和内源性洋地黄物质
1941年 Dean观察到肌细胞能够交换加入到培
养环境中的放射性标记的钠离子 ,因此提出动物细
胞存在逆电化学梯度主动转运离子的一种机制 ,将
其称为钠泵。1957 年 Skou证实钠泵是一种 ATP
酶 ,并因此获得 1997年诺贝尔化学奖。目前认为 ,
钠钾 ATP酶不仅是一种存在于细胞质膜上的载体
蛋白 ,也是一种 P2 型 ATP酶 ,它通过水解 ATP、释
放 ADP,并把 ATP末端磷酸基团转移到该酶本身活
性部位的天冬氨酸残基上 ,从而磷酸化自身改变蛋
白构型 ,实现把 3个钠离子的胞外转运与 2个钾离
子的胞内转运的偶联。通常钠钾 ATP酶是由起催
化作用的α亚基和起调节作用的β亚基组成的一
个低聚体 (大多数情况下是一个非对称的四聚体 ) ,
由 2到 4个αβ亚基原体 ( p rotomer)组成。其中α
亚基有α1、α2、α3 亚型 ,分子量依亚型的不同可为
110~113 kD ,它有 10个跨膜结构域 (M1 到 M10 ) ,
并且氨基端和羧基端都位于细胞内 ,主要参与 ATP
的催化 ,其胞外部分具有哇巴因 (ouabain)的特异性
结合位点 ;β亚基是一个分子量近 60 kDa的高度糖
基化质膜蛋白 ,有β1、β2、β3 亚型 ,其蛋白部分的分
子量依亚型的不同可为 36~38 kD ,其蛋白仅跨膜
一次 ,氨基端在细胞内 ,主要参与帮助 α亚基正确
的折叠并从内质网转运到质膜 ,在质膜上稳定α亚
基蛋白构型和调节α亚基的活性。此外 ,在某些组
织如在肾小管各节段 ,钠钾 ATP酶是由α、β、γ亚基
组成。γ亚基属于 Ⅰ型膜蛋白 ,它可能通过与α亚
基羧基末端相互作用 ,调节钠钾 ATP酶与 ATP、钠
钾离子的亲和力 [ 1 ]。目前钠钾 ATP酶的主要功能
已得到研究者共识 ,包括维持动物细胞的膜电位和
细胞内外的渗透压平衡 ,为细胞转运无机离子和营
养物质及排出代谢产物提供驱动力等作用。
强心甙类药物包括地高辛、哇巴因和其他类毛
地黄化合物 ,属于强心烯羟内酯 ,均是源于自然界的
外源性钠钾 ATP酶抑制剂。它们均可与钠钾 ATP
酶α亚基哇巴因特异性位点可逆性的结合 ,抑制钠
钾 ATP酶活性。1885年 R inger提出哺乳动物体内
可能存在内源性洋地黄物质 ( endogenous digoxin2
like substances, EDLS) ,以后的大量实验
证明
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人体内
确实存在 EDLS,主要包括哇巴因、二羟蟾毒二烯酸
内脂 (Bufalin)、海蟾蜍毒素 (marinobufagenin)等 ,其
分泌部位是肾上腺和下丘脑 ,胆固醇是其产生的主
要前体物质。EDLS的产生和分泌受到多种生理和
病理因素的影响 ,在血管紧张素 Ⅱ、肾上腺素或促肾
上腺皮质激素的刺激、缺氧、应激、盐摄入增加、妊娠
和围产期等情况下其产生和分泌增加。而且体外实
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验提示上述病理生理条件下产生的部分抑制钠钾
ATP酶活性浓度的 EDLS,不足以引起细胞内离子浓
度的改变 ,却可以在体外引起正常细胞增殖或肥大 ,
促进肿瘤细胞的凋亡。并且 ,研究人员观察到 :在
人、大鼠、小鼠血管平滑肌细胞 ,引起细胞增殖的哇
巴因的剂量呈三个数量级的递减关系 ,这和哇巴因
与上述三个种属血管平滑肌细胞钠钾 ATP酶α1 亚
单位的亲和力呈三个数量级的递增关系正好相反 ,
进一步提示钠钾 ATP酶α1 亚单位是哇巴因引起上
述效应的结合位点 [ 2 ]。因此不少学者推测并开始
验证 EDLS结合钠钾 ATP酶是否可以不依赖于钠泵
功能进一步产生第二信使转导 EDLS信号。
二、钠钾 ATP酶的信号转导功能
(一 )钠钾 ATP酶与 Src激酶 钠钾 ATP酶既
不属于离子通道受体 ,也不属于 G蛋白偶联受体和
酶偶联受体 ,那么它是如何把 EDLS的信号转导至
细胞内呢 ? 研究者观察到 ,在原代培养的犬血管平
滑肌细胞、大鼠血管平滑肌 A7 r5 细胞系、HeLa细胞
系、小鼠 L929细胞系和猪肾 LLC2PK1 近端小管细
胞系等多种细胞系中 ,在不改变细胞内离子浓度的
情况下 ,哇巴因都促进 Src激酶 418位酪氨酸磷酸
化 ,而对 529位酪氨酸无作用 ,从而激活 Src激酶。
而且在 LLC2PK1 细胞系 ,免疫沉淀钠钾 ATP酶 α1
亚基时 ,观察到哇巴因可剂量和时间依赖性增加 Src
激酶与钠钾 ATP酶信号复合物的结合 ;免疫沉淀
Src激酶时 ,则又观察到哇巴因可明显增加钠钾 ATP
酶α1 亚基与 Src激酶的共沉淀。谷氨酰胺转移酶
( Transglutam inase, GST) pull2down沉淀也显示 :在哇
巴因作用下 ,分离完整的钠钾 ATP酶与 GST2Src融
合蛋白的结合呈哇巴因剂量依赖性的增加 ,并且证
实 GST2Src融合蛋白是通过 Src的激酶结构域、SH2
和 SH3 结构域 ,与钠钾 ATP酶α1 亚基的 M4和 M5
跨膜区之间的中心大环结构域结合 [ 3 ]。这些实验
都说明不仅细胞内酪氨酸蛋白激酶 Src激酶能够和
钠钾 ATP酶直接发生相互作用 ,而且提示哇巴因与
钠钾 ATP酶结合后 ,可进一步促进 Src激酶与钠钾
ATP酶之间的相互作用 ,而且还可以磷酸化 Src的
418位酪氨酸 ,从而使 Src变构为激活构象。
进一步实验观察到 Src激酶化学性抑制剂 PP2
和除莠霉素 A (Herbimycin A )可去除哇巴因对大鼠
血管平滑肌细胞 A7 r5 细胞系 p42 /44丝裂原激活的
蛋白激酶 (m itogen2activated p rotein kinases, MAPK)
的激活 ,而且在等位缺失 Src家族基因的 SYF细胞
系 ,哇巴因不能激活 p42 /44 MAPK;相反 ,在转染 c2
Src的 SYF细胞系 ,哇巴因则能剂量依赖性的激活
p42 /44 MAPK。此外 , Src激酶化学性抑制剂可抑制
哇巴因但不可抑制上皮生长因子 ( ep idermal growth
factor, EGF)诱导的 Src激酶与上皮生长因子受体
( EGFR)胞内区的结合及酪氨酸磷酸化 EGFR,而在
等位缺失 Src家族基因的 SYF细胞系 ,哇巴因则不
能酪氨酸磷酸化 EGFR[ 4 ]。这些实验提示 :细胞内
酪氨酸蛋白激酶 Src家族成员对 EGFR的反式激活
( Transactivation)不仅参与胞内区缺少酪氨酸蛋白
激酶的受体转导信号 ,也参与钠钾 ATP酶转导哇巴
因的信号。
(二 )钠钾 ATP酶与膜穴 ( caveolae) 膜功能筏
( functional rafts)是膜脂双层内由鞘脂类和胆固醇
动态聚集而形成的具有一定功能的微区 (M i2
crodomain) ,这些区域比其他细胞膜部位更有秩序
且较少流动 ,并且微区内陷可形成囊泡。膜穴是膜
功能筏的一种特殊形式 ,由胆固醇、鞘脂 (糖化神经
鞘脂、神经鞘磷脂 )及蛋白质组成 ,其主要的结构蛋
白和标记蛋白是小窝蛋白 ( caveolin)。小窝蛋白是
一种膜整合蛋白 ,其氨基酸序列的 N端和 C端都位
于细胞质中 ,肽链中间由疏水性氨基酸 (102~134)
形成一个发夹样结构 ,将其锚定在细胞膜上。小窝
蛋白 N端 (82~101)的这一段氨基酸序列在细胞膜
内表面聚合形成支架结构 ( caveolin scaffolding do2
main, CSD) ,通过提供锚定位点可将多种信号分子
连接其上 ,故称之为脚手架功能区 ( scaffolding do2
main)。研究者观察到膜穴内富集了异三聚体 G蛋
白、G蛋白偶联受体、酪氨酸蛋白激酶受体、酶偶联
受体、蛋白激酶 C (p rotein kinase C, PKC)、细胞内酪
氨酸蛋白激酶 Src家族成员、中介蛋白 ( adap tor p ro2
tein)、MAPK途径组分、钙泵、肌醇 1 ’4 ’ 52三磷酸受
体、EGFR、胰岛素受体 ,以及生长因子等一系列与信
号转导密切相关的蛋白 ,而且这些信号分子通过小
窝蛋白结合基序 ( caveolin binding motif, CBM )与小
窝蛋白的 CSD相连接。因此有学者推测膜穴是具
有组装含有受体和相关信号转导蛋白的复合体的高
选择性区室化信号转导体 ( compartmentalizing signa2
losomes) [ 5 ]。
有趣的是 CBM保守存在于人钠钾 ATP酶α亚
基和β亚基蛋白质序列中。2001年 Takeyasu等对
人钠钾 ATP酶α1 亚基蛋白质序列的分析又发现 :
(1)人钠钾 ATP酶α1 亚基包含有两个 CBM ,其中
一个位于靠近 M1 跨膜区的胞质侧羧基端 ,另一个
位于 M10跨膜区的胞外区。而且钠钾 ATP酶种系发
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育的研究结果提示 :在进化过程中 M1 跨膜区的胞
质侧羧基端 CBM很早就出现 ,首先出现在线虫的钠
钾 ATP酶 ,并在果蝇开始保守存在 ; (2)更为重要的
是在进化中 CBM出现的时间与结合哇巴因的结构
域出现的时间非常相近 ; ( 3)同其他信号蛋白一样 ,
CBM远离的钠钾 ATP酶转运离子的活性功能域 ,这
提示钠钾 ATP酶与小窝蛋白的结合不影响它的离
子转运功能。
这些蛋白质序列的分析结果促使研究者开始探
讨膜穴是否参与钠钾 ATP酶组装信号转导的复合
体。L iu等用免疫荧光共聚焦成像观察到 ,在多种
细胞系的质膜上钠钾 ATP酶和小窝蛋白定位相同 ,
并且 W estern杂交检测小窝蛋白免疫沉淀复合物中
的蛋白 ,发现钠钾 ATP酶和 Src及 EGFR等信号转
导分子共同存在于膜穴中。给予哇巴因后 ,膜穴内
信号分子和钠钾 ATP酶均增加 ,在不同细胞系钠钾
ATP酶有选择地结合信号分子 [ 6 ]。W ang等还发现
在哇巴因作用下 ,钠钾 ATP酶和 Src与小窝蛋白的
结合增加的同时 ,小窝蛋白和 p42 /44 MAPK发生磷
酸化 ;而通过 RNA干扰小窝蛋白的表达或者去除膜
穴中的胆固醇 ,可以阻断哇巴因的上述作用 [ 7 ]。这
些实验都提示 ,哇巴因结合钠钾 ATP酶后可以招募
Src、EGFR进入膜穴 ,并组装信号转导的复合体转导
哇巴因信号。值得一提的是 ,晚近 M iyakawa2Naito
等在原代培养的大鼠肾近端小管细胞、胎猴肾 COS2
7细胞系和猪肾 LLC2PK1细胞系 ,用一种新的研究
蛋白质与蛋白质相互作用的方法 ———“荧光共振能
量转移测量法 ”( Fluorescent resonance energy transfer
measurement, FRET) ,还观察到在哇巴因的作用下 ,
钠钾 ATP酶和肌醇 1’4’52三磷酸受体的胞质内空间
位置的靠近 ,进一步证实了上述信号微区的可能性。
(三 ) 转导钠钾 ATP酶的下游信号及其效
应 早就有实验提示钠钾 ATP酶参与调控基因的
表达和细胞的生长。近几年来 ,随着细胞生物学和
分子生物学的进展 ,开始对钠钾 ATP酶参与基因表
达调控及调节细胞生长的信号转导机制给予关注并
进行了系统的研究。1992年 Nakagawa等在人黑色
素瘤 SKMEL228细胞系、Hela细胞系及 N IH 3T3细
胞系观察到 10 - 6 mol/L哇巴因可以诱导细胞 c2fos
和 c2jun的缓慢但持续的转录 ,并且通过基因突变
的方法证实了血清反应元件和转录起始点 123到
222之间的序列是哇巴因上述诱导作用所必需的。
随后 Golombe等 1994年又观察到在原代培养的大
鼠血管平滑肌细胞和大鼠血管平滑肌 A10细胞系 ,
哇巴因可以增强血清促细胞增殖和促进 c2fos及 c2
myc的转录。而且 A izman等 2001年用哇巴因作用
于原代培养的大鼠肾近端小管细胞 ,可诱发细胞内
钙离子振荡 ,核因子κB的转录增加。这些都提示
部分抑制钠钾 ATP酶剂量的哇巴因可诱导细胞表
达与细胞生长有关的转录因子。
鉴于在心肌肥大过程中有上述转录因子的激
活 , Xie及其同事选择细胞内氧化应激状态 ( reactive
oxygen species, ROS)、钙调蛋白激酶、PKC,以及在
心肌肥大过程中起重要中介作用的信号级联通路
Ras2中介蛋白 2p42 /p44丝裂原激活的 MAPK进行观
察 ,通过运用抗氧化剂、MAPK级联通路关键蛋白激
酶的化学性抑制剂和负显性突变失活体 (Dom inant
negative mutant) ,开始在原代培养的大鼠心肌细胞
做了哇巴因与钠钾 ATP酶结合后的信号转导过程
及相关效应的一系列研究工作。他们观察到 :哇巴
因可促进钠钾 ATP酶与细胞内 Src激酶结合 ,且激
活的 Src激酶 ,再反式激活 EGFR,后者可招募一系
列中介蛋白 (如 Shc和 Grb2 /Sos复合物 )并与它们
结合。随后 ,一方面可聚集小 G蛋白 Ras,最后激活
Raf/MEK/MAPK级联反应 ;另一方面又可通过激活
磷脂酶 C2γ,进而激活 PKC。这两条被哇巴因与钠
钾 ATP酶结合后激活的两条平行的信号通路单独
或者交互对话 (Cross talk) ,进一步通过产生 ROS和
改变胞内钙离子浓度 (产生钙波或钙振荡 )作为第
二信使 ,引起与细胞生长有关的早期反应基因 c2fos
和 c2jun的转录 ,还可伴有与心肌细胞肥大有关的
晚期反应基因 (骨骼肌肌动蛋白 1、心房肽、肌球蛋
白轻链 2和转化生长因子 2β)的表达增加及心肌细
胞内的蛋白合成增加 [ 8 ]。
(四 )钠钾 ATP酶参与信号转导的病理生理意
义
1. 心血管疾病 :如前所述 ,在大鼠心肌细胞哇巴
因可诱导与心肌肥大相关的早期和晚期基因表达 ,
而且还能增加细胞内蛋白的合成和线粒体的氧化应
激。Manunta等 1999年的一项临床横断面研究则
提示体内 EDLS浓度与高血压患者左心室的肥大程
度呈正相关。而且在多种血管平滑肌细胞系 ,哇巴
因及其它 EDLS可刺激细胞增殖。晚近的实验提
示 ,哇巴因在促进原代培养的人脐静脉内皮细胞增
殖的同时 ,还可刺激内皮细胞产生和释放内皮素增
加 [ 9 ]。Ferrari等 2003年还观察到每天 50μg/kg剂
量的哇巴因可造成大鼠高血压 ,而且新开发出哇巴
因拮抗剂 PST2338可降低大鼠高血压模型的血压。
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这些初步研究都提示哇巴因和钠钾 ATP酶结合后 ,
通过上述信号转导途径引发的效应可能与心肌的肥
大和高血压的发生有着密切关系。
2. 细胞凋亡及抗肿瘤 :在体外哇巴因与钠钾
ATP酶结合后 ,刺激正常心肌细胞、肾脏近端小管上
皮细胞、小脑颗粒细胞和血管及前列腺细胞增殖 ,并
能对抗凋亡诱导剂的诱导凋亡效应。但是高浓度的
哇巴因对于人前列腺癌 PC23细胞系则是表现为促
进细胞凋亡效应。初步的研究表明 :哇巴因在正常
细胞对抗凋亡诱导剂的诱导凋亡效应与肌醇三磷酸
激酶的活化有关 ;而在肿瘤细胞促进细胞凋亡效应
与增加细胞内氧化应激和激活半胱天冬蛋白酶 23
有关 [ 10 ]。但是 EDLS与凋亡的关系还存在争议 , Yu
等在 2003年指出 EDLS通过对钠钾 ATP酶的抑制 ,
打乱了细胞内钾离子的稳态 ,诱发细胞凋亡、坏死或
两者同时发生 ,而上述哇巴因的“抗凋亡效应 ”是由
于预处理 ( Pre2condition)的缘故。
三、问题与展望
根据现有的有关钠钾 ATP酶信号转导功能的
有关实验证据 , A llen等 [ 2 ]提出了有关钠钾 ATP酶
功能的新假说 :在细胞质膜分布着两种功能不同的
钠钾 ATP 酶 ———“反应 ( responsive ) 功能和调节
( regulatory)功能 ”的钠钾 ATP酶。前者负责离子的
转运 ,后者与小窝蛋白结合 ,在膜穴中与 Src、EGFR
等形成信号转导复合物 ,两种功能不同的钠钾 ATP
酶可通过某种机制 (可能是胞吞转运 )在质膜上相
互转变。但是 Hassen等参加 2002年第 10届“钠钾
ATP酶及相关离子泵 ”国际会议的部分学者认为 :
目前有关钠钾 ATP酶信号转导功能的部分研究中
所使用的哇巴因浓度 ,略高于体内能检测到 EDLS
浓度 ;而且至今有关钠钾 ATP酶信号转导功能的研
究也只是限于体外研究。因此他们还未认可钠钾
ATP酶的信号转导功能。但值得一提的是 : ( 1)由
于提取和纯化 EDLS的技术不同 ,不同研究人员检
测的体内 EDLS浓度存在差异 ; ( 2 ) Mohammadi等
2003年在离体鼠和豚鼠心脏的实验已表明 ,钠钾
ATP酶的离子泵功能和信号转导功能 (如激活 p42 /
44 MAPK和增加细胞内氧化应激 ) ,对于增加细胞
内钙离子浓度及增强心脏的收缩性都起到一定的作
用。总之 ,进一步研究 EDLS与钠钾 ATP酶结合后
激活的信号转导通路将有助于明确它在病理生理条
件下的重要性 ,有可能为治疗高血压和肿瘤提供新
思路 ,并深化对细胞内信号转导机制的认识。
参 考 文 献
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